Jednostanična transkriptomija otkriva poremećene interakcije stanica-stanica bubrežnog filtra nakon rane i selektivne ozljede podocita

Rezultati

Single-Cell Profiling of >29,000 Bubrežne stanice obogaćene glomerularom

Trenutačni jednoćelijski protokoli zacijeli bubreg identificirati<2.5% glomerular cells,9 and although a pročišćeni glomerularni pripravakkorištenje magnetskih kuglica obogaćuje ovu populaciju,22 ne uspijeva uhvatiti druge stanicevrste bubregato bi moglo biti od interesa. Metoda prosijavanja korištena je za istovremeno obogaćivanje glomerula i hvatanje dodatnih vrsta bubrežnih stanica kako bi se proširili ovi nalazi i razvilo detaljno razumijevanje međustaničnih interakcija unutar glomerula u kontekstu cjelokupnog staničnog krajolika bubrega, prije i nakon ozljede podocita.

Kako bi se identificirali rani transkripcijski učinci ablacije podocita na način specifičan za tip stanice, scRNAseq je izveden stkivo bubregaiz WT i iCTCFpod/miševa prikupljenih serijskim prosijavanjem nakon 1 tjedna liječenja doksiciklinom (Slika 1A). Bubrežno tkivo četiri WT životinje (četiri biološka ponavljanja) i četiri iCTCFpod / životinje dalo je ukupno 14 783 WT i 14 727 iCTCFpod / stanica profiliranih nakon filtriranja (dodatna slika S1, A i B; dopunske tablice S1 i S2). Podaci su normalizirani kako bi se uklonili učinci zbog broja UMI-ja i postotka mitohondrijskih očitanja. Nakon integracije WT i iCTCFpod / uzoraka, korištena je klasterizacija niske razlučivosti za otkrivanje devet klastera (Slika 1B). Biološki replikati WT i iCTCFpod/uzorci raspoređeni su među svim klasterima (dodatna slika S2, AC). Sve vrste stanica glomerula, kao i dodatne vrste stanica bubrega, identificirane su korištenjem utvrđenih i podataka izvedenih markera (Slika 1C; Dopunska tablica S3; Dopunska slika S3A).

Glomerularne stanice, koje predstavljaju ukupno 82,1% svih oporavljenih stanica [36,9% podocita, 42,1% glomerularnih endotelnih stanica (GEC), 2,7% mezangijalnih stanica i 0.36% PEC] izolirane su i ponovno grupirane (Slika 1D) . Identificirana su četiri klastera podocita, pet klastera GEC-a i po jedan klaster mezangijalnih stanica i PEC-a, koji izražavaju kanonske markere staničnog tipa (Slika 1E; Dodatna slika S3B). Biološki replikati WT i iCTCFpod/uzorci raspoređeni su po svim klasterima (dodatna slika S2, DF; dopunska tablica S4). Kao što se i očekivalo, s obzirom da delecija CTCF-a specifična za podocite dovodi do histološki detektabilnog gubitka podocita nakon 2 tjedna,13 iCTCFpod/uzorci sadržavali su niži postotak podocita od WT uzoraka (Slika 1F; Dodatna tablica S5). iCTCFpod / uzorci imali su 13,1% manje podo-cita, 11,9% više GEC-ova i 1,5% više mezangijalnih stanica od WT uzoraka (dodatna tablica S5). PECs contribu uted<1% to either of the iCTCFpod / or WT samples. This finding suggests that disruption of transcriptional programs critical for podocyte survival precedes histologically detectable podocyte injury and loss and highlights the power of scRNAseq in discerning subtle changes that can be missed by histologic analysis.

NOVE BILJE ZA ZDRAVLJE BUBREGA

Podocit-specifična inducibilna CTCF delecija dovodi do promjena ekspresije gena u svim tipovima glomerularnih stanica

Analiza diferencijalne ekspresije provedena je u svakom od 11 klastera uspoređujući iCTCFpod / i WT stanice (dodatna tablica S6). Smatralo se da su geni različito izraženi ako su pronađeni u najmanje 10% stanica u određenom klasteru, s minimalnom apsolutnom logaritamskom promjenom puta od 0.1 i prilagođenim P < 0. 05. Ctcf je različito izražen u svakoj od četiri skupine podocita, sa srednjim logaritamskim promjenama nabora od 0.390, 0,189, 0,331, odnosno 0,303. Broj stanica u svakom klasteru je smanjen i analiza diferencijalne ekspresije je ponovljena da se usporedi broj različito izraženih gena među 11 klastera. Skupine podocita imale su najrazličitije izražene gene, a zatim GEC-1 i GEC-2 (Slika 1G). Preostala tri klastera GEC-a, zajedno s mezangijskim stanicama i PEC-ovima, imala su mnogo manje različito eksprimiranih gena (Slika 1G), što sugerira da su GEC-1 i GEC-2, među svim glomerularnim klasterima, bili najviše pogođeni posljedicama ozljede podocita uzrokovane delecijom CTCF-a.

Genski programi povezani s bolešću identificirani u specifičnim klasterima podocita i endotelnih stanica

Ovo je istraživanje prvo nastojalo ispitati kako pojedinačne skupine podocita reagiraju na ozljedu. Vennov dijagram različito izraženih gena u svakoj od četiri skupine podocita otkrio je da podocit 1 ima najunikatnije diferencijalno izražene gene od četiri skupine podocita (Slika 2A; Dodatna tablica S7). Opažanje da je jedan od četiri klastera podocita bio izraženije zahvaćen u skladu je s prethodnim histološkim podacima koji pokazuju da nisu svi podociti jednako ozbiljno pogođeni u slučaju ozljede i naglašava moć scRNAseqa da molekularno karakterizira heterogenost staničnih stanja unutar isti tip stanice.23

Provedena je analiza prekomjerne zastupljenosti kako bi se identificirali programi gena obogaćeni kao posljedica gubitka CTCF-a u klasteru podocita 1 (dodatna tablica S8). Vrhunski obogaćeni termini vizualizirani su s mapom obogaćenja kako bi se skupili skupovi gena koji se međusobno preklapaju (Slika 2B). Istaknuta skupina obogaćenih pojmova bile su funkcije mitohondrija, uključujući sintezu ATP-a, organizaciju mitohondrija, transportni lanac elektrona i oksidativnu fosforilaciju (Slika 2B). Ovi podaci proširuju nedavni rad koji ukazuje na disfunkciju mitohondrija kao znak ozljede podocita.24 Osim toga, ljudska genetika je ukazala na važnost mitohondrijskih funkcija u podocitima, uključujući nekoliko mutacija u putu biosinteze CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, i ADCK4) koji uzrokuju nefrotski sindrom, uglavnom u djece.25,26 Stoga je pretpostavljeno da disfunkcija mitohondrija podocita može predstavljati istaknuto stanično stanje povezano sa svim bolestima koje proizlaze iz gubitka podocita.24 Podaci podupiru ovu ideju u jednom -rezolucija stanica, što sugerira da disfunkcija mitohondrija može predstavljati najranije stanje ozljede u specifičnoj populaciji podocita, što dovodi do gubitka podocita.

Provedena je analiza prekomjerne zastupljenosti kako bi se identificirali programi gena obogaćeni kao posljedica gubitka CTCF-a u klasteru podocita 1 (dodatna tablica S8). Vrhunski obogaćeni termini vizualizirani su s mapom obogaćenja kako bi se skupili skupovi gena koji se međusobno preklapaju (Slika 2B). Istaknuta skupina obogaćenih pojmova bile su funkcije mitohondrija, uključujući sintezu ATP-a, organizaciju mitohondrija, transportni lanac elektrona i oksidativnu fosforilaciju (Slika 2B). Ovi podaci proširuju nedavni rad koji ukazuje na disfunkciju mitohondrija kao znak ozljede podocita.24 Osim toga, ljudska genetika je ukazala na važnost mitohondrijskih funkcija u podocitima, uključujući nekoliko mutacija u putu biosinteze CoQ (PDSS1, PDSS2, COQ2, COQ6, i ADCK4) koji uzrokuju nefrotski sindrom, uglavnom u djece.25,26 Stoga je pretpostavljeno da disfunkcija mitohondrija podocita može predstavljati istaknuto stanično stanje povezano sa svim bolestima koje proizlaze iz gubitka podocita.24 Podaci podupiru ovu ideju u jednom -rezolucija stanica, što sugerira da disfunkcija mitohondrija može predstavljati najranije stanje ozljede u specifičnoj populaciji podocita, što dovodi do gubitka podocita.

Jedna od glavnih skupina obogaćenih izraza iz analize prezastupljenosti (Slika 2B) bila je organizacija citoskeleta, kao i srodni pojedinačni obogaćeni izraz za adheziju stanične matrice. Aktinski citoskelet igra ključnu ulogu u održavanju jedinstvene i složene strukture podocita, a prianjanje na GBM ključno je za funkciju podocita.27 Zrele žarišne priraslice sadrže stotine proteina koji povezuju aktinski citoskelet, vezanje na matriks receptora, unutarstaničnu transdukciju signala i polimerizacija aktina. Jedan od gena s najnižom regulacijom u podocitu 1 bio je Rhpn1 (dopunska slika S4A), bitna komponenta za uspostavljanje dinamike citoskeleta podocita i održavanje strukture procesa stopala podocita.28 Komponenta Arp2/3 kompleksa Arpc3, pokretač polimerizacije aktina, je bio reguliran u klasteru podocita 1 (Slika 2C; Dodatna slika S4B). Gen za dodatnu komponentu kompleksa, Actr2, također je bio pojačano reguliran u podocitu 1 i podocitu 4. Osim toga, Wasl, čiji proteinski produkt, N-WASP, aktivira kompleks Arp2/3 i potreban je za održavanje procesa podocitnog stopala in vivo29, također je bio reguliran prema gore u podocitu 1, podocitu 3 i podocitu 4. Citoskeletni regulator Arhgdia, čija je delecija povezana s nefrotskim sindromom u miševa,30 bio je reguliran prema dolje u podocitu 1 (Slika 2C). Razine ekspresije dviju Rho GTPaza

Slika 3 Klaster podocita pojačava Col4a5. O: Col4a5 je značajno pojačano reguliran u stanicama podocita 1 inducibilne delecije specifične za podocite (iCTCFpod / ) u usporedbi sa stanicama podocita 1 divljeg tipa (WT). Receptori kolagena tipa IV ɑ5 (COL4A5) snažno su eksprimirani u mezangijskim stanicama i subklasterima glomerularnih endotelnih stanica (GEC) 1 do 4. Veličina vrha strelice predstavlja relativnu ekspresiju receptora. B: Kvantifikacija lančane reakcije hibridizacije (HCR). Col4a5 je značajno pojačan u stanicama s ekspresijom iCTCFpod / Nphs2-u usporedbi sa stanicama s ekspresijom WT Nphs{{20}}. Procijenjena su četiri WT i četiri iCTCFpod miša. Kvantificirani su svi glomeruli iz tri slike. C: Ekspresija Col4a5 u glomerulima WT i iCTCFpod / životinja prema procjeni HCR-om. *P < 0,0001 (dvostrani t-test s Welchovom korekcijom). Izvorno povećanje, 40; 63 (povećanja uokvirenih područja) (C). Mjerne trake Z 50 mm (C). IFI, imunofluorescentno oslikavanje.

GEC-1 and GEC-2 had nearly as many differentially expressed genes as podocyte clusters 2 to 4, whereas the remaining GEC clusters, mesangial cells, and PECs had fewer differentially expressed genes. Therefore, these two endothelial clusters were most affected by podocyte injury. GEC-1 expressed >600 jedinstveno različito izraženih gena (dodatna slika S6A; dopunska tablica S9). Analiza prekomjerne zastupljenosti pokazala je da su jedinstveno različito izraženi geni u GEC-1 obogaćeni genskim programima za migraciju i adheziju stanica (dodatna slika S6, B i C; dopunska tablica S10). Ove su analize otkrile najranije transkripcijske promjene koje se javljaju u GEC-ima kao odgovor na ozljedu podocita.

Modeliranje međustanične komunikacije otkriva ključne interakcije između tipova stanica kao odgovor na ranu ozljedu podocita

Nakon što je identificirala poremećene genske programe u nekoliko različitih staničnih klastera, studija je zatim nastojala razumjeti kako je oštećenje podocita utjecalo na preslušavanje glomerularnih stanica i stanica. Studija je prvo ispitivala popis različito izraženih gena u podocitima, GEC-u i klasterima mezangijalnih stanica. Ekspresija dvaju ključnih autokrinih liganda za preživljavanje, Vegfa i Pdgfb, kao i ekspresija PDGFB receptora, Pdgfrb, bili su poremećeni (dodatna tablica S6). Ekspresija Vegfa bila je smanjena u svim klasterima podocita (srednja promjena log folda između 0.034 i 0.149). Nasuprot tome, ekspresija Pdgfb bila je povećana u svim GEC klasterima (srednja logaritamska promjena nabora između 0.031 i 0,140), a receptor Pdgfrb je bio reguliran prema gore u mezangijskim stanicama (srednja logaritamska promjena nabora 0,155). Ova analiza je pokazala da ozljeda podocita dovodi do smanjene ekspresije prosurvival liganda Vegfa, negativno utječući na GEC. Kako bi to kompenzirali, GEC-ovi mogu pojačati regulaciju prosurvival liganda Pdgfb, pokrećući mezangijske stanice da pojačano reguliraju receptor Pdgfrb.

NicheNet, novi algoritam koji zaključuje kako interakcije receptora liganda izvedene iz podataka o ekspresiji mogu utjecati na specifične mete integriranjem već postojećeg znanja o signalnim i regulatornim mrežama, korišten je za dublje istraživanje interakcija ligand-receptor i njihovih pretpostavljenih ciljnih gena.20 NicheNet je primijenjen na model interakcija između podocita i GEC-a, kao i mezangijalnih stanica i GEC-a koji bi potencijalno mogli inducirati različito izražene gene (ciljni geni) u GEC-u u uvjetima ozljede podocita (Slika 4A). Za ovu analizu, svi klasteri svake vrste stanica kombinirani su u jedan klaster. Najbolji predviđeni ligandi koje eksprimiraju mezangijske stanice i/ili podociti bili su pleiotrofin (Ptn), angiopoetin 2 (Angpt2), Col4a1, molekula adhezije vaskularnih stanica 1, koštani morfogenetski protein 4 (Bmp4), Ephrin B1, faktor rasta vezivnog tkiva i semaforiranje 3e (Sema3e) (Slika 4B). Obrazac ekspresije GEC receptora preko kojih je poznato da ti ligandi djeluju mapiran je pored analize aktivnosti liganda. Osim toga, mapirani su i predviđeni ciljni geni koji su različito izraženi u iCTCFpod/GEC u usporedbi s WT kontrolama. Rezultati na slici 4B sažeti su kao kružni dijagrami na slici 4, C i D.

U ovoj analizi vidljivo je nekoliko liganada, receptora i ciljnih gena. Plejotrofin, ligand koji je visoko izražen u mezangijskim stanicama (Slika 4B), izlučeni je faktor rasta koji može vezati i inhibirati receptor proteinske tirozin fosfataze tipa B, stimulirajući migraciju endotelnih stanica preko povećanog Tek (Tie2)/Angpt137 i Kdr (Vegfr2)/Vegfa38 signalizacija. Sukladno tome, Tek je bio značajno pojačano reguliran u GEC-ovima (Slika 4B). Angpt2, visoko izražen u mezangijskim stanicama, antagonistički je ligand Tek-a, koji inhibira vezanje Angpt1.39 Budući da je poznato da signalizacija Angpt1 potiče preživljavanje podocita, a poremećaj omjera Angpt1/Angpt2 doprinosi razvoju DKD-a,40 ovaj ligand Čini se da analiza receptora ukazuje na maladaptivno Tek signaliziranje u GEC-ovima kao jednu od najranijih posljedica ozljede podocita

Ova je studija također otkrila značajne promjene u ekspresiji kolagena tipa IV u nekoliko glomerularnih stanica (Slika 4B). Normalno proizvedeni od strane zdravih podocita, heterotrimeri kolagena IV prelaze iz ɑ1ɑ1ɑ2 u ɑ3ɑ4ɑ5 tijekom razvoja glomerula, što je neophodno za pravilnu formaciju i funkciju GBM.33,34 Povećanje Col4a1, zajedno s ekspanzijom mezangijskog matriksa, često se opaža u DKD.41,42 U trenutnoj analizi, Col4a1 su eksprimirali i mezangijske stanice i GEC (srednja ekspresija toplinske karte liganda) (Slika 4B) i bio je posebno pojačan u iCTCFpod/GEC u usporedbi s WT kontrolama. Ovi podaci sugeriraju da GEC pojačavaju Col4a1 u uvjetima ozljede podocita, što može dovesti do čvršćeg, fibrotičnog GBM-a koji pridonosi razvoju segmentalne skleroze.33

Bmp4 je bio visoko eksprimirani mezangijski ligand identificiran NicheNet analizom (Slika 4, BD). BMP igraju ključnu ulogu u razvoju bubrega i bolesti.43 Bmp4 je pojačano reguliran u uvjetima dijabetičke nefropatije u štakora,42 a liječenje miševa s dijabetesom s anti-BMP4 protutijelima sprječava pojačanu regulaciju Col4a1 i širenje mezangijalnog matriksa .44 Od posebnog interesa, utvrđeno je da mezangijski Bmp4 pokreće ekspresiju GEC Smad6 (Slika 4B). Ekspresiju Smad6 induciraju BMP i u petlji negativne povratne sprege, Smad6 specifično inhibira BMP, uključujući BMP4.45 Smad6 je smanjen u iCTCFpod / GEC u usporedbi s kontrolama WT, što ukazuje na povećanu BMP signalizaciju u endotelnim stanicama u okruženju ozljede podocita. .

Jedan od prioritetnih liganada identificiranih u podocitima bio je Sema3e (Slika 4, BD). Semaforini klase 3 su izlučeni proteini koji funkcioniraju u raznim biološkim procesima, uključujući angiogenezu, limfangiogenezu i bolesti.46 Sema3a je pojačano reguliran u ljudskom DKD-u,47 a Sema3g je nedavno identificiran kao gen specifičan za podocite koji štiti podocite od upale in vivo. 48 Uloga Sema3e u podocitu ostaje nejasna. Trenutna analiza otkrila je prethodno neprepoznati par receptor-ligand pri čemu podocit Sema3e stupa u interakciju s pleksinomD1 na GEC-ovima kako bi pokrenuo nekoliko nizvodno genskih ciljeva u okruženju ozljede podocita (Slika 4, C i D).

Među nekoliko novoidentificiranih GEC ciljnih gena, Hes1 i Cx3cl1 također su pronađeni u programima adhezijskih gena obogaćenih GEC-1 (Slika 4, BD; Dodatna slika S6). Hes1 je meta Notch signalizacije, koja igra važnu ulogu u razvoju bubrega, ali reaktivacija može dovesti do fibroze.49 Cx3cl1 je kemokin koji uglavnom proizvodi glomerularni endotel koji djeluje kao kemoatraktant i adhezijska molekula za svoj receptor, Cx3cr1, koji je sveprisutno izražen na mononuklearnim i cirkulacijskim limfnim leukocitima.50 Cx3cl1 je uključen urazne bolesti bubrega, uključujućiDKD, IgA nefropatija i glomerulonefritis.50 Hes1 i Cx3cl1 bili su pojačano regulirani u iCTCFpod/GEC u usporedbi s WT kontrolama, što sugerira da GEC reagiraju na ozljedu podocita pojačanom regulacijom proupalnih i profibroznih programa.

Konačno, budući da su mnogi ligandi i ciljevi identificirani u NicheNet analizi uključeni u DKD, kako u modelima glodavaca tako i kod ljudi, skup podataka uspoređen je s transkriptomskim skupom podataka jedne jezgre ranog ljudskog DKD-a.10 Specifičan napravljena je usporedba različito izraženih gena između klastera ljudskih i mišjih stanica. Od 138 različito izraženih gena u ljudskim DKD GEC-ovima, 25 gena također je identificirano u mišjim iCTCFpod/endotelnim stanicama, uključujući Col4a1 (dodatna slika S7; dopunska tablica S11). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju da se programi endotelnih stanica koji su često poremećeni kod humane DKD mogu djelomično rekapitulirati u mišjem modelu rane glomerularne ozljede selektivnom ablacijom podocita. Osim toga, ovi rezultati sugeriraju da, uz podocite, mogu postojati potencijalni endotelni specifični ciljevi i terapijske strategije za zaustavljanje ili usporavanje napredovanja složenih i visokoprevalentne bolesti bubrega, kao što jeDKD.