Kvantitativna procjena upalnih infiltrata u biopsijama transplantata bubrega korištenjem pojačanja multipleksnog tiramidnog signala i dubokog učenja

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valerij Volk²Jan Hinrich Bräsen²et al

Sažetak

Odgođena funkcija presatka (DGF) snažan je čimbenik rizika za razvoj intersticijske fibroze i tubularne atrofije (IFTA) kod transplantata bubrega. Kvantitativna procjena upalnih infltrata u biopsijama bubrega pacijenata s DGF-om može otkriti prediktivne markere za razvoj IFTA-e. U ovoj smo studiji kombinirali multipleksno pojačanje tiramidnog signala (mTSA) i konvolucijske neuralne mreže (CNN) kako bismo procijenili upalno mikrookruženje u biopsijama bubrega pacijenata s DGF-om (n=22) uzetih 6 tjedana nakon transplantacije. Pacijenti su stratificirani za razvoj IFTA-e (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

Uvod

Odgođena funkcija presatka (DGF) nakon transplantacije bubrega je multifaktorijalna i uglavnom povezana s karakteristikama davatelja i vremenom ishemije. DGF se općenito opisuje kao potreba za dijalizom unutar 7 dana nakon transplantacije i snažan je čimbenik rizika za kroničnu ozljedu presatka bubrega [1-3]. Klasična komponenta kronične ozljede bubrega je prisutnost intersticijske fibroze i tubularne atrofije (IFTA). Međutim, ne napreduju svi pacijenti s DGF-om do razvoja IFTA-e, a složeni odnos između DGF-a i IFTA-e još uvijek je slabo shvaćen. To je prvo zbog vremenskog odmaka između potencijalno uzročnih događaja i funkcionalnog pada, a drugo zbog promjenjivih i složenih učinaka potencijalnih induktora kao što su odbacivanje i nuspojave lijekova [1, 4]. Opća prisutnost upale i specifičnih makrofaga opisana je u brojnim studijama kao prediktor gubitka presatka [5-8]. Međutim, temeljni patološki procesi nisu u potpunosti shvaćeni, a visoke razine upale ne dovode uvijek do dugotrajnog gubitka presatka. Kao rezultat podražaja iz okoline, makrofagi poprimaju specijalizirane funkcije i polariziraju se u različite fenotipove. Brojne studije pokazuju da su specifični podtipovi makrofaga (alternativno aktivirani makrofagi) uključeni u remodeliranje tkiva inducirajući popravak tkiva ili fibrozu. Poznato je da polarizacija prema fenotipu remodeliranja tkiva (ponekad profibrotičnog) ovisi o širokom rasponu podražaja iz okoline, među ostalima koje osiguravaju podtipovi T-helper limfocita [9-11]. Procjena populacija stanica T-pomagača u presatku u vrijeme DGF-a otkrila je prevladavajući podtip T-pomagača 1, ali korelacije s ishodom presatka ili progresijom do IFTA-e do sada nisu istražene [12]. Sveobuhvatna procjena upalnog mikrookruženja posebno usmjerena na makrofage i podskupove T-pomagačkih stanica u pažljivo odabranim skupinama pacijenata mogla bi dati uvid u to zašto neki, ali ne svi pacijenti s DGF-om napreduju do razvoja IFTA-e.

Međutim, sveobuhvatno istraživanje upalnih infltrata otežano je nekoliko (tehničkih) ograničenja. Tradicionalne tehnike imunohistokemije (IHC) i imunofluorescencije podržavaju vizualizaciju samo ograničenog broja staničnih markera u jednom tkivnom presjeku. Serijski rezovi malih, vrijednih fragmenata tkiva kao što su biopsije bubrega nisu poželjni i tumačenje odnosa između stanica u različitim rezovima je teško. Osim toga, kvantitativna procjena upalnih infiltrata vizualnom procjenom dolazi sa značajnom razinom varijabilnosti između promatrača [13]. Tradicionalne tehnike obrade slike kao što su pragovi piksela, razvodnjavanje i segmentacija temeljena na morfologiji oslanjaju se na prethodno znanje o svim morfološkim reprezentacijama stanica i intenzitetu mrlja tkiva kroz skup podataka [14-16]. Stoga ovim metodama često nedostaje robusnost za biološke i tehničke varijacije slika i loše se prevode na nove ili vanjske skupove podataka. Porast digitalne patologije ubrzao je razvoj alternativnih metoda za procjenu slika cijelog slajda (WSI) [17, 18]. Modeli dubokog učenja, konkretno, konvolucijske neuronske mreže (CNN) dokazano su sposobni segmentirati i detektirati relevantne biološke strukture u histopatološkim preparatima [19-23]. Ove tehnike imaju potencijal prelaska sa subjektivne vizualne procjene i tradicionalne obrade slike na točnu, objektivnu i ponovljivu detekciju stanica.

Cilj ove studije je razviti metodu za objektivnu, kvantitativnu procjenu višestrukih biljega upalnih stanica, zaobilazeći potrebu za opsežnim serijskim rezovima na stakalcima. Da bismo to učinili, kombiniramo multipleks IHC, multi-spektralne slike i modele dubokog učenja. Kako bismo pokazali primjenjivost ovih tehnika, proučavamo korelacije upalnog mikrookruženja, kvantificiranog modelima dubokog učenja, s razvojem IFTA-e u nadzornim biopsijama presatka pacijenata s DGF-om.

ekstrakt cistanche za liječenje bolesti bubrega

Materijali i metode

Kako bismo procijenili upalno mikrookruženje u biopsijama bubrega pacijenata s DGF-om, izveli smo multipleks IHC na biopsijama za nadzor uzetih 6 tjedana nakon transplantacije. Pacijenti su stratificirani za razvoj IFTA-e (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Uzorci tkiva

Koristili smo nadzorne biopsije primatelja presađenog bubrega na Medicinskom fakultetu u Hannoveru (Hannover, Njemačka), dobivene u kontekstu prospektivnog programa nadzorne biopsije. Kriteriji uključivanja bili su: pojava DGF-a (definiran kao<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

IFTA procjena

Opseg intersticijske fibroze (ci) i tubularne atrofije (ct) (IFTA) nakon 6 tjedana i 6 mjeseci, izražen korištenjem Banffovog sustava ocjenjivanja lezija [24], dobiven je iz patološkog izvješća. Kako bi se detaljnije procijenio odnos između ranih upalnih inflitarata i razvoja IFTA-e, sva stakalca obojena PAS-om digitalizirana su za ponovno ispitivanje pomoću Pannoramic 250 Flash II digitalnog skenera za slajdove (3DHistech, Mađarska) s 20 × objektiv pri razlučivosti od 0,24 μm/ pikselu. PAS WSI obje vremenske točke (6 tjedana i 6 mjeseci) ocjenjivala su tri bubrežna patologa za opseg IFTA (postotak površine, s intervalima od 10 posto). Srednji IFTA rezultati patologa korišteni su kao konačni rezultat za izračunavanje promjene u IFTA između 6 tjedana i 6 mjeseci nakon transplantacije. Pacijenti su stratificirani prema apsolutnom povećanju IFTA rezultata od 10 posto ili više (n=13) i bez ili<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Osim toga, rezultati Banffovih lezija uspoređeni su između vremenskih točaka korištenjem Wilcoxonovog testa rangiranja s predznakom. Ovo je otkrilo značajne razlike između biopsija nakon 6 tjedana i 6 mjeseci za Banffove kategorije ti (p=0.017), ci (p=0.004) i ct (p=0.011) .

Multiplex TSA bojanje

Proveli smo multipleksnu IHC pomoću mTSA za vizualizaciju višestrukih staničnih markera u biopsijama od 6 tjedana. Nakon inkubacije s primarnim i sekundarnim protutijelom, tkivo je tretirano fluorescentno obilježenim tiramidom. Peroksidaza hrena iz sekundarnog antitijela katalizira stvaranje aktivnih tiramidnih radikala. Tiramidni radikali kovalentno se vežu za tirozinske ostatke na antigenu. Ovo trajno vezanje omogućilo je toplinom izazvano uklanjanje primarno-sekundarnog kompleksa protutijela uz očuvanje taloga fluorescentnog tiramida [25]. To je omogućilo kasniju uzastopnu inkubaciju s daljnjim protutijelima iste vrste protiv ciljanih antigena.

mTSA je izveden na dva uzastopna slajda iz 6 tjedana nadzornih biopsija. Razvili smo dva panela mTSA za procjenu upalnog infiltrata i proširenosti peritubularnih kapilara u našim skupinama pacijenata. Panel I je postojao od anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 i CD34 antitijela. Panel II korišten je za ispitivanje polarizacije T-pomoćnih stanica i makrofaga korištenjem anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 i CD163 protutijela. Specifikacije protutijela, razrjeđenja i redoslijed bojenja navedeni su u Dodatnoj tablici 1. Sva stakalca su deparafinizirana u ksilenu, dehidrirana u 95 postotnom etanolu, isprana u vodi iz slavine i kuhana za dobivanje epitopa u 10x razrijeđenom trisborat-EDTA (TBE 10x , 0658, VWR Life Sciences, US) međuspremnik. Nakon hlađenja, stakalca su isprana u 3-postotnoj otopini vodikove peroksidaze za blokiranje endogene peroksidaze i isprana tris-puferiranim slanim puferom s 0,05 posto Tween 20 (822184, Merck KGaA, Njemačka) (TBS-T). Blokiranje proteina provedeno je pomoću TBS-T s 1 posto goveđeg serumskog albumina (BSA) (mTSA korak 1). Primarna antitijela su inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi ili preko noći na četiri stupnja Celzijusa (mTSA korak 2). Nakon ispiranja u TBS-T, stakalca su inkubirana s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelom (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Nizozemska) 30 minuta na sobnoj temperaturi (mTSA korak 3). Zatim je proveden TSA korištenjem Opal TSA fluorofora iz Opal 7-color Manual IHC kompleta (NEL811001KT, Akoya Biosciences, SAD) (mTSA korak 4) (fluorofori i njihova odgovarajuća antitijela navedeni su u Dodatnoj tablici 1). Kompleks antitijelo-TSA uklonjen je ciklusom vrenja u TBE puferu (mTSA korak 5). Koraci 1–5 mTSA ponavljani su sve dok stakalca nisu bila obojena svim protutijelima s dotične ploče. Stakalca su prekrivena fluoromount-G s DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, US).

herba cistanche

Multiplex TSA validacija

Ponovljeni ciklusi vrenja mogu utjecati na afinitet ciljnog epitopa. Neka antitijela pokazuju slabiji uzorak bojenja nakon što se tkivo više puta prokuha, druga antitijela trebaju više ciklusa kuhanja kako bi postigla optimalan intenzitet bojenja, a na druga to uopće ne utječe. Procijenili smo ovaj učinak za sva protutijela koristeći kromogeni IHC na FFPE kontrolnom tkivu krajnika. Za svako testirano antitijelo (n=9) izrezano je šest sekcija (debljine 4 μm). Sva stakalca su deparafinizirana u ksilenu, dehidrirana u 95 postotnom etanolu, isprana u vodi iz slavine i kuhana za dobivanje epitopa u 10x razrijeđenom TBE (prvi ciklus vrenja). Nakon hlađenja, jedno stakalce po testiranom anti-tijelu pohranjeno je u fosfatnom puferu (PBS). Preostali slajdovi ponovno su kuhani. Ovaj ciklus je ponovljen pet puta. Sva stakalca su zatim isprana u 3 postotnoj otopini vodikove peroksidaze i isprana u PBS. Primarna antitijela (dopunska tablica 1) su inkubirana 1 sat na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije stakalca su isprana u PBS-u. Za slajdove obojene anti-CD68, Tibet i GATA3 antitijelima bila je potrebna dodatna inkubacija uz blokiranje nakon antitijela (PAB) tijekom 15 minuta (blokiranje VWRKDPVB, Immunologic, Nizozemska). Nakon inkubacije stakalca su isprana u PBS-u i inkubirana s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelom (nakon PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nizozemska, za ostale pogledajte dodatnu tablicu 1 za sekundarna protutijela). Vizualizacija je provedena korištenjem 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nizozemska). Rezultati su vizualizirani na Dodatnoj slici 1. Na temelju tih rezultata odredili smo optimalni redoslijed antitijela za eksperimente s mTSA, kako je navedeno u Dodatnoj tablici 1.

Ako su epitopi od interesa ko-lokalizirani, naslage tiramida mogu interferirati jedna s drugom. Kako bismo testirali ovu steričku inhibiciju, upotrijebili smo slajdove kontrolnog tkiva krajnika i obojili ih našim mTSA pločama. Ekspresija antitijela u mTSA uspoređena je s onom u jednostruko obojenim stakalcima, koja su prošla kroz isti broj ciklusa kuhanja. Nismo uočili razlike u obrascima bojenja između jednostruko i višestruko obojenih stakalca (primjeri uključeni s ploče I, dodatne slike 2 i 3). Sva primarna antitijela u mTSA korištena su u istom razrjeđenju koje je korišteno za kromogeni IHC. Intenzitet fluorescentnog signala optimiziran je podešavanjem razrjeđenja otopine TSA.

Multiplex TSA snimanje

Multispektralno snimanje provedeno je korištenjem Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, SAD) s 20x objektivom, pri razlučivosti od 0,49 μm po pikselu i korištenjem DAPI, FITC, CY3, Texas Red i Cy5 spektralne kocke. Sustav Vectra omogućuje ručni odabir regija za multispektralno snimanje, koje sustav naknadno dijeli na pločice (Slika 1.1). Spektri auto-fluorescencije i svi Opal TSA fluorofori prethodno su snimljeni u spektralnu "biblioteku" pomoću softvera Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, SAD). Spektralna biblioteka omogućila je dekompoziciju multipleksne pločice u više pojedinačnih pločica koje predstavljaju doprinos svakog fluorofora ("odvajanje"). To je rezultiralo jednobojnim, višekanalnim pločicama, od kojih svaki kanal odgovara jednom fluoroforu, a time i protutijelu (slika 1.2).

Pretvorba u IHC umjetnog svijetlog polja

Na temelju pohranjenih koordinata, pločice su spojene kako bi se stvorio višekanalni WSI pomoću prilagođene python skripte (Slika 1.3). Kanali koji predstavljaju DAPI signal (IDAPI) i kanali koji predstavljaju jedno od protutijela (IIHC) pretvoreni su u umjetno bojenje hematoksilinom i DAB (slike 1.4 i 1.5). Na temelju poznatog kromatskog hematoksilina i DAB Cx, Cy koordinata nakon transformacije nijanse-zasićenosti-gustoće (HSD), vektori mrlja dobiveni su u prethodnim studijama [26, 27]. Ovi vektori mrlja korišteni su za izračunavanje crveno-zeleno-plavih vrijednosti za IHC umjetnog svijetlog polja (Sl. 1.5), kao:

s CR, st apsorpcija svjetlosti boje st u crvenom dijelu spektra. Vrijednosti za B i G izračunate su na sličan način.

Analiza slike

Regije interesa (ROI)

Regije od interesa (ROI) označene su za svaki slučaj u kohorti pomoću softvera platforme za automatiziranu analizu slajdova (ASAP; verzija 1.9, dostupna kao softver otvorenog koda na GitHubu). Ti su se ROI sastojali od kortikalnog tubulointersticija, isključujući kapsulu, glomerule i arterije. Budući da se upala u bubrežnim subkapsularnim regijama smatra nespecifičnom u transplantacijskoj patologiji, biopsije u ovoj studiji prvenstveno su analizirane isključujući subkapsularnu regiju (definiranu kao 400 µm ispod kapsule). Sekundarno, ponovili smo analize uključujući subkapsularnu regiju. Vizualni primjeri ROI-a uključeni su u Dodatnu sliku 4.

Detekcija limfocita CNN I

IHC slike umjetnog svijetlog polja koje predstavljaju CD3, CD4, CD8 i CD20 bojenje analizirane su pomoću postojećeg CNN-a s U-Net arhitekturom [22, 28]. Ova mreža je posebno dizajnirana za detekciju citoplazmatskih limfocitnih markera u IHC. Izvedba CNN-a može se izraziti u preciznosti, prisjećanju i rezultatu F1-, gdje:

CNN je postigao preciznost od {{0}}.76, opoziv od 0.79 i F1-rezultat od 0.78 na testu koji je korišten u izvornom radu, koji se sastoji od tradicionalnog IHC WSI. Detekcija pojedinačnih pozitivnih stanica zahtijeva postavljanje praga CNN izlaza, nakon čega slijedi naknadna obrada. Budući da je bojanje CD3 u ploči mTSA bilo jače u usporedbi s CD4, CD8 i CD20, korišten je niži prag detekcije objekta za posljednja tri (0,4) i originalni prag detekcije objekta za CD3 (0,7). Za procjenu učinka CNN-a na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem u ovoj studiji, četiri IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem (CD8 i CD20 od dva pacijenta) korištena su kao testni set u ovoj studiji. Točkasti komentari (n=1115) generirani su pomoću ASAP softvera. Nakon primjene mreže izračunati su preciznost, prisjećanje i F1- rezultat za procjenu performansi CNN-a. Otkrivanja su se smatrala istinski pozitivnima ako su pronađena unutar 4 µm (prosječni promjer limfocita) od temeljne napomene istine. Kada su pronađene dvije detekcije unutar raspona od 4 µm, samo detekcija koja je bila najbliža oznaci smatrana je stvarno pozitivnom. Nakon toga, detekcija limfocita CNN I korištena je za analizu svih IHC WSI umjetnih svijetlih polja koji predstavljaju markere citoplazmatskih limfocita (CD3, CD4, CD8 i CD20).

Detekcija limfocita CNN II

Analiza IHC WSI umjetnog svijetlog polja s obrascima bojenja jezgre (kao što su predstavili T-bet i GATA3) kanali koji predstavljaju DAPI i CD4 odabrani su za kombiniranje u jednom WSI (4). Vektori mrlja dobiveni u prethodnim studijama korišteni su za umjetno bojanje DAPI signala u plavo (hematoksilin) ​​i CD4 signala u smeđe (DAB), što je rezultiralo umjetnim svijetlim poljem IHC WSI (5).

potrebna obuka, validacija i testiranje novog CNN-a. U tu svrhu, devet slajdova je izrezano iz kontrolnog tkiva bubrega, krajnika i slijepog crijeva FFPE. Ovi slajdovi su obojeni IHC-om s anti-Tibet (klon 4B1{{10}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, SAD) i anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nizozemska) antitijela. Slajdovi su digitalizirani pomoću Pannoramic 250 Flash II digitalnog skenera slajdova u razlučivosti od 0,12 μm/pikselu. Dva promatrača izradila su bilješke od 5726 točaka u različitim regijama koristeći ASAP softver. Bilješke s pet slajdova korištene su za obuku U-Net arhitekture CNN koristeći zakrpe od 256 × 256 piksela s veličinom piksela od 0,49 μm/ pikselu. Dva WSI su korištena za validaciju CNN-a i za određivanje praga detekcije objekta (0,4). Izvedba CNN-a na tradicionalnom IHC WSI procijenjena je na uskraćenom testu od dva IHC WSI. Učinak CNN-a na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem procijenjen je na sekundarnom ispitnom setu koji se sastoji od četiri IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem (Tibet i GATA3 od dva pacijenta) s komentarima od 1082 točke. Preciznost, prisjećanje i F1-rezultat izračunati su kako bi se procijenila izvedba na oba skupa testova. Detekcije su se smatrale istinski pozitivnima ako su pronađene unutar 4 µm od prizemne oznake istine. Kada su pronađene dvije detekcije unutar raspona od 4 µm, samo detekcija koja je bila najbliža oznaci smatrana je stvarno pozitivnom. Nakon toga, detekcija limfocita CNN II korištena je za analizu svih IHC WSI umjetnih svijetlih polja koji predstavljaju nuklearne (limfocitne) markere (Tibet i GATA3).

Detekcija makrofaga CNN

Za razliku od detekcije limfocita, identifikacija pojedinačnih makrofaga nije jednoznačna. Osobito u grupiranim scenama može se očekivati ​​značajna razina varijabilnosti promatrača. Stoga je mnogo veći broj slučajeva i ljudskih bilješki korišten za obuku namjenskog, trećeg CNN-a za detekciju CD68 plus i CD163 plus makrofaga. Prikupljena su IHC-obojana stakalca (n=111) iz nativnog i presađenog bubrežnog tkiva. IHC bojenje provedeno je pomoću anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Danska ili klon KP1, M0876, Dako, Danska) ili anti-CD163 (klon MRQ -26, ili 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) antitijela. IHC slajdovi digitalizirani su pomoću panoramskog 250 Flash II digitalnog skenera za slajdove ili Aperio AT2 Slide Scannera (Leica Biosystems, Wetzlar, Njemačka) u razlučivosti od 0.24 ili 0 .25 μm/pikselu. Četiri promatrača proizvela su 37 709 bilješki s točkama na više ROI u WSI-ovima, koristeći protokol za oznaku makrofaga, koji je dogovoren nakon početnih pilot eksperimenata. Bilješke sa 101 slajda korištene su za obuku YoloV2 arhitekture CNN [29]. Yolo je posebno prikladan za zadatke usmjerene na zadatke otkrivanja. Mreža, koja se sastoji od sedam konvolucijskih slojeva, trenirana je na mrljama od 256 × 256 piksela ekstrahiranih pri rezoluciji od 0,98 μm/pikselu s graničnim okvirima od 21 μm (na temelju prosječne veličine makrofaga). Deset WSI korišteno je za validaciju CNN-a i za određivanje praga detekcije objekta (0,45) i parametara ne-maksimalne supresije (0,05). Izvedba CNN-a na tradicionalnom IHC WSI procijenjena je na uskraćenom testu od deset IHC WSI. Učinak CNN-a na IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem procijenjen je na sekundarnom ispitnom setu koji se sastoji od četiri IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem (CD68 i CD163 od dva pacijenta) s komentarima od 1033 točke. Preciznost, prisjećanje i F1 rezultati izračunati su za procjenu izvedbe na oba testa. Otkrivanja su se smatrala istinski pozitivnima ako su pronađena unutar 21 µm (prosječni promjer makrofaga) od temeljne napomene istine. Kada je pronađeno više detekcija unutar raspona od 21 µm, samo detekcija koja je bila najbliža napomeni smatrala se istinski pozitivnom. Nakon toga, detekcija makrofaga CNN korištena je za analizu svih IHC WSI umjetnih svijetlih polja koji predstavljaju markere makrofaga (CD68 i CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dupla pozitivnost

Pozitivnost stanica za dva markera (dvostruka pozitivnost) procijenjena je određivanjem broja piksela između detekcija stanica u različitim kanalima. Ako je udaljenost između dvije detekcije limfocita bila<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Broj stanica izračunat je unutar ROI-ja, a gustoće stanica temeljene su na broju stanica i površini označenog ROI-ja.

Prostorni odnosi

Automatizirano otkrivanje stanica u WSI-ju omogućuje istraživanje prostornih odnosa između stanica. Određena je srednja najkraća udaljenost (u regijama isključujući subkapsularnu regiju) za CD68 plus stanice i CD3 plus, CD3 plus CD8 plus i CD20 plus stanice u WSI panela I za obje skupine pacijenata, te između CD163 plus stanica i CD4 plus , CD4 plus Tbet plus i CD4 plus GATA3 plus u WSI za obje skupine pacijenata.

Peritubularni kapilarni opseg

Kako bi se procijenio peritubularni kapilarni opseg, nemiješani WSI koji predstavljaju CD34 kanal analizirani su na Fidžiju (ImageJ verzija 2.0.0, SAD, makronaredbe i dodaci: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. Pozitivni pikseli određeni su putem automatskog određivanja praga i naknadno izraženi kao postotak ukupnog broja piksela unutar ROI-ja.

Statistička analiza

Gustoće sljedećih staničnih populacija izračunate su u biopsijama nakon 6 tjedana: T-limfociti (CD3 plus), citotoksični T-limfociti (CD3 plus CD8 plus), B-limfociti (CD20 plus), makrofagi (CD68 plus, ploče I i II), polarizirani makrofagi (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), limfociti T-helper 1 (CD4 plus Tbet plus) i limfociti T-helper 2 (CD4 plus GATA3 plus). Spearmanovi koeficijenti korelacije izračunati su kako bi se procijenilo postoji li korelacija između gustoće limfocita T-helper 1 i T-helper 2 (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) i gustoće polariziranih makrofaga (ili CD68 plus CD163 plus ili CD163 plus). Promatrali smo signal CD68 (fluorofor 540 nm) u umjetnim CD4 (fluorofor 520 nm) IHC panela I. Stoga dodatno izvješćujemo o gustoći stanica za CD3 plus CD8− stanice. Kako bismo procijenili razlike između skupina pacijenata s različitim ishodima IFTA-e, izvješćujemo o srednjim, minimalnim i maksimalnim vrijednostima gustoće stanica po skupini. Značajne razlike u gustoći stanica i opsegu peritubularnih kapilara (definiran kao postotak CD34-pozitivnih piksela) između skupina procijenjene su korištenjem Mann-Whitneyjevog U testa za neovisne uzorke. Pokazuju li pacijenti s različitim ishodima IFTA-e značajno različite omjere CD3 plus CD8-/CD3 plus CD8 plus stanica, procijenjeno je pomoću t-testa za neovisne uzorke. Razlike između skupina pacijenata u prostornim odnosima stanica CD68 plus i CD163 plus s drugim imunološkim stanicama procijenjene su na značajnost korištenjem Mann–Whitneyjevog U testa za neovisne uzorke.

Rezultati

CNN-bazirana detekcija IHC pozitivnih stanica

Kako bi se primijenili postojeći CNN-ovi, koji su izvorno razvijeni za mikroskopiju svijetlog polja, fluorescentne slike mTSA transformirane su u slike umjetnog svijetlog polja. Primjeri regija obojenih mTSA s odgovarajućim IHC slikama umjetnog svijetlog polja uključeni su na sl. 2. Primjer IHC WSI umjetnog svijetlog polja demonstriran je na Dodatnoj slici 4. WSI s više razlučivosti mogu se otvoriti i pregledati u digitalnom dijapozitivu. softver kao što su ASAP i Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Kao što je prikazano na slici 2, IHC WSI umjetnog svijetlog polja bio je prikladan za automatiziranu analizu CNN-ova koji su izvorno razvijeni za tradicionalni IHC WSI.

Tri CNN-a korištena su za kvantitativnu procjenu upalnih stanica u 6-tjednim mTSA-bojanim biopsijama transplantata: za otkrivanje limfocita citoplazmatskim (CNN I) i nuklearnim (CNN II) IHC bojenjem i za otkrivanje makrofaga. Tablica 2 prikazuje performanse CNN-a (rezultati preciznosti, prisjećanja i F1-rezultati) za setove zadržavanja i DAB-bojanih IHC WSI i IHC WSI s umjetnim svijetlim poljem. Učinak CNN-a obično je bio jednako dobar ili bolji od prethodno opisanog osnovnog CNN-a (s F1-rezultatom od 0.78), za koji se pokazalo da ima učinak usporediv s iskusnim ručnim promatračima [22] . Dok je detekcija limfocita CNN II pokazala donekle smanjenu izvedbu na virtualnim slikama svijetlog polja u usporedbi sa stvarnim DAB slikama (na kojima je CNN uvježban), suprotno je uočeno za CNN za detekciju makrofaga.

Primjer uspješne automatske procjene dvostruke pozitivnosti uključen je na slici 3.

Korelacija različitih tipova stanica

Najjača korelacija uočena je između CD4 plus GATA3 plus gustoće stanica i CD163 plus gustoće stanica (Spearmanov koeficijent 0.75, p < 0.001)="" u="" biopsija="" nakon="" 6="" tjedana="" (dodatna="" slika="" 5a).="" ova="" je="" korelacija="" bila="" slabija="" između="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" stanične="" gustoće="" i="" cd163="" plus="" stanične="" gustoće="" (spearmanov="" koeficijent="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (dodatna="" slika="" 5b)="" .="" kada="" se="" stanična="" populacija="" ograniči="" na="" dvostruko="" pozitivne="" makrofage="" (cd68="" plus="" cd163="" plus),="" spearmanov="" koeficijent="" korelacije="" bio="" je="" 0.65="" (p="">< 0,01)="" sa="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" stanice="" i="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" sa="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" stanice="" (dodatna="" slika="" 5c,="" d).="" uključivanje="" subkapsularne="" regije="" u="" analize="" nije="" promijenilo="">

Usporedba upalnih infiltrata izmeđupacijenata koji napreduju na IFTA u odnosu na one koji nisu IFTA

Pacijenti koji su napredovali do IFTA-e nakon 6 mjeseci pokazali su značajno veću gustoću CD163 plus stanica u biopsijama uzetim 6 tjedana nakon transplantacije (medijan 505 stanica/mm2) u odnosu na pacijente koji nisu napredovali do IFTA-e (medijan 370 stanica/mm2; p=0 .043) (tablica 3). Uključivanje subkapsularne regije rezultiralo je blagim smanjenjem ovog učinka (p=0.051). CD68 i CD4 korišteni su u oba panela. Stakalca obojena mTSA panelom I pokazala su više CD68 pozitivnosti nego stakalca obojena mTSA panelom II. Gustoća CD4 stanica veća je u mTSA panelu II u usporedbi s mTSA panelom I (Tablica 3).

Opseg peritubularnih kapilara bio je sličan u 6-tjednim biopsijama pacijenata s DGF-om s različitim ishodima IFTA (tablica 3), i kada se isključi (p=0.74) i uključi (p=0.90) subkapsularna regija iz/u analizi.

Procjena omjera CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus stanica pokazala je znatno viši omjer u bolesnika s<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Srednja najkraća udaljenost od stanica CD68 plus do stanica CD3 plus, CD3 plus CD8 plus i CD20 plus (ploča I) i od stanica CD163 plus do stanica CD4 plus, CD4 plus Tbet plus i CD4 plus GATA3 plus stanica (ploča II) je ne razlikuju se značajno između skupina pacijenata. Rezultati su vizualizirani na slici 4.

ekstrakt cistanke: poboljšava rad bubrega i fizičku snagu

Rasprava

U ovoj smo studiji razvili metodu za točnu i objektivnu kvantifikaciju inflalacijskih staničnih infltrata u biopsijama presatka pacijenata s presađenim bubregom s DGF-om koja zaobilazi opsežno serijsko rezanje materijala biopsije bubrega. U tu smo svrhu kombinirali multipleksni IHC, tiramidno pojačanje signala, multispektralno oslikavanje i kvantifikaciju putem CNN-a. Prvi smo pretvorili multispektralne podatke s pločicama u jednu umjetnu kromogenu sliku po staničnom markeru, olakšavajući WSI analizu i primjenu CNN-ova dizajniranih za IHC svijetlog polja. Dizajnirali smo dva nova CNN-a za detekciju limfocita i makrofaga obojenih jezgrom i pokazali mogućnost generalizacije CNN-a razvijenih na tradicionalnom IHC WSI na IHC WSI umjetnog svijetlog polja. Primjenjivost naše metode demonstrirana je korištenjem kvantitativnih rezultata dobivenih od strane CNN-a za proučavanje korelacija upalnog mikrookruženja u 6-tjednim biopsijama pacijenata s DGF-om s razvojem IFTA-e 6 mjeseci nakon transplantacije.

Koristili smo komercijalno dostupan pribor za ručno bojenje za multiplex IHC za vizualizaciju imunoloških stanica i peritubularnih kapilara u nadzornim biopsijama dobivenim 6 tjedana nakon transplantacije. Postupak višestrukog bojenja sastojao se od višestrukih koraka ispiranja, inkubacije i prokuhavanja tkiva i uključuje nekoliko otopina reagensa. Opsežna validacija metode i kontrola kvalitete stoga su od velike važnosti, a preporučuje se uporaba specifičnih protutijela koja daju dosljedan intenzitet bojenja. Unatoč provedenim koracima validacije, obrasci bojenja nalik na makrofage viđeni su u CD4 kanalima stakalca s mTSA ploča I i II. Ciklusi bojanja CD4 i CD68 nisu izvedeni uzastopno, stoga ovaj fenomen nije mogao biti uzrokovan nepotpunim uklanjanjem antitijela CD68 (dodatna tablica 1). Iako su opisane rijetke pojave dvostruke pozitivnosti makrofaga s CD4 [31], vjerojatnije objašnjenje leži u blizini spektra emisije fluorofora koji su korišteni za vizualizaciju CD4 (520 nm) i CD68 (540 nm), oba pokrivena pomoću FITC filterske kocke fluorescentnog mikroskopa. To može uzrokovati "krvarenje" jakog CD68 signala u CD4 kanal. Velik dio ovog signala bio je isključen iz analize u panelu I jer su samo CD4 plus stanice koje su bile dvostruko pozitivne s CD3 korištene za opću analizu T-pomoćnih stanica. Bez obzira na to, odlučili smo neizravno procijeniti i opće T-pomoćne stanice, koristeći CD3 plus CD8− kao zamjenu. U panelu II, CD4 je korišten isključivo u kombinaciji s Tibetom i GATA3, ograničavajući rizik za korištenje lažno pozitivnih detekcija.

Niža pozitivnost na CD68 primijećena je u panelu II u usporedbi sa panelom I. Pretpostavljamo da je to rezultat steričke inhibicije taloženjem tiramida koji pripada CD163 ("kišobran efekt") [32]. Uočili smo znatno više CD163-pozitivnih stanica u proučavanoj kohorti nego u tkivu krajnika koje je korišteno za provjeru steričke inhibicije, što možda objašnjava zašto ovaj učinak nije otkriven tijekom validacije.

Multiplex IHC je kombiniran s multispektralnim oslikavanjem za ispitivanje mikrookruženja tumora u nekoliko onkoloških studija, a nedavno i za analizu odbacivanja alografta bubrega [33-35]. Kako bi se izdvojio doprinos svih markera u mTSA slajdovima, presjeci se slikaju Vectra sustavom ili sličnim fluorescentnim mikroskopom s multispektralnim postavom. Nakon snimanja pregledne slike s malim povećanjem, sustav Vectra dijeli tkivo na pločice i automatski multispektralno skenira pločice. To rezultira slikovnim pločicama s višestrukim spektrima doprinosa. Budući da su spektri pojedinačnih fluorofora poznati iz unaprijed snimljene spektralne "biblioteke", moguće je razložiti višestruke pločice na više pojedinačnih pločica koje predstavljaju doprinos svakog fluorofora ("odvajanje"). U većini studija nepomiješane slike naknadno se analiziraju komercijalnim softverom. U mnogim slučajevima ti programi ne podržavaju WSI analizu, imaju poteškoća u analizi klasteriranih stanica i često nisu otporni na artefakte i varijacije bojenja. Pretvaranje nepomiješanih pločica u IHC WSI umjetnog svijetlog polja omogućilo nam je primjenu postojećeg CNN-a posebno dizajniranog za otkrivanje limfocita u IHC [22] (naziva se CNN I za otkrivanje limfocita). Ova mreža može detektirati pojedinačne i grupirane limfocite s visokom točnošću dok je otporna na pozadinsko bojenje (Slika 2, CD3). Osim toga, osposobili smo dva nova CNN-a za detekciju stanica s obrascima bojenja jezgre (Tibet, GATA3) (detekcija limfocita CNN II) i za detekciju makrofaga. Poznato je da je makrofage teško otkriti zbog njihovog raštrkanog uzorka bojenja. CNN za otkrivanje makrofaga stoga je obučen korištenjem komentara četiri različita stručnjaka. Prije izrade zabilješki planirano je više sastanaka na kojima se raspravljalo i procjenjivalo kriterije za označavanje makrofaga. To je rezultiralo mrežom koja može detektirati makrofage na reproducibilan način, a istovremeno je robusna za nespecifično bojenje (tablica 2, slika 2 i dopunska slika 6). Koliko znamo, ovo je prvi algoritam za detekciju makrofaga u skeniranim histopatološkim presjecima. Testirali smo performanse sve tri mreže na testnom setu koji se sastojao od tradicionalnih IHC WSI (sličnih onima koji su se koristili tijekom obuke) i na sekundarnom testnom skupu koji se sastojao od IHC WSI umjetnog svijetlog polja, generiranog iz multispektralno snimljenih slika. Svi CNN-ovi pokazuju vrlo dobre rezultate na primarnim skupovima testova i slične F1-rezultate na sekundarnim skupovima testova. Mjerila učinkovitosti detekcije limfocita CNN I izračunata su na normalnom tkivu, artefaktima i klasterima stanica. IHC umjetnog svijetlog polja drugog ispitnog skupa nije sadržavao artefakte tkiva i manje klastera stanica. To može objasniti ukupnu bolju izvedbu ove mreže na drugom testnom skupu. CNN za detekciju makrofaga obučen je i testiran na komentarima četiriju različitih anotatora. Iako se posebno raspravljalo o kriterijima označavanja, ipak su uočene varijacije u stilu označavanja. Osjetljivost CNN-a je stoga vjerojatno negdje u sredini ekstrema stila napomena. Bilješke za drugi testni skup generirao je jedan anotator, koji naizgled odgovara osjetljivosti CNN-a.

Korištenje opisanih CNN-ova omogućilo nam je da istražimo upalni infltrat s preciznošću bez presedana u jedinstvenoj seriji rigorozno odabranih ranih nadzornih biopsija transplantiranih pacijenata s DGF-om.

Nažalost, više uzoraka moralo je biti isključeno iz analize, uglavnom zbog nedovoljno rezidualnog tkiva nakon dijagnostičke obrade. Čak i uz ograničenu veličinu skupa podataka, pronašli smo značajno veću gustoću CD163 plus stanica u biopsijama pacijenata s DGF-om koji su napredovali do razvoja IFTA-e, što je u skladu s potencijalno profibrotičnom ulogom ovih stanica [11]. Dok je promatrani trend bio u skladu s objavljenim podacima, nismo mogli potvrditi štetan učinak rane prisutnosti CD68 plus makrofaga koji su prethodno prijavljeni za druge skupine pacijenata s presađenim bubregom [7, 36, 37]. Pronašli smo pozitivnu korelaciju između gustoća CD4 plus GATA3 plus stanica i CD163 plus stanica, što bi moglo potvrditi doprinos T-helper 2 limfocita prema profibrotičnom mikrookruženju. Iako u ovoj studiji nisu otkriveni nikakvi novi prediktivni biomarkeri za razvoj IFTA kod pacijenata s DGF-om, uspješno smo razvili metode za točnu, ponovljivu i skalabilnu procjenu upalnog inflitarta u rijetkom tkivu kao što su biopsije transplantata. Ove metode su vrijedne za buduće kvantitativne studije upale u histopatološkom tkivu.

Za ublažavanje umora nadbubrežne žlijezde pomoću cistanche kliknite ovdje za više pojedinosti

Dostupnost podataka

Zahtjevi za suradnju koji uključuju korištenje podataka predstavljenih u ovoj studiji mogu se uputiti odgovarajućem autoru (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) ili FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Priznanja

Zahvaljujemo Marku Gorrisu i Kieku Verrijpu na njihovim savjetima o mTSA bojenju i slikanju, Merijn van Erpu na razvoju prilagođene ImageJ funkcionalnosti i Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg i Martijn Ottenu na generiranju osnovne istine za mrežu detekcije makrofaga. Osim toga, zahvaljujemo Irini Scheffner na pomoći u prikupljanju kliničkih podataka.

Autorski priloziMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH i JAWML

osmislio studiju. Materijal pacijenata i kliničke podatke prikupili su i dostavili JS, WG i FF. FF je koordinirao napore u MHH. JHB, EJS i JK su ocijenili PAS slajd za IFTA postotak. MH je izvršio bojenje mTSA, validaciju panela I i II, te snimanje i uklanjanje miješanja panela I. VV snimljen i neizmiješani panel II. DJG je razvio metode za pretvaranje mTSA pločica u WSI umjetnog svijetlog polja. MH je izvršio pretvorbe. ZS-C je razvio CNN za otkrivanje limfocita i napisao skripte za kvantificiranje limfocita. JL je razvio CNN za detekciju makrofaga i napisao skripte za kvantificiranje makrofaga. MH je izvršio kvantifikaciju stanica i kapilara. NSS je izračunao udaljenosti ćelija. MH, BS, LBH i JAWML analizirali su podatke. MH je napravio brojke i nacrtao papir. Konačnu verziju rukopisa revidirali su i odobrili svi autori.

FinanciranjeOvaj je rad podržala inicijativa ERACoSysMed (projekt SysMIFTA) u sklopu Okvirnog programa Europske unije Horizont 2020 koji nudi ZonMw (grant br. 9003035004), uz sufinanciranje njemačkog Ministarstva istraživanja i obrazovanja (BMBF), grant br. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) i FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML je dobio konzultantske naknade od Philipsa (Nizozemska) i potpore od

ContextVision, Philips (Nizozemska) i Sectra (Švedska), izvan dostavljenog rada. JK je dobila financijsku potporu od Nizozemske zaklade za bubrege (projekt DEEPGRAFT, potpora br. 17OKG23).

Usklađenost s etičkim standardima

Sukob interesaAutori izjavljuju da nema suprotstavljenih interesa.

Etičko odobrenje i pristanak za sudjelovanjePrikupljanje podataka i analiza provedeni su uz informirani pristanak pacijenata i uz odobrenje etičkog odbora (br. 2765) Medicinskog fakulteta u Hannoveru.

Napomena izdavačaSpringer Nature ostaje neutralan u pogledu tvrdnji o nadležnosti u objavljenim kartama i institucionalnim vezama.

Otvoreni pristupOvaj je članak licenciran pod međunarodnom licencom Creative Commons Attribution 4.0, koja dopušta korištenje, dijeljenje, prilagodbu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju ili formatu, sve dok izvornom autoru(ima) dajete odgovarajuće priznanje ) i izvor, navedite poveznicu na licencu Creative Commons i naznačite jesu li promjene napravljene. Slike ili drugi materijali trećih strana u ovom članku uključeni su u Creative Commons licencu članka osim ako nije drugačije navedeno u kreditnoj liniji za materijal. Ako materijal nije uključen u Creative Commons licencu članka, a vaša namjeravana uporaba nije dopuštena zakonskim propisima ili premašuje dopuštenu upotrebu, morat ćete dobiti dopuštenje izravno od nositelja autorskih prava.

Reference

1. Siedlecki A, Irish W, Brennan DC. Odgođena funkcija presatka u presađenom bubregu. Am J Transplant. 2011;11:2279-96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Čimbenici rizika dugotrajnog gubitka presatka kod primatelja bubrežnog presatka s kroničnom disfunkcijom alografta. Exp Clin Transplant. 2010; 8: 277-82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh CR. Povezanost između odgođene funkcije presatka i alografta i preživljenja bolesnika: sustavni pregled i meta-analiza. Nephrol Dial transplantacija. 2009;24:1039-47.

4. Schröppel B, Legendre C. Odgođena funkcija presatka bubrega: od mehanizma do translacije. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B, et al. Bodovanje ukupne upale je superiornije od trenutnog Banffovog skora upale u predviđanju ishoda i stupnja molekularnog poremećaja u bubrežnim alograftima. Am J Transplant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

DOKTOR MEDICINE. Predviđanje naknadnog pada funkcije alografta bubrega iz ranih nadzornih biopsija. Am J Transplant. 2005;5:2464-72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z, et al. Uloga makrofaga u razvoju fibroze ljudskog bubrežnog alografta u prvoj godini nakon transplantacije. Am J Transplant. 2014;14:2126-36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M, et al. Alternativno aktivirani makrofagi u patogenezi kronične ozljede alografta bubrega. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007-17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plastičnost makrofaga i interakcija s podskupinama limfocita: rak kao paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889-96.

10. Anders HJ, Ryu M. Bubrežna mikrookoliša i fenotipovi makrofaga određuju progresiju ili povlačenje bubrežne upale i fibroze. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofagi u transplantaciji organa. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. T helper 1, 2 i 17 podskupine stanica u bolesnika s transplantiranim bubregom s odgođenom funkcijom presatka. Transpl Int. 2011;24:233-42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Bodovanje limfocita koji infiltriraju tumor: od vizualne procjene do strojnog učenja. Seminar Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Metoda temeljena na analizi slike za kvantificiranje parametara indeksa kroničnog oštećenja alografta. POJAČALA. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Primjena algoritama vododjelnice na segmentaciju grupiranih jezgri. Citometrija. 1997;28:289-97.

16. Lai YK, Rosin PL. Učinkovit kružni prag. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992-1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Anketa o dubokom učenju u analizi medicinske slike. Med Image Anal. 2017;42:60-88.

18. Madabhushi A, Lee G. Analiza slike i strojno učenje u digitalnoj patologiji: izazovi i prilike. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Dijagnostička procjena algoritama dubokog učenja za otkrivanje metastaza u limfnim čvorovima u žena s rakom dojke. JAMA. 2017;318:2199-210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Histopatološka procjena bubrežnog tkiva temeljena na dubokom učenju. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.