Sažetak

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight, dragocjena homologna biljka za hranu i lijek iz obitelji Orobanchaceae, naširoko se uzgaja u južnom Xinjiangu u Kini. Njegovi glavni bioaktivni sastojci feniletanoidni glikozidi,ehinakozidiakteozid (verbaskozid), isporučuju više farmakoloških aktivnosti uključujući antioksidacijsku, protuupalnu i imunološku regulaciju. Nestandardizirani tradicionalni postupci obrade često uzrokuju znatne gubitke ovih osnovnih aktivnih spojeva, ograničavajući medicinsku i funkcionalnu prehrambenu primjenuCistanche tubulosakomadići odvarka. Ovo istraživanje imalo je za cilj optimizirati suvremene parametre prerade za svježeCistanche tubulosakriške kako bi se maksimalizirao oporavak akteozida i ehinakozida i dodatno razjasnio antioksidativni stres i protuupalnu bioaktivnost kao i temeljni molekularni mehanizam optimalno obrađenih komadića dekokcija na staničnoj razini.

Provedeni su eksperimenti s jednim faktorom kako bi se odredili odgovarajući rasponi za debljinu kriški, trajanje kuhanja na pari i temperaturu sušenja u pećnici. Trofaktorska trorazinska Box-Behnkenova metodologija odzivne površine usvojena je za uspostavljanje modela interakcije više faktora, koristeći sadržaj akteozida i ehinakozida kao pokazatelja dvojne evaluacije. Naknadno je napravljen model mišjih makrofagnih stanica RAW264.7 stimuliran lipopolisaharidom (LPS) za simulaciju peroksidacije lipida i akutnog upalnog oštećenja. Niz biokemijskih testova uključujući MTT, ROS fluorescentnu detekciju, ELISA i Western blot proveden je kako bi se procijenila moć antioksidativnog stresa i istražili putevi prijenosa signala.

Prema eksperimentalnim rezultatima, optimalni parametri obrade određeni su kao debljina kriške od 0,6 cm, tretman na pari 6 minuta i temperatura sušenja postavljena na 57 stupnjeva. Pod ovim praktičnim uvjetima obrade, izmjereni sadržaji akteozida i ehinakozida dosegli su 7,25 % odnosno 31,62 %, pokazujući dobru dosljednost s teoretskim predviđenim vrijednostima. Analize temeljene na stanicama otkrile su da je optimalno obrađenCistanche tubulosaekstrakti decoction-piecea značajno su smanjili koncentracije dušikovog oksida (NO) i malondialdehida (MDA) u makrofagima RAW264.7 izazvanim LPS-om. U međuvremenu, značajno je povećao unutarstanične aktivnosti antioksidativnih enzima superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT), laktat dehidrogenaze (LDH), zajedno s povećanim sadržajem glutationa (GSH). Razine izlučivanja proupalnih medijatora uključujući TNF‑, IL‑1 i IL‑6 također su bile potisnute na način ovisan o dozi. Western-blot detekcija je to potvrdilaCistanche tubulosaekstrahira obuzdanu prekomjernu fosforilaciju ključnih proteina unutar p38/AKT/JNK/NF‑κB signalnih kaskada.

Ukratko, ovaj optimizirani moderni protokol obrade učinkovito poboljšava prinose karakterističnih feniletanoidnih glikozida (akteozida i ehinakozida) uCistanche tubulosakomadići odvarka. Prerađeni biljni materijal pokazuje istaknute antioksidativne stresne i protuupalne učinke u modelu ozljede makrofaga izazvanog LPS-om, čiji se farmakološki mehanizam djelomično ostvaruje putem inhibicije prekomjerne aktivacije p38/AKT/JNK/NF-κB upalne signalne osi. Ovaj rad pruža pouzdane tehničke parametre za standardiziranu industrijsku proizvodnju i daje eksperimentalnu podršku za razvoj antioksidativno funkcionalne hrane dobivene izCistanche tubulosa.

Ključne riječi: Cistanche tubulosa; tehnologija obrade decoction-piece; akteozid; ehinakozid; antioksidativni stres; RAW264.7 makrofag; p38/AKT/JNK/NF‑κB signalni put

1. Uvod

Cistanche tubulosa(Schenk) Wight pripada obitelji Orobanchaceae, a njezina mesnata ljuskava stabljika službeni je ljekoviti dio. Ova pustinjska ljekovita biljka uglavnom se sadi u sušnom južnom Xinjiangu u Kini. U tradicionalnoj kineskoj biljnoj praksi,Cistanche tubulosasluži kao klasična tonična biljka s dokumentiranim terapeutskim funkcijama toniziranja bubrega-yanga, obnavljanja esencijalne krvi i opuštajućeg pražnjenja crijeva. Klinički se primjenjuje za ublažavanje bolova—slabosti lumbusa i koljena, neplodnosti uzrokovane nedostatkom bubrega i zatvora izazvanog suhoćom crijeva维普期刊.

Feniletanoidni glikozidi predstavljaju najkritičnije bioaktivne markereCistanche tubulosa. Kineska farmakopeja propisuje da ukupni sadržaj ehinakozida plus akteozida ne smije biti manji od 1,50 % za kvalificirane medicinske materijale. Ipak, trenutna mainstream proizvodnjaCistanche tubulosakomadići uvarka još uvijek uglavnom slijede drevne ručne tijekove rada: namakanje svježeg sirovog bilja, temeljito vlaženje, rezanje i prirodno sušenje ili obrada u vinu na pari. Ovim konvencionalnim pristupima nedostaju precizne kvantitativne tehničke specifikacije. Toplinska nestabilnost feniletanoidnih glikozida često dovodi do ozbiljne degradacije aktivnog sastojka tijekom obrade, što smanjuje kvalitetu konačnog proizvoda i ograničava proizvodnju visoke kvalitete u velikim količinama. Trenutačno samo ograničena istraživanja istovremeno kombiniraju optimizaciju tehnologije obrade s validacijom biološke aktivnosti; većina studija samo otkriva sadržaj kemijskih sastojaka bez stanične funkcionalne provjere, stvarajući praznine za industrijsku transformacijuGoogle za....

Oksidativni stres djeluje kao temeljni patološki okidač za brojne kronične metaboličke i upalne bolesti. Pretjerano nakupljanje reaktivnih vrsta kisika (ROS) remeti redoks homeostazu, dodatno izaziva prekomjernu aktivaciju makrofaga i masivno otpuštanje proupalnih citokina, stvarajući začarani krug između oksidacije i upale. Postojeća farmakološka istraživanja su to dokazalaCistanchefeniletanoidni glikozidi porijekla posjeduju antioksidativna i protuupalna svojstva. Prethodni pokusi na životinjama su to pokazaliCistanche tubulosaukupni glikozidi ublažili su oštećenje jetre u modelima glodavaca sa sepsom aktiviranjem Nrf2/HO‑1 antioksidativnog signaliziranja. Lignan-glikozidne komponente izolirane izCistanche tubulosamogao ublažiti upalne odgovore izazvane LPS-om putem modulacije puta PI3K/AKT u makrofagima RAW264.7. Međutim, nije sustavno procijenjeno zadržavaju li komadići decoction-a proizvedeni u novooptimiziranim uvjetima obrade snažnu bioaktivnost protiv oksidativnog stresa. Konkretni molekularni regulatorni mehanizam još zahtijeva dublje istraživanje.

Makrofag RAW264.7 stimuliran LPS-om dobro je prihvaćen in vitro model upale-oksidativnog oštećenja, naširoko prihvaćen za procjenu antioksidativnih i protuupalnih učinaka prirodnog proizvoda. U ovoj studiji prvo provodimo probir po jednom faktoru nakon čega slijedi optimizacija površine odziva Box-Behnken kako bismo dobili standardizirane tehničke parametre rezanje-parenje-sušenje s ciljem visokih prinosa akteozida i ehinakozida. Nakon dobivanja optimiziranih decoction-piece proizvoda, pripremamo biljne ekstrakte i usvajamo model staničnog oštećenja RAW264.7 izazvanog LPS-om. Višestruke eksperimentalne platforme uključujući mjerenje biokemijskih markera oksidativnog stresa, kvantifikaciju citokina ELISA i analizu puta Western blot koriste se za razjašnjenje učinkovitosti antioksidativnog stresa i mehanizma prijenosa signala. Ovo istraživanje daje praktične procesne parametre za pilot proizvodnju visoke kvaliteteCistanche tubulosadecoction komadi sa stabilnim djelovanjem protiv oksidativnog stresa i postavlja eksperimentalne temelje za kasniji razvoj funkcionalne hrane i proizvoda dodataka prehrani koji potječu iz XinjiangaCistanche tubulosasredstva.

2. Materijali i metode

2.1 Sirovine, reagensi i instrumenti

svježeCistanche tubulosamesnate stabljike sakupljene su u jesen iz Hotana, Xinjiang Uyghur Autonomna Regija, Kina. Stanična linija mišje monocitno-makrofagne leukemije RAW264.7 kupljena je od Procell Life Science & Technology Co., Ltd (Wuhan, Kina). Acetonitril i metanol kromatografske kvalitete isporučio je Merck (Njemačka). Referentne standardne tvari ehinakozid i akteozid (čistoća veća od ili jednaka 98 %) dobivene su od pekinškog instituta za mjeriteljsku tehnologiju North Weiye. Dimetil sulfoksid (DMSO) je kupljen od Sigma‑VETEC (SAD). DMEM medij s visokim sadržajem glukoze, komplet za analizu BCA ukupnih proteina proizvodi su tvrtke Thermo Fisher Scientific (SAD). Fetalni goveđi serum (FBS) kupljen je od BI (Izrael). Otopina dvostrukog antitijela penicilin-streptomicin dolazi iz HyClone (SAD). Komercijalni kompleti za analizu NO, MDA, SOD, CAT, GSH nabavljeni su od Beyotime Biotechnology (Šangaj, Kina). Komplet za detekciju LDH i lipopolisaharid (LPS,E. coli055:B5) dobiveni su od Solarbio (Peking, Kina).

Ključni laboratorijski instrumenti uključivali su sustav tekućinske kromatografije visoke učinkovitosti (HPLC) Shimadzu, rotacijski isparivač LabTech, brzi raspršivač kineskog bilja zakretnog tipa, termostatsku pećnicu za brzo sušenje, opremu za parnu posudu, BioTek SYNERGY‑H1 multi-mode čitač mikropločica, FA1204N elektronička analitička vaga, CF1524R rashlađena centrifuga, BSC‑1300IIA2 biosigurnosni ormar i BDS200‑PH invertni optički mikroskop.

2.2 Eksperimenti obrade s jednim faktorom

svježeCistanche tubulosamesnate stabljike narezane su na kriške različite debljine (0,2 cm, 0,4 cm, 0,6 cm, 0,8 cm, 1,0 cm, 1,2 cm). Kriške su kuhane na pari različita vremena (3 min, 6 min, 9 min, 12 min, 15 min, 18 min, 21 min). Nakon toga su materijali sušeni pod različitim temperaturnim gradijentima (25 stupnjeva okoline, 40 stupnjeva, 50 stupnjeva, 60 stupnjeva, 70 stupnjeva, 80 stupnjeva). Potpuno osušeni uzorci decoction-pieces su usitnjeni u prah i prosijani kroz sito od 40 mesha za kasniju kvantifikaciju HPLC komponente.

2.3 Određivanje sadržaja akteozida i ehinakozida

Priprema otopine uzorka: Točno izvažite 1,0 g praha usitnjenog dekokcijskog komada u koničnu tikvicu s čepom. Precizno dodajte 100 mL 50 % otopine metanola. Izvršite 30-minutno namakanje nakon čega slijedi 40-minutna ultrazvučna ekstrakcija. Nakon hlađenja, nadoknadite gubitak težine otapala s 50 % metanola, ravnomjerno promiješajte i ostavite statično taloženje. Supernatant je filtriran kroz 0,22 µm mikroporoznu membranu za HPLC injekciju.

Reference‑standard‑solution preparation: Accurately weigh appropriate quantity of acteoside and echinacoside reference substances, dissolve with 50 % methanol inside volumetric flasks, prepare serial‑gradient standard solutions, filter with 0.22 μm filter membrane.

Kromatografska postavka: analitička kolona COSMOSIL C18; sustav mobilne faze: mobilna faza A: 0,1 % vodena otopina fosforne kiseline; mobilna faza B: acetonitril. Valna duljina detekcije postavljena je na 330 nm; temperatura kolone 35 stupnjeva; brzina protoka 1 mL/min. Za kvantitativno izračunavanje sadržaja akteozida i ehinakozida primijenjena je metoda eksternog standarda. Sveobuhvatna ocjena=(sadržaj ehinakozida × 50 %) + (sadržaj akteozida × 50 %). Sveobuhvatni rezultati poslužili su kao složeni pokazatelj procjene za izvedbu uvjeta obrade.

2.4 Eksperimentalni dizajn Box-Behnkenove površine odziva

Na temelju jednofaktorskih eksperimentalnih rezultata, softver Design-Expert 13.0 korišten je za implementaciju Box-Behnken trofaktorskog eksperimentalnog rasporeda na tri razine. Debljina kriški (X₁, cm), vrijeme obrade na pari (X₂, min), temperatura sušenja (X₃, stupanj ) odabrani su kao nezavisne varijable. Sadržaj akteozida (Y₁, %) i sadržaj ehinakozida (Y₂, %) bile su vrijednosti odgovora. Provedeno je sedamnaest skupina eksperimenata. Nulta razina za svaki faktor odabrana je prema optimalnom parametru dobivenom u testovima s jednim faktorom. Nakon završetka ispitivanja površine odziva, dovršena je analiza varijance modela, 3D iscrtavanje površine odziva i predviđanje stanja. Praktični verifikacijski pokusi provedeni su nakon prilagodbe teoretskih predviđenih parametara operativnim stvarnim proizvodnim vrijednostima.

2.5 Kultura stanica i priprema uzorka

Sirovine za uvarak proizvedene su u optimiziranim uvjetima obrade. Biljni prah ekstrahiran je prema gore navedenom protokolu za pripremu uzorka, koncentriran rotacijskim isparavanjem i osušen u vakuumu kako bi se dobio kruti ekstrakt u prahu. Osnovna otopina pripremljena je otapanjem praha ekstrakta u DMSO, dodatno razrijeđena potpunim DMEM medijem (koji sadrži 10 % FBS i 1 % penicilin-streptomicin) za stanične eksperimente; konačna radna koncentracija DMSO je kontrolirana ispod 0,1 % (v/v). Makrofagi RAW264.7 uzgajani su u DMEM potpunom mediju pod 37 stupnjeva, 5% CO2 vlažnim inkubatorskim okruženjem.

2.6 MTT test citotoksičnosti

Stanice RAW264.7 nasađene su na mikropločice s 96 jažica pri gustoći stanica od 8 × 10⁴ stanica/mL. Eksperimentalne skupine uključivale su kontrolnu skupinu s otapalom (medij 0,1 % DMSO), skupinu LPS-modela (konačna koncentracija LPS-a 1 ug/mL) i višestrukeCistanche tubulosaskupine koncentracije ekstrakta (3,125, 6,25, 12,5, 25, 50, 100, 200, 400 ug/mL). Nakon 2-satne predinkubacije s biljnim uzorkom, LPS (konačna koncentracija od 1 ug/mL) dodan je svakoj skupini osim kontrolnoj skupini s otapalom. Inkubacija je nastavljena 24 sata. Zatim je dodan MTT reagens (5 mg/mL) i inkubiran 4 h. Odbacite supernatant, dodajte 150 μL DMSO po jažici, protresite na 37 stupnjeva 15 minuta. Vrijednost apsorpcije pri valnoj duljini od 490 nm očitana je na čitaču mikropločica i izračunata je stopa preživljavanja stanica. Sigurni raspon radnih koncentracija određen je za naknadna funkcionalna ispitivanja.

2.7 Intracelularno mjerenje ROS-a

Makrofagi RAW264.7 inokulirani su na ploče sa šest jažica u gustoći od 4 × 10⁵ stanica po jažici. Nakon prianjanja stanica, proveden je tretman grupiranjem: kontrolna skupina otapala, skupina LPS-modela i skupine tretirane CT ekstraktom (12,5, 25, 50, 100 ug/mL). Nakon 2 sata predtretmana s uzorkom, dodan je LPS 1 ug/mL osim kontrolne skupine s otapalom, inkubirati 24 h. Intracelularna razina ROS-a detektirana je metodom punjenja fluorescentne sonde prema uputama za komplet. Fluorescentni intenzitet mjeren je fluorescentnim čitačem mikropločica (ekscitacija 488 nm, emisija 525 nm).

2.8 Detekcija NO, MDA, SOD, CAT, LDH i GSH

Nakon odgovarajućeg tretmana stanica, supernatant stanične kulture prikupljen je za mjerenje NO primjenom Griessove reakcije. Pričvršćene stanice su isprane s prethodno ohlađenim PBS-om, lizirane na ledu, supernatant staničnog lizata je sakupljen nakon centrifugiranja (10 000 o/min, 4 stupnja, 5 min). BCA kit odredio je koncentraciju ukupnih proteina svakog uzorka. Sadržaj MDA, GSH i indikatora enzimske aktivnosti SOD, CAT, LDH analiziran je strogo prema uputama za uporabu kompleta.

2.9 ELISA određivanje proinflamatornih citokina

Stanice RAW264.7 primale su predtretman uzorka i LPS stimulaciju ukupno 16 sati. Supernatant stanične kulture je sakupljen i centrifugiran. Koncentracije TNF‑, IL‑1, IL‑6 u supernatantu kvantificirane su komercijalnim ELISA kitovima.

2.10 Western-blot analiza

Nakon 45 minuta koinkubacije LPS-a i uzorka, stanice RAW264.7 lizirane su korištenjem RIPA pufera za lizu dopunjenog koktelom inhibitora proteaze-fosfataze. Stanični lizat je centrifugiran na 10 000 okr/min ispod 4 stupnja tijekom 5 minuta. BCA kit kvantificira koncentraciju ukupnih proteina. Uzorci proteina (50 ug po stazi) su denaturirani u metalnoj kupelji od 100 stupnjeva tijekom 5 minuta. SDS-PAGE gel elektroforeza razdvojila je ciljne proteine, koji su potom preneseni na PVDF membrane. Membrane su blokirane 1 sat s 5 % otopinom TBST obranog mlijeka. Primarna protutijela usmjerena na p38, p-p38, AKT, p-AKT, JNK, p-JNK, NF-κB p65, p-NF-κB p65 i GAPDH inkubirana su preko noći na 4 stupnja. Nakon ispiranja TBST, odgovarajuća sekundarna antitijela su inkubirana na sobnoj temperaturi 1 h. Nakon ponovljenog ispiranja, ECL ultra-osjetljivi kemiluminescentni reagens primijenjen je za prikaz proteinske trake. Provedena je kvantitativna analiza sivih skala za procjenu relativne razine ekspresije fosforilacije proteina.

2.11 Statistička analiza

Softver GraphPad Prism 8.0.2 korišten je za statističko izračunavanje i crtanje grafikona. Rezultati eksperimentalnih kvantitativnih podataka izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (\\(\\bar{x} \\pm s\\)). Za međugrupnu usporedbu primijenjena je jednosmjerna ANOVA praćena post-hoc testovima višestruke usporedbe. \\(str<0.05\) represented statistically significant difference; \(P<0.01\) highly significant difference; \(P<0.001\) extremely significant difference.

3. Eksperimentalni rezultati

3.1 Rezultati pokusa s jednim faktorom

Slice thickness exerted obvious influence over the contents of acteoside and echinacoside. Slices at 0.2 cm thickness were easily over‑steamed, leading to thermal degradation of phenylethanoid‑glycoside active components. Excessively thick slices (>0,4 cm) ometalo otpuštanje unutarnje tvari, smanjujući konačni sadržaj detektabilne komponente. Pod fiksnim vremenom kuhanja na pari (10 min) i temperaturom sušenja (60 stupnjeva), debljina kriški od 0,4 cm postigla je najvišu sveobuhvatnu ocjenu.

Rezultati trajanja tretmana na pari: kada je debljina kriške bila fiksirana na 0,4 cm, a temperatura sušenja održavana na 60 stupnjeva, nedovoljno vrijeme kuhanja na pari nije moglo dovoljno uništiti strukturu biljnih stanica, tako da se aktivni spojevi teško mogu otopiti. Nakon što je vrijeme kuhanja prekoračilo 6 minuta, prekomjerno kuhanje na pari oštetilo je biljno tkivo i izazvalo razgradnju ehinakozida i akteozida. Stoga je 6 minuta preliminarno identificirano kao poželjno trajanje obrade na pari.

Za eksperimente s gradijentom temperature sušenja u pećnici: debljina kriške 0,4 cm i vrijeme kuhanja na pari 6 minuta bili su fiksni. Sadržaj komponenti je rastao s povećanjem temperature sušenja unutar određenog raspona. Nakon što je temperatura sušenja prešla 60 stupnjeva, toplinska razgradnja na visokoj temperaturi uzrokovala je značajan pad sadržaja ciljne tvari. Stoga je odabrano 60 stupnjeva kao početni optimalni uvjet temperature sušenja za kasniju optimizaciju površine odziva.

3.2 Box-Behnken Response-Surface optimizacija i verifikacija

Sedamnaest skupina Box-Behnken eksperimentalnih pokreta završeno je prema matrici dizajna. Rezultati analize varijance pokazali su da su regresijski modeli za sadržaj akteozida i ehinakozida postigli statističku značajnost (\\(P<0.05\)). The lack‑of‑fit terms were non‑significant (\(P>0.05\)), demonstrating satisfactory model‑fitting quality. Coefficient of determination \(R^2\) values were close to 1, illustrating high consistency between predicted values and practical measured experimental data. Factor‑influence rank for acteoside yield: slice thickness > drying temperature > steaming time. Factor‑influence rank for echinacoside yield: steaming time > drying temperature >debljina kriške.

Putem matematičkog proračuna modela, teoretski optimalni parametri obrade bili su: debljina kriške 0,600 cm, vrijeme obrade na pari 5,685 min, temperatura sušenja 57,009 stupnjeva. Uzimajući u obzir stvarnu izvedivost industrijskog rada, parametri su podešeni na debljinu kriške 0,6 cm, vrijeme kuhanja na pari 6 minuta, temperaturu sušenja 57 stupnjeva. Provedena su tri paralelna validacijska eksperimenta. Pod ovim praktičnim uvjetima, izmjereni sadržaj akteozida iznosio je 7,25 %, a sadržaj ehinakozida dosegao je 31,62 %. Odstupanje između izmjerenih vrijednosti i teoretskog predviđanja ostalo je ispod 5 %, što dokazuje da je ovaj model površine odziva bio pouzdan i primjenjiv za vođenje proizvodnje dekokcija u stvarnom svijetu.

3.3 Provjera citotoksičnosti optimiziranih-obrađenihCistanche tubulosaEkstrakt u ćelijama RAW264.7

Rezultati citotoksičnosti MTT-a otkrili su da koncentracija ekstrakta u rasponu od 0-100 ug/mL nije imala očigledan toksični učinak na makrofage RAW264.7, te je čak pokazala blagu tendenciju poticanja stanične proliferacije. Kada se koncentracija tretmana popela na 200 ug/mL i 400 ug/mL, stopa preživljavanja stanica značajno se smanjila u usporedbi s kontrolnom skupinom s otapalom, pokazujući citotoksičnost ovisnu o koncentraciji. Stoga su gradijenti koncentracije od 12,5 ug/mL, 25 ug/mL, 50 ug/mL, 100 ug/mL odabrani kao sigurne radne koncentracije za naknadne stanične analize povezane s oksidativnim stresom i upalom.

3.4 Cistanche tubulosaEkstrahirajte smanjenu unutarstaničnu razinu ROS-a u LPS-stimuliranim makrofagima

U usporedbi s kontrolnom skupinom s otapalom, intracelularni ROS fluorescentni intenzitet skupine LPS-modela izuzetno se značajno povećao (\\(P<0.001\)), confirming successful construction of cellular oxidative‑damage model. After intervention with gradient‑concentration Cistanche tubulosaekstrakta, unutarstanična akumulacija ROS-a smanjena je na način ovisan o dozi. Svaka skupina liječena lijekovima pokazala je statistički značajno smanjenje ROS-a u odnosu na skupinu modela LPS (\\(P<0.001\)). This finding demonstrated that processed‑herb extract could effectively restrain excess ROS generation under inflammatory stimulation.

3.5 Učinci na sadržaj NO i MDA

NO služi kao klasični upalni posrednik kojeg oslobađaju aktivirani makrofagi. MDA je zlatni standardni biomarker koji odražava oksidacijsku ozljedu lipidne peroksidacije. U usporedbi s kontrolnom skupinom otapala, stimulacija LPS-om značajno je povećala sadržaj NO i MDA u stanicama RAW264.7 (\\(P<0.001\)). Different dosages of Cistanche tubulosatretman ekstraktom mogao bi značajno smanjiti koncentraciju NO. Za pokazatelj MDA: skupina s 12,5 ug/mL nije dovela do statistički značajnog poboljšanja; Koncentracijske skupine od 25-100 ug/mL vidljivo su smanjile razinu MDA (\\(P<0.001\)). The results illustrated that extracts alleviated LPS‑triggered lipid‑peroxidation injury and inflammatory‑mediator over‑production.

3.6 Utjecaj na biokemijske pokazatelje povezane s antioksidansima SOD, CAT, LDH, GSH

Nakon izazivanja LPS-om, unutarstanična enzimska aktivnost SOD, CAT, LDH kao i sadržaj GSH naglo je pao u odnosu na kontrolnu skupinu s otapalom (\\(P<0.001\)). Low‑dose (12.5 μg/mL) extract treatment could significantly raise SOD activity, but failed to generate prominent changes for CAT and LDH activity. Medium‑and‑high concentration groups (25 μg/mL, 50 μg/mL, 100 μg/mL) concentration‑dependently enhanced SOD, CAT, LDH enzyme activities and intracellular GSH content (\(P<0.001\)). It indicated that optimally‑processed Cistanche tubulosaekstrakti decoction-piece mogli bi obnoviti staničnu endogenu antioksidacijsku obrambenu sposobnost protiv oksidativnih insultacija izazvanih LPS-om.

3.7 Inhibicijski učinak na otpuštanje pro-upalnih citokina TNF-, IL-1, IL-6

Rezultati ELISA detekcije pokazali su da LPS stimulacija snažno potiče izlučivanje TNF‑, IL‑1, IL‑6 iz RAW264.7 makrofaga (\\(P<0.001\)). With the increase of Cistanche tubulosakoncentracije ekstrakta u liječenju, količina otpuštanja ova tri ključna proupalna citokina bila je progresivno potisnuta, pokazujući jasnu korelaciju doza-odgovor. Potvrđeno je da biljni ekstrakt ima snažno protuupalno djelovanje obuzdavanjem izlučivanja proupalnih citokina iz aktiviranih makrofaga.

3.8 Regulacija fosforilacije signalnog puta p38/AKT/JNK/NF‑κB

Eksperimentalni podaci Western-blot-a pokazali su da su omjeri p-p38/p38, p-AKT/AKT, p-JNK/JNK i p-NF-κB/NF-κB bili značajno povišeni u skupini LPS-modela u odnosu na kontrolnu skupinu s otapalom (\\(P<0.001\)). Medium‑and‑high‑dosage Cistanche tubulosaintervencija ekstrakta značajno je smanjila omjer p-p38/p38 i p-JNK/JNK (\\(P<0.001\)). All concentration‑treatment groups obviously down‑regulated p‑AKT/AKT and p‑NF‑κB/NF‑κB phosphorylation level (\(P<0.05\) or \(P<0.001\)). These observations proved that Cistanche tubulosaEkstrakt decoction-piecea ublažio je oksidativno-upalnu ozljedu suzbijanjem hiperfosforilacijske aktivacije p38/AKT/JNK/NF‑κB signalne mreže.

4. Rasprava

Zahtjevi tradicionalne obrade zabilježeni u Kineskoj farmakopeji zaCistanche tubulosauglavnom uključuju uklanjanje nečistoća, pranje, vlaženje, rezanje i sušenje, bez navođenja preciznih numeričkih parametara za debljinu kriški, trajanje kuhanja na pari i temperaturu sušenja. Nestandardna ručna obrada dovodi do velike fluktuacije kvalitete komercijalnih decoction-piece proizvoda. Feniletanoidni glikozidi (ehinakozid i akteozid) termički su labilni bioaktivni spojevi. Neodgovarajuće vrijeme ili temperatura zagrijavanja potaknut će kemijsku razgradnju i smanjiti ljekovitu vrijednost. Naši eksperimenti s jednim faktorom otkrili su da bi i nedovoljno i pretjerano kuhanje na pari, kao i previsoka temperatura sušenja uzrokovali gubitak ciljnih komponenti glikozida. Daljnjom višefaktorskom optimizacijom Box‑Behnken dobiveni su praktični proizvodni parametri: debljina kriške 0,6 cm, kuhanje na pari 6 minuta, sušenje na 57 stupnjeva. Pod ovim uvjetima, sadržaj akteozida i ehinakozida dosegao je 7,25 % i 31,62 %, daleko premašujući farmakopejski minimalni prag kvalitete. Ovaj optimizirani protokol pruža izvedive kvantitativne tehničke reference za standardiziranu industrijsku obradu podrijetlom iz XinjiangaCistanche tubulosa.

Oksidativni stres i upala usko su povezani patološki procesi. Višak ROS-a inducira peroksidaciju lipida i stvara MDA, što dodatno aktivira makrofage prirodnog imuniteta. Aktivirani makrofagi luče obilno NO i višestruke proupalne citokine, koji obrnuto pojačavaju unutarstaničnu proizvodnju ROS, tvoreći samopojačavajući oksidativno-upalni začarani krug. Prirodne antioksidativne tvari biljnog podrijetla mogu prekinuti ovu patološku petlju podizanjem endogenog enzimskog sustava antioksidansa i obuzdavanjem transdukcije upalnog signala. U ovoj in-vitro studiji, optimalno obrađenCistanche tubulosaekstrakti decoction-piece-a snizili su razine ROS-a, NO-a i MDA-a, dok su povećali aktivnosti SOD-a, CAT-a, LDH-a i sadržaj GSH-a u makrofagima RAW264.7 stimuliranim LPS-om. Istovremeno je inhibirao izlučivanje proupalnih citokina TNF‑, IL‑1, IL‑6, pokazujući integrirani antioksidativni stres i protuupalni kapacitet.

Molekule obitelji protein-kinaze aktivirane mitogenom p38, JNK zajedno s AKT i NF-κB sačinjavaju središnje središte prijenosa signala koje posreduje u upalno-oksidativnim odgovorima makrofaga. Nakon stimulacije LPS-om, uzvodni signal pokreće aktivaciju fosforilacije p38, JNK i AKT, što sekvencijalno potiče fosforilaciju podjedinice NF-κB p65 i translokaciju jezgre. Aktivirani NF‑κB djeluje kao faktor transkripcije i pokreće transkripciju velikih serija proupalnih citokina i gena povezanih s oksidativnim stresom. Naši rezultati Western-blota su to pokazaliCistanche tubulosaekstrakt mogao suzbiti fosforilaciju p38, JNK, AKT i NF‑κB p65. Stoga zaključujemo da se njegova antioksidacijska stresna i protuupalna bioaktivnost postižu, barem djelomično, blokiranjem prekomjerne aktivacije p38/AKT/JNK/NF-κB signalne osi.

Postoji nekoliko ograničenja unutar trenutnog istraživanja. Sve funkcionalne provjere ograničene su na in vitro razinu stanične kulture. Potrebni su daljnji in vivo eksperimenti na životinjskim modelima kako bi se potvrdila in vivo farmakodinamička izvedba optimiziranih dijelova dekokcije. Osim toga, ova je studija usvojila ukupni miješani ekstrakt iz uvarka, tako da ne možemo razlikovati pojedinačni doprinos ehinakozida, akteozida i drugih manjih sekundarnih metabolita. Naknadna istraživanja mogu izolirati monomerne spojeve kako bi se usporedila odgovarajuća antioksidacijska snaga stresa i provelo istraživanje učinka kompatibilnosti. Unatoč tome, naš sadašnji rad još uvijek pruža praktične tehnološke parametre obrade i preliminarne mehaničke dokaze za razvojCistanche tubulosapovezani proizvodi za zdravstvenu njegu.

5. Zaključak

Zaključno, modernizirani radni tijek obrade optimiziran Box-Behnken metodologijom odzivne površine (debljina kriške 0,6 cm, kuhanje na pari 6 minuta, temperatura sušenja 57 stupnjeva) može značajno povećati sadržaj akteozida i ehinakozidaCistanche tubulosakomadići odvarka. Ekstrakti pripremljeni od ovih optimalno obrađenih biljnih kriški pokazuju istaknuti antioksidativni stres i protuupalne učinke protiv oštećenja makrofaga RAW264.7 izazvanih LPS-om. Temeljni mehanizam povezan je s obnavljanjem intracelularnog antioksidativnog obrambenog sustava i inhibicijom prekomjerne aktivacije p38/AKT/JNK/NF‑κB upalnog signalnog puta. Ova studija pruža čvrstu eksperimentalnu osnovu za standardiziranu industrijsku proizvodnju i iskorištavanje funkcionalne hraneCistanche tubulosasredstva.

Reference

Lin J, Yu H, Zhao Y, et al. Ekstrakcija ehinakozida izCistanche tubulosa(Schenk) R. Wight i istraživanje njegovog zaštitnog učinka na ozljedu jetre kod štakora sa sepsom. Food Sci Technol, 2023, 43:e010523.

Guo J, Tang S, Miao Y, et al. Protuupalni učinci lignanskih glikozida izCistanche tubulosaproizlazi iz stanica makrofaga RAW264.7 izazvanih LPS/IFN‑ preko PI3K/AKT puta. Current Pharmaceutical Biotechnology, 2021, 22(10):1380-1391.

Rani V, Deep G, Singh RK, et al. Oksidativni stres i metabolički poremećaji: Patogeneza i terapijske strategije. Life Sciences, 2016, 148:183-193.

Park JH, Kim JH, Jang S I. Protuupalni dise-necionil cis-kelakton u LPS-stimuliranim RAW264.7 stanicama i njegova inhibitorna aktivnost na topivu epoksid hidrolazu. Heliyon, 2023,9(10):e21032.

Chung YC, Song S J. Isobavachin ublažava upalne odgovore izazvane lipopolisaharidima u makrofagima potiskivanjem MAPK i NF-κB signalnih putova. Journal of Ethnopharmacology, 2024,321:117501.

He X, Li Y, Deng B. PI3K/AKT signalni put kod upale, stanične smrti i stvaranja glijalnog ožiljka nakon traumatske ozljede leđne moždine. Proliferacija stanica, 2022, 55 (9): e13275.