Sažetak

Depresija je globalno vrlo raširen i onesposobljavajući psihijatrijski poremećaj. Sve više dokaza pokazuje da pretjerana neuroupalna aktivacija unutar hipokampusa znatno pridonosi pojavi i napredovanju simptoma depresije. Cistanche feniletanol glikozidi (CPhGs), glavni bioaktivni sastojci ekstrahirani iz tradicionalnog jestivog ljekovitog biljaCistanche deserticolaiCistanche tubulosa, pokazali su višestruka neuroprotektivna farmakološka svojstva u prethodnim studijama. Ovo sadašnje istraživanje imalo je za cilj istražiti terapeutske učinke i molekularne mehanizme koje CPhGs vrše na fenotipove ponašanja slične depresiji izazvane kroničnim nepredvidivim blagim stresom (CUMS) kod C57BL/6 miševa.

Šezdeset C57BL/6 miševa SPF stupnja nasumično je podijeljeno u šest eksperimentalnih kohorti: kontrolna skupina, skupina CUMS modela, skupina s visokim dozama CPhGs (700 mg/kg), skupina s srednjim dozama CPhGs (350 mg/kg), skupina s niskim dozama CPhGs (175 mg/kg) i pozitivna kontrola skupina fluoksetina (15 mg/kg). Nakon četverotjedne intervencije sondiranjem lijeka nakon CUMS modeliranja, provedene su sveobuhvatne neurobihevioralne procjene uključujući test preferiranja saharoze (SPT), test otvorenog polja (OFT), test ovjesa repa (TST) i test prisilnog plivanja (FST). Kompleti enzimski imunoanalize (ELISA) kvantificiraju koncentracije monoaminskih neurotransmitera u serumu, uz hipokampalne proupalne citokine i upalne medijatore. Bojanje hematoksilin-eozinom (HE) i bojenje po Nisslu vizualiziralo je patološke ozljede neurona unutar regija hipokampalnog nazubljenog girusa. Imunohistokemija je detektirala intenzitet ekspresije glijalnog fibrilarnog kiselog proteina (GFAP), ionizirane adaptorske molekule-1 koja veže kalcij (Iba-1), NLRP3 i proteina kaspaze-1. Imunofluorescentno bojenje dodatno je procijenilo status aktivacije uzvodne TLR4/NF‑κB signalne kaskade.

Naši eksperimentalni rezultati pokazali su da je oralna primjena CPhG-a značajno ublažila abnormalnosti u ponašanju povezane s depresijom. CPhG su povećali postotak preferiranja saharoze i smanjili trajanje nepokretnosti u paradigmama ponašanja temeljenim na očaju. Štoviše, liječenje CPhG-ima obnovilo je osiromašene razine serotonina u serumu i hipokampusu (5‑HT), kao i dopamina (DA). Biokemijska detekcija otkrila je značajnu supresiju hipokampalnih proupalnih medijatora i prekomjerne proizvodnje citokina. Histopatološka promatranja ilustrirala su olakšanje hipokampalnog neurona izazvanog CUMS-om ovisno o dozi. Imunohistokemijski rezultati pokazali su da CPhG povećavaju gustoću astrocita obilježenu GFAP-om, inhibiraju patološku hiper-aktivaciju Iba-1-pozitivne mikroglije i smanjuju obilje proteina povezanog s inflamasomom NLRP3. Imunofluorescentni testovi potvrdili su da CPhGs obuzdavaju prekomjernu TLR4 i fosforiliranu aktivaciju NF‑κB p65 unutar hipokampalnog tkiva.

Zajedno, ovi nalazi potvrđuju da CPhGs pokazuju istaknutu učinkovitost sličnu antidepresivima protiv manifestacija sličnih depresiji stimuliranih CUMS-om kod miševa. Njegov farmakološki mehanizam djelomično je posredovan dvostrukim regulatornim funkcijama: obnavljanjem homeostaze monoaminskog neurotransmitera i obuzdavanjem neuroupalnih odgovora posredovanih signalnom osi TLR4/NF‑κB/NLRP3. Ova studija na životinjama predstavlja pretkliničku eksperimentalnu osnovu koja podupire daljnju eksploataciju CPhG-a kao obećavajućih prirodnih agenasa kandidata ili funkcionalnih sastojaka hrane za pomoćnu intervenciju protiv depresije.

Ključne riječi: Cistanche phenylethanol glicosides (CPhGs); depresija; kronični nepredvidivi blagi stres; neuroinflamacija; astrociti; mikroglija; TLR4/NF‑κB/NLRP3 inflamasomski put

1. Uvod

Depresija je višestruka afektivna psihijatrijska bolest koju karakteriziraju ključne kliničke manifestacije koje uključuju trajno loše raspoloženje, anhedoniju, psihomotornu retardaciju, poremećaj spavanja i budnosti i somatsku disfunkciju. Teške depresivne epizode potencijalno dovode do samoozljeđivanja i suicidalnih ideja, namećući ogromno opterećenje javnom zdravstvu diljem svijeta. Podaci epidemiološkog istraživanja iz Kine pokazuju da nacionalna prevalencija depresije doseže 2,1 %, a Svjetska zdravstvena organizacija klasificirala je veliki depresivni poremećaj među najbolje rangiranim bolestima koje doprinose globalnom gubitku godina života prilagođenom invalidnosti.

Unatoč tome, potpuna molekularna etiologija koja leži u osnovi patogeneze depresije ostaje nepotpuno razjašnjena, što otežava savršena klinička terapeutska rješenja. Suvremene patofiziološke hipoteze pomaknule su fokus prema neuro-imunim mehanizmima preslušavanja. Akumulirana pretklinička i klinička istraživanja naglašavaju trajnu neuroinflamaciju kao vitalni patogeni pokretač depresivnih poremećaja. Pod kroničnim psihološkim ili fiziološkim izazovima stresa, populacije glijalnih stanica hipokampusa prolaze kroz abnormalnu aktivaciju. Pretjerano aktivirana mikroglija i disfunkcionalni astrociti pokreću snažno otpuštanje višestrukih proupalnih medijatora, stvarajući učinke pojačanja kaskade proupalnih citokina. Takvi neuroupalni inzulti dodatno potiču morfološko propadanje neurona, poremećaj metabolizma neurotransmitera i oštećenje sinaptičke plastičnosti, što u konačnici olakšava patološko napredovanje nalik depresiji.

Trenutačne glavne kliničke intervencije s antidepresivima pretežno se oslanjaju na sintetske kemijske antidepresive koje predstavlja fluoksetin, selektivni inhibitor ponovne pohrane serotonina (SSRI). Unatoč djelomičnom ublažavanju simptoma za određene pacijente, sintetski antidepresivi imaju dobro poznate nedostatke: nezadovoljavajući omjeri potpune remisije, česti rezidualni depresivni simptomi, velika vjerojatnost recidiva nakon prekida uzimanja lijeka, plus štetne gastrointestinalne, jetrene i metaboličke nuspojave tijekom dugotrajne primjene. Nasuprot tome, tradicionalni biljni lijekovi imaju multi-target modulator karakteristike i relativno blage sigurnosne profile, stoga privlače sve veći istraživački interes za adjuvantnu terapiju poremećaja raspoloženja.

Cistanche deserticolaiCistanche tubulosa, obično nazvan "pustinjski ginseng", pripada obitelji Orobanchaceae. Njihove mesnate stabljike služe kao klasične homologne ljekovito-prehrambene sirovine u tradicionalnoj azijskoj biljnoj praksi. Suvremena farmakološka istraživanja dokumentiraju višestruku neuroprotektivnu bioaktivnost zaCistancheekstrakti, uključujući anti-neurodegenerativne učinke protiv Alzheimerove bolesti i Parkinsonove bolesti. Feniletanol glikozidi čine glavne bioaktivne frakcije unutarCistancheekstrakti, koji uglavnom sadrže ehinakozid i verbaskozid. Cistanche feniletanol glikozidi (CPhG) pokazuju antitumorsku, antioksidacijsku, imunomodulatornu i neurozaštitnu bioaktivnost na više eksperimentalnih platformi.

Prethodni preliminarni laboratorijski rad pokazao je da CPhG mogu povisiti koncentraciju dopamina u strijatu i ublažiti depresivne fenotipove povezane s menopauzom u životinjskim modelima glodavaca. Međutim, proizvodi li CPhG zaštitne utjecaje na depresiju izazvanu kroničnim stresom i detaljnim kaskadama prijenosa signala koje posreduju u takvim bioaktivnostima još uvijek nedostaje sustavno istraživanje. Paradigma kroničnog nepredvidivog blagog stresa (CUMS) kod životinja predstavlja jedan od dobro utvrđenih modela predkliničke depresije. Izlažući laboratorijske glodavce različitim nasumičnim blagim stresorima tijekom uzastopnih tjedana, CUMS pouzdano rekapitulira temeljna obilježja depresije kao što su anhedonija, očaj u ponašanju i neuropatološka oštećenja hipokampusa.

U skladu s tim, ovo je istraživanje konstruiralo CUMS-inducirani mišji depresivni model za sustavnu procjenu in-vivo potencije tri gradijenta doziranja CPhG-ova slične antidepresivima. Posebno smo se usredotočili na oporavak monoaminskih neurotransmitera, fenotipsku transformaciju hipokampalnih glijalnih stanica i NLRP3 inflammasomski neuroupalni put kojim upravlja TLR4/NF‑κB. Ova studija namjerava pružiti objektivne eksperimentalne dokaze koji će podržati budući farmaceutski razvoj i funkcionalnu primjenu CPhG-ova u hrani za poboljšanje simptoma depresije.

2. Materijali i metode

2.1 Eksperimentalni materijali, reagensi i instrumenti

Standardizirani sirovi ekstrakt CPhGs nabavljen je od Hotan Dichen Pharmaceutical Biological Co., Ltd (serija br. . 20231221, Xinjiang, Kina). Ukupni sadržaj feniletanol glikozida veći ili jednak 85 %, sadrži ehinakozid veći ili jednak 40 % i verbaskozid veći ili jednak 16 %. Kapsule fluoksetin hidroklorida nabavljene su od Patheon France. Komercijalni setovi ELISA testa za 5-HT, DA, iNOS, COX-2, PGE2, TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN- nabavljeni su od kvalificiranih dobavljača bioloških reagensa. Primarna protutijela primijenjena za imunohistokemiju i imunofluorescenciju uključivala su anti-GFAP, anti-Iba-1, anti-NLRP3, anti-Caspase-1, anti-TLR4 i anti-fosfo-NF-κB p65 protutijela. Kompleti za histološko bojenje za HE i Nissl bojenje pripremljeni su za parafinsku obradu isječka mozga.

Ključni laboratorijski analitički instrumenti pokrivali su visokopreciznu elektroničku analitičku vagu, radnu stanicu za pročišćavanje ultračiste vode Milli‑Q, čitač mikropločica SpectraMax s više načina rada, uspravni fluorescentni mikroskop Leica, plus kompletan hardver za analizu ponašanja glodavaca i softverski sustav za praćenje kretanja SMART 3.0.

Šezdeset mužjaka C57BL/6 miševa SPF stupnja, starih sedam tjedana s početnim rasponom tjelesne težine 18-22 g, kupljeni su od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. Sve eksperimentalne manipulacije s miševima dobile su službeno etičko odobrenje Odbora za etiku životinja Kineskog sveučilišta Shaanxi (etičko odobrenje ID: SUCMDL20231015003). Miševi su bili smješteni unutar objekata za držanje životinja slobodnih od specifičnih patogena. Parametri okoliša održavani su na temperaturi okoline (21 ± 2) stupnja, relativnoj vlažnosti 60 % ± 10 %, primjenom standardnih 12-satnih ciklusa osvjetljenja svjetlo-mrak. Hrana za glodavce i voda za piće bili su dostupni ad libitum. Jednotjedno razdoblje adaptivne aklimatizacije provedeno je prije pokretanja formalnih eksperimentalnih tijekova rada.

2.2 Grupiranje životinja, CUMS modeliranje i administracija lijekova

Nakon jednotjednog adaptivnog uzgoja, preliminarni probir sklonosti saharozi isključio je pojedinačne miševe s inherentnom sklonošću malom konzumiranju šećera. Kvalificirani pokusni miševi randomizirani su u šest ispitivanih skupina (n = 10 životinja u svakoj skupini):

Kontrolna skupina (Con): bez CUMS stresa, intragastrična primjena izovolumetrijske deionizirane vode;

Skupina CUMS modela (Mod): primanje pune CUMS stimulacije, gavaža s deioniziranom vodom jednakog volumena;

Skupina visokih doza CPhGs (CPhGs-H): izloženost CUMS-u, CPhGs 700 mg/kg tjelesne težine dnevnom sondom;

Skupina CPhGs sa srednjom dozom (CPhGs-M): izloženost CUMS-u, CPhGs 350 mg/kg dnevnom sondom;

Skupina s niskim dozama CPhGs (CPhGs‑L): izloženost CUMS-u, CPhGs 175 mg/kg dnevnom sondom;

Pozitivna kontrolna skupina fluoksetina (FLX): izloženost CUMS-u, fluoksetin 15 mg/kg sonda jednom dnevno.

Za konstrukciju CUMS modela usvojeno je deset različitih vrsta blagih stresora: fizičko obuzdavanje (60 min), horizontalno mućkanje (60 min), ovjes repa (60 min), kavez nagnut pod kutom od 45 stupnjeva (24 h), vlažna posteljina (24 h), izolacija praznog kaveza (24 h), noćno osvjetljenje svjetlom (12 h), plivanje u toploj vodi na 41 stupanj u trajanju od 5 minuta, plivanje u hladnoj vodi na 4 stupnja u trajanju od 5 minuta i stimulacija štipaljkom za rep u trajanju od 2 minute. Dva različita stresora primjenjivana su nasumično svaki dan; identičan stresor se ne bi pojavio uzastopno dva susjedna dana. Postupak CUMS modeliranja trajao je četiri tjedna.

Po završetku četverotjednog modeliranja stresa, odgovarajuće ispitivane tvari ili nosač otapala su intragastrično isporučeni jednom dnevno tijekom sljedeća neprekidna četiri tjedna. U osmom eksperimentalnom tjednu svi projekti neurobihevioralne detekcije su implementirani uzastopno.

2.3 Baterija neuro-bihevioralnih testova

2.3.1 Test preferiranja saharoze (SPT)

Test preferiranja saharoze procjenjuje temeljni depresivni fenotip sličan anhedoniji u glodavaca. Prije formalnog mjerenja, svaki miš je zasebno smješten. Provedena je trodnevna faza prilagodbe na piće od saharoze. Prvi dan: dvije boce 1 % otopine saharoze stavljene u svaki kavez na 24 sata. Drugi dan: jedna boca s otopinom saharoze u kombinaciji s jednom bocom s pročišćenom vodom. Treći dan: zamijenite položaj spremnika za šećernu vodu i čistu vodu kako biste uklonili utjecaj pristranosti lokacije. Nakon ciklusa prilagodbe, miševi nisu hranili hranu i vodu 24 sata. Nakon toga su dostavljene prethodno izvagane boce s vodom s 1 % saharoze i boce s pročišćenom vodom. Položaji boca su zamijenjeni nakon 12 h. Nakon ukupnog trajanja testiranja od 24 sata, težina preostale tekućine obiju boca je točno zabilježena. Stopa preferiranja saharoze (%)=(potrošnja otopine saharoze)/(potrošnja otopine saharoze + potrošnja pročišćene vode) × 100 %.

2.3.2 Test otvorenog polja (OFT)

Aparat s otvorenim poljem formirao je kubičnu kutiju s otvorenim vrhom veličine 50 cm × 50 cm × 50 cm. Središnje kvadratno područje definirano je kao središnja zona veličine 25 cm × 25 cm sa središtem unutar arene. Svaki miš je nježno postavljen na središnju površinu kutije s otvorenim poljem. Bilo je dopušteno pet minuta besplatnog vremena prilagodbe. Snimanje ponašanja i analiza podataka usredotočeni su na sljedeće petominutno razdoblje promatranja. Primarni indikatori očitavanja sadržavali su ukupnu udaljenost kretanja, vrijeme provedeno unutar središnje zone i učestalost ulazaka u središnju zonu. Ovi parametri odražavaju spontanu lokomotornu aktivnost i istraživačku spremnost u nepoznatim uvjetima okoline.

2.3.3 Ispitivanje repnog ovjesa (TST)

Dio mišjeg repa bio je sigurno fiksiran dopuštajući životinji da visi glavom prema dolje iznad površine tla. Ukupno vrijeme snimanja bilo je šest minuta. Dokumentirano je trajanje nepokretnog vremena tijekom kasnijeg segmenta od četiri minute. Produženo vrijeme nepokretnosti predstavlja pojačan status nalik depresiji poput bihevioralnog očaja.

2.3.4 Test prisilnog plivanja (FST)

Prozirna cilindrična bačva za plivanje (promjer 15 cm, visina 50 cm) napunjena je vodom održavanom na (25 ± 2) stupnja; dubina vode dosegla 20 cm. Svaki miš je nježno stavljen u posudu za plivanje na šest minuta ukupnog intervala snimanja. Statistički je kvantificirano vrijeme plutajuće nepokretnosti od posljednje četiri minute. Dulje razdoblje nepokretnosti ukazuje na pojačanu performansu ponašanja povezanu s očajem.

2.4 Prikupljanje uzorka i priprema tkiva

U eksperimentalnoj terminalnoj točki 8. tjedna, miševi su podvrgnuti intraperitonealnoj injekciji 3 % pentobarbital natrija (10 mL/kg) za duboku anesteziju. Uzorci krvi su prikupljeni tehnikom krvarenja uklanjanja očne jabučice. Nakon toga je izvršena eutanazija zbog dislokacije vrata maternice. Perfuzija srca hladnom normalnom fiziološkom otopinom očistila je cirkulirajuću krv unutar cerebralnih tkiva. Potpuni uzorci cijelog mozga brzo su secirani. Polovica moždanog tkiva uronjena je u 4 % otopinu paraformaldehida na 72 sata fiksacije tkiva za naknadnu histologiju. Hipokampalne regije mozga brzo su izolirane od preostalih uzoraka mozga na prethodno ohlađenoj ledenoj platformi i sačuvane unutar okruženja za pohranu tekućeg dušika. Za biokemijsko mjerenje, 10 mg uzorka tkiva hipokampusa pomiješano je s prethodno ohlađenom normalnom fiziološkom otopinom slijedeći omjer mase i volumena 1:9, podvrgavajući se mehaničkoj homogenizaciji u ledenoj kupelji. Tkivni homogenat je centrifugiran na 4000 okr/min tijekom 15 minuta, a frakcije supernatanta su sakupljene za kvantifikaciju ELISA biomarkera.

2.5 Mjerenje biokemijskog indeksa

Prema uputama proizvođača komercijalnih ELISA kompleta, uzorci supernatanta seruma i homogenata hipokampusa mjereni su kako bi se dobile vrijednosti koncentracije monoaminskih neurotransmitera uključujući 5-HT i DA. Supernatant hipokampalnog homogenata dodatno je ispitan na indikatore upalnog medijatora iNOS, COX-2, PGE2, uz proupalne citokine TNF-, IL-1, IL-18, IL-6 i IFN-. Očitavanja apsorbancije optičke gustoće zabilježena su spektrofotometrom na mikroploči. Koncentracija proteina uzorka kalibrirana je primjenom kompleta za kvantifikaciju proteina BCA prije detekcije citokina.

2.6 Histopatološko bojenje hipokampusa

Fiksirani uzorci moždanog tkiva umetnuti su u parafinski vosak i izrezani na histološke rezove debljine 4 μm. Za HE bojenje: parafinske sekcije prošle su deparafinaciju ksilenom, gradijentnu hidrataciju etanolom, bojenje jezgre hematoksilinom, citoplazmatsko kontra-bojanje eozinom, diferencijaciju klorovodika i alkohola, gradijentnu dehidraciju etanolom, tretman prozirnosti ksilenom i postavljanje neutralne gume. Mikroskopsko promatranje usmjereno na staničnu morfologiju, status jezgre i strukturni integritet citoplazme unutar regije hipokampalnog nazubljenog girusa.

Bojanje po Nisslu vizualizira neuronska Nisslova tjelešca odražavajući biosintetsku aktivnost neurona i vitalnost stanice. Parafinske deparafinske kriške su inkubirane u Nisslovoj radnoj otopini za bojenje. Nakon koraka pranja destiliranom vodom, sekcije su dehidrirane, postupak prozirnosti i brtvljenje. Histomorfološke varijacije neurona hipokampusa promatrane su pod optičkim mikroskopom.

2.7 Imunohistokemijski test

Dijelovi tkiva hipokampusa uklopljeni u parafin deparafinizirani su i hidratizirani. Koraci pronalaženja antigena, blokiranja endogene peroksidaze i blokiranja nespecifičnog vezanja proteina su primijenjeni uzastopno. Kriške tkiva inkubirane su preko noći na temperaturi od 4 stupnja s razrijeđenim primarnim protutijelima: anti-GFAP (1:400), anti-Iba-1 (1:400), anti-NLRP3 (1:300), anti-Caspase-1 (1:400). Nakon sekundarne inkubacije protutijela, provedena je DAB kromogena reakcija. Dovršeni su postupci suprotnog bojenja jezgre, dehidracije i postavljanja. Svjetlosni mikroskop snimio je digitalne slike vidnog polja. Softver za obradu slike Image-J izračunao je prosječne vrijednosti optičke gustoće za polukvantitativnu procjenu intenziteta ekspresije ciljnog proteina.

2.8 Imunofluorescentno bojenje

Pripremljeni parafinski rezovi hipokampusa podvrgnuti su operaciji deparafinacije, vraćanja antigena i blokiranja. Primarna protutijela anti-TLR4 (1:400) i anti-fosfo-NF-κB p65 (1:200) primijenjena su i inkubirana preko noći u uvjetima od četiri stupnja Celzijusa. Fluorescentno obilježena sekundarna protutijela dodana su za jednosatnu inkubaciju u statusu zaštite od svjetlosti. DAPI nuklearna protuboja bila je uključena u medij za montiranje. Laserski fluorescentni mikroskop fotografira fluorescentne signale. Softver Image‑J izračunao je prosječni intenzitet fluorescencije koji predstavlja veličinu aktivacije proteina TLR4 i p‑NF‑κB p65.

2.9 Statistička analiza

Izvorni eksperimentalni podaci obrađeni su pomoću statističkog softvera SPSS 26.0 i grafičkog programa GraphPad Prism 9.0. Svi podaci o kvantitativnom ishodu izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Provedene su statističke usporedbe među grupama s odgovarajućim statističkim testovima. P-vrijednost manja od 0,05 ocijenjena je kao statistički značajna razlika; P< 0.01 represented highly significant statistical distinction.

3. Eksperimentalni rezultati

3.1 CPhGs poboljšavaju simptome anhedonije i vraćaju razine monoaminskih neurotransmitera

Prije početka CUMS modeliranja, početne stope sklonosti saharozi nisu pokazivale očitu statističku varijancu u svim kohortama eksperimentalnih životinja. Nakon četverotjednog CUMS stresa plus četverotjednih intervencijskih ciklusa, grupa CUMS-modela pokazala je izrazito smanjen omjer preferiranja saharoze u odnosu na kontrolne životinje koje nisu bile pod stresom (P< 0.01), demonstrating successful establishment of anhedonia depressive‑like phenotype. Serum and hippocampal tissue 5‑HT and DA concentrations in Mod group were significantly reduced compared with Con group (P < 0.05 or P < 0.01).

U usporedbi s kohortom Mod modela, terapijske skupine s visokom, srednjom i niskom dozom CPhGs kao i skupina pozitivna na fluoksetin generirale su značajno povećanje postotka preferiranja saharoze, serumskog 5-HT, serumskog DA, hipokampalnog 5-HT i hipokampalnog sadržaja DA (P< 0.05 or P < 0.01). Pharmacological improvement effect exhibited apparent dose‑dependent tendency; high‑dose CPhGs group achieved more robust biomarker‑rescue outcome than medium‑dose and low‑dose subgroups. This set of findings illustrated CPhGs could ameliorate anhedonic behavioral performance and reverse stress‑provoked depletion of key mood‑regulating monoamine neurotransmitters inside peripheral circulation and hippocampal brain tissue.

3.2 CPhGs poboljšana istraživačka aktivnost u testu otvorenog polja

U procjeni ponašanja na otvorenom, miševi CUMS-modela pokazali su značajno smanjenje ukupne udaljenosti kretanja, vremena zadržavanja u središnjoj zoni i učestalosti ulaska u središnju regiju u odnosu na kontrolne miševe (P< 0.01). Chronic unpredictable stress suppressed spontaneous exploratory behaviors. Following CPhGs or fluoxetine intervention, those three open‑field‑test indicators increased observably (P < 0.05 or P < 0.01). High‑dose CPhGs‑treated mice displayed 46.63 % increase of total travel distance, 127.92 % growth of central‑zone residence time compared against Mod group. Medium‑dose and low‑dose CPhGs also produced measurable but weaker improvement effects. It indicated CPhGs alleviated stress‑induced suppression of autonomous exploration activity.

3.3 CPhGs skraćeno vrijeme nepokretnosti u paradigmama ponašanja temeljenim na očaju

Test ovjesa repa i test prisilnog plivanja otkrivaju očaj u ponašanju, predstavljajući temeljna očitavanja ponašanja slična depresivnom. Grupa Mod pokazala je drastično produljeno vrijeme nepokretnosti i u TST i u FST (str< 0.01) relative to Con group. After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M, CPhGs‑L and FLX groups generated statistically significant shortening of immobility durations (P < 0.05 or P < 0.01). For forced‑swim immobility time, high‑dose CPhGs brought 34.67 % reduction; medium‑dose 30.71 % reduction; low‑dose 20.78 % reduction. For tail‑suspension immobile time: CPhGs‑H achieved 35.91 % decrease. Results suggested CPhGs mitigated despair‑related passive coping behavioral patterns triggered by long‑term unpredictable stress stimulation.

3.4 CPhGs Smanjeni prekomjerno izraženi hipokampalni proupalni citokini

Koncentracije proupalnih citokina u hipokampusu (TNF‑, IL‑1, IL‑18, IL‑6, IFN‑) kod životinja na modelu CUMS bile su drastično povišene u usporedbi s kontrolnim uzorcima (P< 0.01). After CPhGs intervention, these pro‑inflammatory cytokine contents descended in dose‑responsive fashion. High‑dose CPhGs generated the most powerful inhibitory influence. For instance, relative to Mod group, CPhGs‑H decreased TNF‑α level by 42.93 %, lowered IL‑1β by 45.72 %, and reduced IL‑18 by 35.17 %. Medium‑dose CPhGs delivered moderate anti‑inflammatory potency, and low‑dose group exerted limited but detectable inhibitory impacts. This data demonstrated CPhGs could suppress excessive pro‑inflammatory‑cytokine release inside hippocampal tissue under chronic‑stress challenge.

3.5 CPhG-ovi biomarkeri hipokampalnog upalnog medijatora s niskom regulacijom

Hipokampalni upalni medijatori iNOS, COX‑2 i PGE2 u miševa modela CUMS značajno su porasli (P< 0.01). After drug intervention, CPhGs‑H, CPhGs‑M markedly diminished iNOS, COX‑2 and PGE2 concentrations (P < 0.05 or P < 0.01). Low‑dose CPhGs‑L group showed limited statistical significance for partial indicators. High‑dose CPhGs treatment group exhibited iNOS reduction rate reaching 49.55 %, COX‑2 reduction 39.58 %. Collectively, CPhGs suppressed stress‑induced up‑regulation of inflammatory‑mediator molecules inside hippocampus.

3.6 Patološka ozljeda hipokampalnog neurona oslabljena CPhG-om izazvana CUMS-om

Rezultati bojenja HE: neuroni hipokampalnog dentatnog girusa iz grupe Mod predstavili su ozbiljne patološke lezije: poremećen stanični raspored, piknoza jezgre, citoplazmatska vakuolarna degeneracija, manifestirajuća izražena oštećenja neurona. Skupina CPhGs‑L pokazala je samo trivijalni učinak poboljšanja. Srednje doze i visoke doze CPhG očito su preokrenule takve patološke promjene; skupina s visokom dozom CPhGs-H pokazala je superiorniji učinak zaštite neurona u usporedbi sa skupinom s fluoksetinom u djelomičnim vidnim poljima.

Ishodi bojenja po Nisslu: Hipokampalni neuroni Mod-skupine pokazali su neorganiziran raspored, vidljivo smanjenje količine Nisslovih tjelešaca, što je odražavalo oštećenu sintetsku funkciju neurona i nisku staničnu vitalnost. Primjena CPhG-a, ovisno o dozi, obnovila je obilje Nissl-ovog tijela. Morfologija neurona i gustoća Nissl-korpuskula unutar CPhGs-H skupine približili su se normalnoj razini kontrolne skupine. Histopatološki nalazi potvrdili su da CPhG štite integritet neurona hipokampusa od uništenja uzrokovanog kroničnim stresom.

3.7 CPhGs regulirani status aktivacije hipokampalnih glijalnih stanica

GFAP je specifični biomarker za populaciju astrocita. U usporedbi s grupom Con, intenzitet pozitivnog GFAP hipokampalnog GFAP-skupine Mod grupe značajno je pao (P< 0.01), indicating massive astrocyte functional impairment induced by CUMS stress. CPhGs‑H and CPhGs‑M intervention groups distinctly elevated GFAP expression level (P < 0.05 or P < 0.01); high‑dose CPhGs‑H enhanced GFAP average optical density by 64.23 % relative to Mod group. Low‑dose CPhGs‑L generated upward trend without statistical significance.

Iba‑1 protein marker predstavlja mikrogliju. Grupa CUMS modela pokazala je dramatično povećan Iba-1 signal pozitivne ekspresije (P< 0.01), implying robust microglia hyper‑activation. After CPhGs intervention, Iba‑1 expression intensity decreased dose‑dependently. CPhGs‑H produced 23.73 % reduction of Iba‑1 optical‑density value versus Mod group. It illustrated CPhGs preserved astrocyte abundance while dampening pathological microglia over‑activation inside hippocampal compartments.

3.8 CPhGs inhibira ekspresiju proteina povezanog s inflammasomom hipokampalnog NLRP3

Imunohistokemijska detekcija pokazala je da je ekspresija proteina NLRP3 i kaspaze-1 unutar hipokampusa Mod-skupine izrazito pojačana (P< 0.01). Following CPhGs treatment, NLRP3 and Caspase‑1 protein abundance declined dose‑responsively. High‑dose CPhGs‑H decreased NLRP3 expression by 50.00 %, lowered Caspase‑1 expression level by 57.65 %. It demonstrated CPhGs suppressed pathological NLRP3 inflammasome complex activation in CUMS‑damaged hippocampal tissue.

3.9 CPhG-ovi potiskuju prekomjernu aktivaciju TLR4/NF-κB signalnog puta

Imunofluorescentna detekcija pokazala je da miševi CUMS-modela pokazuju značajno povećan intenzitet fluorescencije TLR4 receptora i fosforilirane NF-κB p65 podjedinice (P< 0.01). CPhGs intervention obviously reduced TLR4 and p‑NF‑κB p65 fluorescence signal strength (P < 0.05 or P < 0.01). Combined with above‑mentioned NLRP3 inflammasome‑protein detection results, these observations supported the inference: CPhGs inhibited TLR4/NF‑κB upstream signal‑cascade hyper‑activation, which sequentially restrained downstream NLRP3 inflammasome assembly and neuro‑inflammatory cascade amplification.

4. Rasprava

Veliki depresivni poremećaj predstavlja tešku neuropsihijatrijsku bolest. Posljednjih je godina neuroupalna teorija depresije privukla široku pozornost istraživanja. Kronični ponavljani psihološki stres može potaknuti aktivaciju urođenog imunološkog sustava unutar središnjeg živčanog sustava. Hipokampus, jedna regija mozga vrlo ranjiva na stresne uvrede, usko je povezan s modulacijom raspoloženja, obradom nagrada i funkcijom pamćenja. Pod trajnom stimulacijom stresom, homeostaza hipokampalnih glijalnih stanica se urušava. Hiperaktivirana mikroglija i oštećeni astrociti izlučuju velike količine proupalnih citokina, što dovodi do oštećenja strukture neurona, metaboličkog poremećaja monoaminskog neurotransmitera, što na kraju potiče pojavu ponašanja nalik depresiji.

Aktivni prirodni proizvodi dobiveni tradicionalnom biljnom medicinom posjeduju multi-ciljne farmakološke prednosti, postajući obećavajući izvori kandidata za otkrivanje lijekova protiv depresije. CPhG su prepoznatljive bioaktivne komponente izolirane izCistancheljekovito bilje. Ovo je istraživanje konstruiralo mišji model kronične depresije izazvane CUMS-om, sveobuhvatno potvrđujući in vivo učinkovitost CPhG-ova s ​​gradijentnom dozom nalik antidepresivima. Eksperimentalni rezultati ponašanja pokazali su da je liječenje CPhGs značajno ublažilo simptom anhedonije, poboljšalo istraživačku aktivnost i smanjilo vrijeme nepokretnosti povezano s očajem kod miševa s modelom depresije, pokazujući jasnu korelaciju između doze i učinka.

Hipoteza monoaminskog neurotransmitera klasična je teorija o patogenezi depresije. Serotonin i dopamin preuzimaju kritične regulatorne uloge koje pokrivaju emocionalnu stabilizaciju, percepciju povratne informacije o nagradi i modulaciju ponašanja povezanu s motivacijom. CUMS stres doveo je do očitog pada koncentracija 5-HT i DA u serumu i tkivu hipokampusa u našim modelima životinja. Intervencija CPhG-a učinkovito je obnovila razine ova dva monoaminska neurotransmitera. Ovaj je ishod u skladu s ranijim objavljenim istraživačkim izvješćima oCistancheekstrahira modulirajuće moždane monoaminske neurotransmitere.

Daljnje testiranje biokemijskih biomarkera otkrilo je da CUMS izaziva snažno povećanje višestrukih proupalnih citokina (TNF-, IL-1, IL-18, IL-6, IFN-) plus upalnih medijatora (iNOS, COX-2, PGE2) unutar tkiva hipokampusa. Intervencija CPhG-a značajno je preokrenula takav status prekomjerne ekspresije upale. Histopatološko HE i Nissl bojenje intuitivno je dokazalo da CPhGs ublažavaju oštećenje hipokampalnog neurona uzrokovano stresom i štite morfološki integritet neurona.

Populacije glijalnih stanica služe kao središnji sudionici koji posreduju neuroupalnim odgovorima. Astrociti održavaju recikliranje neurotransmitera, strukturnu stabilnost krvno-moždane barijere i opskrbu neurona prehranom. Mikroglija funkcionira kao rezidentne urođene imunološke efektorske stanice unutar moždanog parenhima. Kronični stres izaziva gubitak astrocita ili funkcionalnu nesposobnost, uz patološku hiperaktivaciju mikroglije. Naši imunohistokemijski podaci pokazali su da je liječenje CPhG-ima povećalo gustoću GFAP-pozitivnih astrocita, dok je u međuvremenu smanjilo količinu prekomjerno aktivirane mikroglije označene Iba-1 u hipokampusu. Ovo regulatorno svojstvo fenotipa glija stanica može djelomično biti u osnovi neuroprotektivne i antidepresivne farmakološke moći CPhG-a.

NLRP3 inflamasom predstavlja vitalnu molekularnu platformu koja posreduje neuroupalnu kaskadu. Njegova aktivacija pokreće sazrijevanje i izlučivanje nizvodno proupalnih citokina IL-1 i IL-18. Signalna os TLR4/NF‑κB djeluje kao bitan uzvodni početni signal za aktivaciju inflamasoma NLRP3. Stimulacija receptora TLR4 potiče fosforilaciju podjedinice NF-κB i translokaciju jezgre, dalje trans-aktivira NLRP3, transkripciju gena pro-IL-1. U našoj sadašnjoj studiji, CUMS stres je izazvao istovremeno poboljšanje ekspresije proteina TLR4, fosforiliranog NF-κB p65, NLRP3 i kaspaze-1. Intervencija CPhG-a izrazito je inhibirala aktivaciju cijele ove kaskade signala. Stoga zaključujemo da CPhG djelomično ublažava neuroupalnu ozljedu obuzdavanjem aktivacije inflamasoma NLRP3 posredovane TLR4/NF-κB.

Uzeti zajedno, naši eksperimentalni dokazi na životinjskom modelu podupiru mehanički model: CPhG stvaraju učinke slične antidepresivima kod depresivnih miševa izazvanih CUMS-om kroz dvije primarne dimenzije: (1) obnavljanje homeostaze monoaminskih neurotransmitera povezanih s raspoloženjem (5-HT, DA); (2) moduliranje homeostaze glijalnih stanica hipokampusa i suzbijanje neuroupalne patološke kaskade NLRP3 ovisne o upali NLRP3/NF‑κB.

Nekoliko ograničenja ovog istraživanja zaslužuju razmatranje. Ovaj rad isključivo je provodio pokuse in vivo na razini životinja. Nismo proveli mehanističku validaciju na staničnoj razini niti klinička ispitivanja na ljudima. Stoga bi translacijski zaključak prema terapiji ljudske depresije trebao ostati razborit. Osim toga, ovim istraživanjem nisu analizirani doprinosi pojedinačnih monomernih spojeva (ehinakozid, verbaskozid) unutar miješanog ekstrakta CPhGs. Buduća bi se istraživanja mogla usredotočiti na verifikaciju mehanizma stanične kulture, usporedbu aktivnosti pojedinačnih komponenti, kao i na preliminarno pilot promatranje ljudi i subjekata.

5. Zaključak

Cistanche feniletanol glikozidi (CPhGs) proizvode značajna farmakološka djelovanja slična antidepresivima protiv kroničnih nepredvidljivih fenotipova ponašanja nalik depresiji izazvanih blagim stresom u C57BL/6 miševa. Njegovi terapeutski mehanizmi povezani su s oporavkom serumskih i hipokampalnih razina serotonina i neurotransmitera dopamina, očuvanjem integriteta hipokampalne neuronske strukture, modulacijom funkcionalne ravnoteže astrocita i mikroglije, kao i supresijom TLR4/NF‑κB/NLRP3 posredovane upalom neuroinflamatorna patološka kaskada. Ova pretklinička studija na životinjama daje eksperimentalnu referencu za daljnji razvoj CPhG-a kao prirodne terapeutske pomoćne tvari ili funkcionalnog sastojka hrane usmjerenog na poboljšanje simptoma depresije.

Reference

Ren L, Shao YT, Qin SH. Studija utvrđivanja cilja i učinka saponina A na depresivni poremećaj. Nat Prod Res Dev, 2024, 36:44-51.

Fan L, Peng Y, Wang JW, et al. Ukupni glikozidi iz stabljika Cistanche tubulosa ublažavaju ponašanja slična depresiji: dvosmjerna interakcija fitokemikalija i crijevne mikrobiote. Fitomedicina, 2021, 83:153471.

Fan L, Peng Y, Chen XN, et al. Integrirana analiza fitokemijskog sastava, farmakokinetike i mrežne farmakologije za ispitivanje razlika između stabljika Cistanche deserticola i C. tubulosa na temelju antidepresivne aktivnosti. Hrana i funkcija, 2022, 13:8542-8557.

Yirmiya R, Rimmerman N, Reshef R. Depresija kao mikroglijalna bolest. Trendovi u neuroznanostima, 2015., 38:637-658.

Jia XN, Gao ZH, Hu HL. Mikroglija u depresiji: trenutne perspektive. Science China‑Life Sciences, 2021., 64:911-925.

Wu B, Gan AN, Wang RX, et al. Alpinia oxyphylla Miq. hlapljivo ulje ublažava depresivno ponašanje i inhibira neuroinflamaciju kod miševa izloženih CUMS-u inhibiranjem signalnog puta MyD88/NF‑κB posredovanog TLR4. Journal of Chemical Neuroanatomy, 2023,130:102270.