Metilacija proteina arginina: Nova promjena u imunitetu protiv raka i imunoterapiji, 1. dio

Posljednjih godina pojavile su se proteinske arginin metiltransferaze (PRMT) kao novi članovi obitelji regulatora ekspresije gena u eukariota, a povezane su s patogenezom i progresijom raka. Imunoterapija raka značajno je poboljšala liječenje raka u smislu ukupnog preživljenja i kvalitete života. Metilacija proteina arginina je funkcija epigenetske modifikacije ne samo u transkripciji, obradi RNK i kaskadama transdukcije signala, već iu mnogim procesima ciklusa raka-imuniteta. Metilacija arginina uključena je u aktivaciju imuniteta protiv raka i regulaciju učinkovitosti imunoterapije.

U ovom pregledu sažimamo najnovije informacije o regulacijskim molekularnim mehanizmima i različitim signalnim putovima koji leže u pozadini metilacije arginina u urođenim i adaptivnim imunološkim odgovorima tijekom raka. Također ističemo potencijal PRMT inhibitora kao učinkovitih kombinatornih tretmana s imunoterapijom.

Ključne riječi: protein arginin metiltransferaze (PRMTs), imunost protiv raka, imunoterapija raka, posttranslacijska modifikacija, molekularni mehanizam

Click cistanche tubulosa prednostiproizvod

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. UVOD

Posttranslacijska modifikacija je kemijska modifikacija koja povećava funkcionalnu raznolikost proteina kovalentnim dodavanjem kemijske skupine. Proces modulira funkciju proteina i pokazao se ključnim regulatorom višestrukih staničnih procesa kod raka.

Međutim, metilacija arginina, za razliku od acetilacije, ubikvitinacije i fosforilacije, dobivala je malo pozornosti donedavno, uglavnom zbog nestalne prirode detekcije supstrata i nepostojanja pouzdanih protutijela i učinkovitih inhibitora malih molekula. Otkriće proteomike i inhibitora produbilo je naše razumijevanje pisaca, čitatelja i regulatora tijekom metilacije arginina. Proteinske arginin metiltransferaze (PRMT) kataliziraju metilaciju arginina kao "pisci" i uglavnom su uključene u aktivaciju i potiskivanje transkripcije, spajanje prije mRNA i odgovore na oštećenje DNA (1). Metilacija arginina također modulira transkripciju ciljanih lokusa, čime posreduje ključne stanične procese za održavanje homeostaze tkiva i fenotipova bolesti. Budući da je metilacija arginina ciljna modifikacija, inhibitori PRMT-a pokazali su veliki potencijal kao terapija raka u pretkliničkim modelima i kliničkim ispitivanjima, za učinkovito poboljšanje preživljenja pacijenata (2).

Kako su funkcije imunološkog sustava dobro uspostavljene i vitalne za nadzor tumora i liječenje raka, imunoterapije raka koje se brzo razvijaju sada se postavljaju kao četvrti stup liječenja raka (uz kirurgiju, radioterapiju i kemoterapiju) (3).

Imunitet protiv raka obično eliminira tumorske stanice ili ograničava njihov rast, ali također potiče napredovanje tumora uspostavljanjem tumorskog mikrookruženja (TME) koje se prilagođava rastu tumora (4). Unatoč učinkovitosti terapije blokade imunološke kontrolne točke (ICB), manjina pacijenata s uznapredovalim zloćudnim bolestima ima kliničku korist od ovih tretmana, pri čemu većina razvija urođenu ili stečenu otpornost (5).

Stoga su potrebna daljnja istraživanja kombiniranih metoda temeljenih na imunoterapiji kako bi se poboljšalo ukupno preživljenje bolesnika s rakom u uznapredovalom stadiju.

S obzirom da su imunološki odgovori raka kontinuirani, dinamični, strogo regulirani i dobro osmišljeni procesi, supresivni odgovori na imunoterapiju mogu se pripisati nekoliko čimbenika, uključujući TME imunološki fenotip i molekularne mehanizme koji leže u osnovi intrinzične otpornosti tumora (6). Među pitanjima relevantnim za optimalne odgovore na imunoterapiju je svaki korak u nizu kaskadnih procesa pojačanja koji se nazivaju imunološki ciklus raka, međuigra između urođenog i adaptivnog imuniteta kao i aktivacija ili gubitak onkogenih signalnih putova. Klasični ciklus imuniteta protiv raka uključuje ekspresiju i prezentaciju antigena, promet T-stanicama i infiltraciju tumora, te ubijanje ciljnih stanica citotoksičnim T limfocitima (CTL). Urođeni imunitet u potpunosti integrira, održava i pojačava ovaj ciklus. Dok su epigenetski regulatori uključeni u aktivaciju i translokaciju imunoloških stanica u TME, kao i naknadne imunološke odgovore, njihove specifične uloge u tumorskom imunitetu i njihovi kombinirani učinci s imunoterapijom ostaju nejasni (7, 8).

Ovdje pregledavamo funkcije metilacije arginina u imunosti tumora iz tri perspektive: 1) uključenost ciklusa imunosti raka u antitumorske odgovore, 2) proizvodnja interferona tipa I (IFN) i povezani signalni putovi, i 3) intrinzični mehanizmi otpornosti tumora. Koristeći ove perspektive, pružamo dokaze koji naglašavaju nove fiziološke uloge PRMT-a u imunitetu protiv raka i postavljamo pitanje mogu li se inhibitori PRMT-a kombinirati s imunoterapijom kako bi se postigli maksimalni i dugotrajni terapijski učinci kod raka.

2 PRMTS

2.1 PRMT klasifikacija

Metilacija arginina uglavnom se odnosi na dodavanje metilnih skupina iz S-adenozilmetionina (SAM) na gvanidino skupine bočnog lanca arginina, što je katalizirano PRMT-ima (9). Pet potencijalnih donora vodikove veze nalazi se u gvanidino skupini, pri čemu metilacija argininskog ostatka uklanja potencijalnog donora vodikove veze, čime se mijenja oblik argininskog ostatka bez neutraliziranja kationskih naboja i generiranja fizioloških učinaka u većini stanica (10, 11). 

Trenutačno je devet PRMT-ova (PRMT 1-9) identificirano u stanicama sisavaca i podijeljeni su u tri različite skupineprema katalitičkoj aktivnosti: 1) w-NG-monometil arginin (MMA) odnosi se na jednu metilnu skupinu dodanu krajnjem dušikovom atomu, 2) asimetrični w-NG-dimetilarginin (aDMA) odnosi se na drugu metilnu skupinu smještenu na isti gvanidino skupinu temeljenu na MMA, a ako se postavi na drugi krajnji gvanidino dušik, to se odnosi na 3) simetrični w-NG, N'Gdimetilarginin (CDMA). Enzimi tipa I (PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT4 (CARM1), PRMT6 i PRMT8) kataliziraju aDMA (12), dok enzimi tipa II (PRMT5 i PRMT9) kataliziraju CDMA (13), a enzimi tipa III (PRMT7) samo kataliziraju MMA (Slika 1). PRMT-ovi sudjeluju u mnogim biološkim procesima, uključujući regulaciju ekspresije gena, odgovore na oštećenje DNA i staničnu signalizaciju (dodatna tablica 1). PRMT su dominantni i bitni za ljudske stanice, posebno PRMT1, koji je odgovoran za 85 posto aDMA, i pokazuje dramatičan gubitak metilacije kada se izbaci (14).

Štoviše, nagađa se da postoji mnogo preslušavanja između PRMT-ova (15). Gubitak PRMT1 uzrokuje oslobađanje različitih supstrata jer oni više nisu blokirani modifikacijom aDMA, zbog čega se ti supstrati prebacuju na ciljeve PRMT tipa II i III (15). Međutim, PRMT-ovi imaju međusobno isključive funkcije čak i ako se primjenjuju na niz identičnih supstrata in vitro (16).

2.2 Funkcije PRMT u biologiji raka

Prethodne studije su izvijestile da je povišena ekspresija PRMT-a bila u korelaciji s tumorigenezom i lošom prognozom kod nekoliko vrsta raka (17-19) (dodatna tablica 2). Do danas je većina PRMT-ova uključena u regulaciju staničnih procesa povezanih s održavanjem raka, uključujući ekspresiju gena posredovanu epigenetikom, spajanje mRNA i odgovore na oštećenje DNA (20). Među tim putovima, epigenetska regulacija je istaknuti mehanizam koji utječe na aktivnost stanica, uglavnom zbog aktivacije taloženja PRMT (histonski H4R3me2a, H3R2me2s, H3R17me2a i H3R26me2a) ili represivnih (H3R2me2a, H3R8me2a, H3R8me2s i H4R3me2s) histonskih oznaka, koje promiču ili suzbijaju (odnosno) ključne gene povezane s tumorom (21). Rane studije o nehistonskoj metilaciji identificirale su uloge PRMT-a u konstitutivnoj i alternativnoj regulaciji spajanja (22, 23). Doista, inhibicija PRMT5 i PRMT tipa I potisnula je funkcije sDMA i aDMA u RNA-vezujućim proteinima koji su uključeni u regulaciju spajanja, što je dovelo do odgovora supresije tumora u modelima životinjske leukemije s mutacijama faktora spajanja (24). Smanjena regulacija popravljanja oštećenja DNK odavno se prepoznaje kao povećanje nestabilnosti genoma što dovodi do nekontroliranog razvoja raka (25). S obzirom da je argininska metilacija proteina povezanih s popravkom oštećenja DNA, uključujući MRE11, 53BP1 i hnRNPUL1, potrebna za popravak DNA homolognim rekombinacijskim popravkom i nehomolognim spajanjem krajeva, PRMT inhibitori su kombinirani s kemoterapijom kako bi se prevladala otpornost na citotoksične tretmane (26 –28).

Ova ohrabrujuća otkrića ukazuju na moćnu i uzbudljivu ulogu PRMT-a u liječenju raka. Još jedno neočekivano otkriće bio je sinergistički učinak inhibicije PRMT-a u kombinaciji s inhibitorima imunološke kontrolne točke (ICI) (19). Stoga bi studije koje pojašnjavaju molekularne mehanizme koji leže u osnovi iscrpljivanja ili inhibicije PRMT-a mogle pomoći u identificiranju novih "lijekovnih" ciljeva za imunoterapiju.

3 PRMT-a U IMUNITETU PROTIV RAKA

Nedavno je imunoonkologija postala istaknuto područje u liječenju raka, s ICI-ima koji su identificirani kao obećavajuće monoterapije ili kombinirane terapije za liječenje različitih vrsta raka (29). Postupni događaji koji su uključeni u indukciju i izvršenje antitumorskih imunoloških odgovora, takozvani ciklus imunosti protiv raka, daju teoretsku osnovu za imunoterapiju tumora (30). Unutar ovog konteksta, važno je razumjeti međudjelovanje između PRMT-ova i komponenti u ciklusu imuniteta protiv raka, budući da bi ciljanje jednog ili više koraka ciklusa moglo poboljšati tekuće antitumorske imunološke odgovore i/ili potaknuti nove. Mnoge su studije sada pokazale da je interferon tipa I (IFN) kritičan za imunološki odgovor protiv raka jer je IFN glavni regulator i posrednik u svakom koraku ciklusa imunosti protiv raka (31, 32).

Stoga bi razvoj sigurnih i učinkovitih agonista za stimulaciju IFN tipa I mogao predstavljati obećavajuće strategije za imunoterapiju raka. Doista, intrinzični tumorski defekti pojavljuju se kao ključni molekularni čimbenici koji diktiraju imunološki kontekst različitih tipova raka, s ometajućom ulogom u lokalnim protutumorskim imunološkim odgovorima (33). Iskorištavanje odnosa između intrinzičnih tumorskih genetskih događaja i PRMT-ova potrebno je kako bi se maksimizirala učinkovitost inhibitora i razvile personalizirane strategije imunološke intervencije. Zajedno, identificiranje događaja metilacije u ciklusu raka-imuniteta, karakteriziranje proizvodnje IFN-a tipa I i otkrivanje onkogenih putova pružit će sveobuhvatan i dubok uvid u PRMT-ove u imunoonkologiji i pomoći u identificiranju novih ciljeva.

3.1 Uloga PRMT-a u ciklusu imunosti na rak

Značajni dokazi upućuju na to da tumorski imunitet nije izolirani proces, već zahtijeva niz postupnih događaja koji se nazivaju "ciklus imuniteta raka", ili proces koji se samo pojačava gdje svaki korak utječe na razvoj tumora i prognozu pojačavanjem pozitivnih regulatornih signala ili inhibiranjem negativnih regulacijski signali (30, 34, 35). Potpuno uklanjanje malignih tumora teoretski je moguće (30). U ovom modelu, bijeg tumorskih stanica postiže se prekidanjem specifičnih koraka u ciklusu raka i imunološkog sustava. Tumorsko-imunološki ciklus počinje otpuštanjem neoantigena povezanih s tumorom iz tumorskih stanica, koje prepoznaju stanice koje prezentiraju antigen kao što su dendritične stanice (DC), B stanice i makrofagi, kako bi se formirala antigenska peptidna glavna histokompatibilnost (MHC) kompleksi. Zreli DC migriraju iz tumora u sekundarne limfne organe (SLO) kako bi isporučili antigene peptid-MHC komplekse u CD4 plus T i CD8 plus T stanice (36). T stanični receptori (TCR) prepoznaju te komplekse i stvaraju prvi signal, nakon čega slijedi pojačana regulacija transmembranskog proteina CD40L na površini Th stanica. Zatim se CD40L veže za CD40 na površini DC, što uvelike povećava ekspresiju B7, a zatim se jače veže za CD28 na površini Th stanica. Ovaj dvostruki signal inicira kostimulaciju T stanica i proizvodi citokine, što dovodi do aktivacije efektorskih T stanica protiv antigena specifičnih za rak. Aktivirane efektorske T stanice zatim putuju do tumora putem cirkulacije i stvaraju imunološke stanice koje infiltriraju tumor.

Konačno, TCR-ovi na CD8 plus T stanicama prepoznaju antigenski peptid-MHC-I kompleks i ubijaju ciljne stanice raka, s antigenima koje oslobađaju mrtve stanice raka u sljedećem ciklusu (30) Potencijalne promjene regulirane metilacijom arginina u ciklusu raka-imuniteta prikazani su (slika 2).

3.1.1 PRMT i prezentacija tumorskog antigena

Mnogi oblici raka izbjegavaju imunološko odbacivanje potiskivanjem obrade i prezentacije antigena MHC klase I (MHC-I). MHC-I je privukao značajnu pozornost budući da predstavlja endogene peptidne antigene CD8 plus T stanicama, inhibira interferenciju s prepoznavanjem tumora i smanjuje citotoksičnost CD8 plus T stanica, što je primarni efektor tipova stanica za uspjeh ICB (4). Snižena regulacija MHC-I primijećena je u 40 do 90 posto ljudskih tumora, što utječe na interakcije MHC: TCR i smanjuje prepoznavanje stanica raka od strane CD8 plus T stanica. IFN regulacijski čimbenici (IRF) i CARD domena koja sadrži 5 (NLRC5) često se povezuju s nižom regulacijom MHC-I (37-40). Molekule MHC klase II (MHC-II) uglavnom eksprimiraju specijalizirane stanice za predstavljanje antigena (APC) i prezentiraju egzogene peptidne antigene prvenstveno CD4 plus T stanicama (41). Niža regulacija MHC-I ili MHC-II povezana je s lošom prognozom raka, oslabljenim ICB odgovorima i smanjenim stopama odbacivanja tumora u mišjim modelima (42-44).

Nedavna studija je objavila da PRMT5 kontrolira obilje MHC-I i prezentaciju antigena utječući na transkripciju NLRC5 (19). Smanjenje PRMT5 ili farmakološka inhibicija aktivnosti PRMT5 povećala je ekspresiju NLRC5 i njegovih ciljnih gena, koji su bili uključeni u obradu i prezentaciju antigena. NLRC5 je transkripcijski aktivator MHC-I gena kada je uparen s transkripcijskim faktorima u interakciji s regulacijskim elementima promotora MHC-I, kao što je SXY modul (39, 45). Obaranje PRMT5 također je povećalo ekspresiju NLRC5 nakon tretmana IFN-g i bilo je popraćeno povećanom površinskom ekspresijom MHC-I (19). Ekspresija NLRC5 bila je u obrnutoj korelaciji s ekspresijom PRMT5 u stanicama raka (46). Stoga bi ciljanje na PRMT5 moglo biti obećavajuća strategija za povećanje obilja MHC-I i promicanje prezentacije antigena. Osim PRMT5, pokazalo se da nekoliko drugih PRMT negativno regulira razine MHC-I.

U monocitima, inhibicija PRMT1 smanjila je obogaćivanje elementa odgovora na vezivanje cikličkog adenozin monofosfata (cAMP) (CREB) na mjestu CRE na promotoru HLA-B (Major Histocompatibility Complex, Class I, B) kako bi se povećale razine MHC-I (47). U stanicama mišjeg melanoma B16 tretiranim PRMT7 ili PRMT7 inhibitorom, regulatori gena MHC-I kao što je Nlrc5 i njegovi ciljni geni također su regulirani naviše, slično skupini MS023 (PRMT1 inhibitor) (48).

Pokazalo se da PRMT1 metilira transaktivator klase II (CIITA) koji je ključni regulator ekspresije MHC-II, te je povezan i surađuje s faktorom transkripcije koji se veže na promotor MHC-II (49). Metilacija arginina CIITA dovela je do njegove naknadne degradacije i niže razine MHC-II mRNA i proteina (49). Nedavna studija je objavila da PRMT5 negativno regulira ekspresiju MHC-II u hepatocelularnom karcinomu uzrokovanom MYC (50). MHC-II je značajno povećan na CD45.1 koji infiltrira tumor plus leukocite i DC kada su transgeni miševi s prekomjernom ekspresijom MYC bili tretirani inhibitorom PRMT5, GSK3326595 (50). Utišavanje PRMT5 u stanicama hepatocelularnog karcinoma s prekomjernom ekspresijom MYC izravno je reguliralo ekspresiju MHC-II smanjenjem in vitro obogaćivanja H3R8me2s i H4R3me2s na promotorima CIITA i CD74 (50).

Prema tome, ciljanje PRMT5 korištenjem malih molekularnih inhibitora moglo bi potaknuti infiltraciju imunoloških stanica u tumore jetre i pospješiti prezentaciju antigena preko MHC-II regulacije. Međutim, druga je studija pokazala da PRMT5- posreduje akumulacijom simetrično dimetiliranog histona, H3R2 (H3R2me2s) kao odgovor na stimulaciju IFN-g i da je popraćeno obogaćivanjem CIITA na promotoru MHC-II; PRMT5 je aktivirao MHC-II transkripciju na način ovisan o aktivnosti (51). Ovi različiti učinci PRMT5 na transkripcijske procese MHC-II možda su bili posljedica različitih modela, stoga su potrebna daljnja istraživanja kako bi se ta pitanja razjasnila. CARM1 je također aktivirao transkripciju MHC-II stimuliranu IFN-g induciranu pomoću CIITA na način ovisan o aktivnosti arginin metiltransferaze. Štoviše, CARM1 metilirao je vezni protein CREB na položajima R714, R742 i R768, čime je olakšao povezivanje s promotorom MHC-II i sinergistički aktivirao transkripciju MHC-II pomoću CIITA (52). Zajedno, PRMT-ovi su utjecali na CIITA-posredovanu indukciju MHC II pomoću IFN-a putem različitih mehanizama.

3.1.2 PRMT-ovi posreduju u migraciji imunoloških stanica reguliranjem kemokina, CXCL10 i CXCL11

Kako bi izvršile antitumorsko djelovanje, T stanice migriraju kroz cirkulacijski sustav do tumora nakon inicijacije u limfnim čvorovima. Os CXCL9, -10, -11/CXCR3 uglavnom regulira migraciju, diferencijaciju i aktivaciju imunoloških stanica. CXCR3 je površinski eksprimiran receptor za CXCL9, CXCL10 i CXCL11 kemokine na imunološkim stanicama i stanicama raka. Kemokini regrutiraju CTL, stanice prirodne ubojice (NK), NK-T stanice i makrofage, zatim olakšavaju infiltraciju u tkivo raka putem kemotaktičkog gradijenta, izazivajući usmjerenu migraciju kao odgovor na IFN-g, koji je sinergistički pojačan faktorom nekroze tumora-a ( TNF-a) (53). Subkutana injekcija smrtonosnih ili subletalnih doza stanica melanoma B16 u CXCR3-/-miševe uspostavlja kritičnu ulogu za CXCR3 kao receptor za CXCL9, CXCL10 i CXCL11 tijekom migracije CTL (54). Kemokini dobiveni iz tumora također su odgovorni za regrutiranje Th2 stanica, Tregova i mijeloidnih supresorskih stanica (MDSC) (53). Stoga, CXCL9, CXCL10 i CXCL11 imaju ključne, neredundantne, stanično autonomne uloge posredovanja u infiltraciji imunoloških stanica u tumore i induciranja učinkovitog antitumorskog imuniteta. Osim toga, metilacija histonskog lizina posredovana zeste homologom 2 (EZH2) i metilacija DNK posredovana DNA metiltransferazom-1 (DNMT-1) potisnule su proizvodnju CXCL9 odnosno CXCL10, a zatim su inhibirale tumor T-stanica navođenje.

Stoga tretmani epigenetskim modulatorima mogu eliminirati ovu supresiju i u konačnici poboljšati liječenje raka (55). Ova opažanja sugeriraju da epigenetsko reprogramiranje tumora može regulirati regrutiranje T stanica i kliničku učinkovitost tumorske imunoterapije, a metilacija arginina kao široko rasprostranjen i kritičan epigenetski modalitet utječe na te procese.

Katalitička strukturna domena CARM1 izravno stupa u interakciju s p65, koji se nalazi u domeni Rel-homologije nuklearnog faktora kappa-B (NF-kB) i služi kao osnovni motiv dimerizacije (56). U nokdaun stanicama CARM1 stimuliranim TNF-a, regrutiranje p65 na promotor CXCL10 bilo je značajno neispravno, a metilacija H3R17 na promotoru nije se mogla detektirati, dok je ponovno uvođenje CARM1 potpuno spasilo te odgovore, sugerirajući da je CARM1 bio potreban za regrutiranje p65 na promotor CXCL10 i H3R17 metilacija (56). PRMT5 je također regulirao povezanost p65 s promotorom CXCL10, jer je PRMT5 pokrenuo dimetilaciju R30 i R35 mjesta na p65 te vezanje DNA i nuklearnu translokaciju p65 (57). TNF-a-indukcija CXCL10 u endotelnim stanicama zahtijevala je metilaciju arginina p65 posredovanu PRMT5-. Prema drugom istraživanju ovog tima, PRMT5 je inducirao dimetilaciju R174 na p65 kako bi se modificiralo vezanje na promotor CXCL11 (58).

Dosljedno, PRMT5 simetrična dimetilacija p65 na R30 povećala je njegov afinitet za DNA i pokrenula NF-kB-induciranu ekspresiju gena (59). Nasuprot tome, slabljenje aktivnosti PRMT5 kratkom ukosnom RNA ili malim molekularnim inhibitorom, EPZ015666 u stanicama melanoma B16 povećalo je ekspresiju CCL5 i CXCL10 nakon stimulacije (19). PRMT5 je također metilirao IFI16, oslabio njegovo vezanje na intracelularnu dvolančanu DNA (dsDNA) i stoga inducirao ekspresiju CCL5 i CXCL10 (19). Iako interakcije između PRMT1 i CXCL10 ili CXCL11 nisu opisane, PRMT1 je asimetrično dimetilirao očuvani R30 ostatak p65 (60). Mjesto metilacije PRMT1 nalazi se u motivu RxxRxRxxC L1 petlje koja veže p65 DNA (60). Metilirani p65 ima slab afinitet za zajedničke oligonukleotide NF-kB; negativno je regulirao vezanje p65 DNA i transkripcijsku aktivnost, čime je spriječio regrutiranje NF-kB za ciljane promotore gena (60).

Stoga pretpostavljamo da bi PRMT1 mogao regulirati kemokine na transkripcijskoj razini. PRMT1, CARM1 i PRMT5 vezali su se izravno na Rel homolognu domenu p65, zahvaljujući činjenici da je interakcija bila posredovana središnjom regijom koja sadrži strukturnu domenu metiltransferaze, koja je bila evolucijski očuvana (61). Sve u svemu, interakcije PRMT-kemokina su dinamične i ovisne o kontekstu, tako da se simetrična i asimetrična dimetilacija može poništiti i pojaviti u različitim fazama reakcija NF-kB, čime se regrutiraju različite efektorske molekule i proizvode različiti biološki učinci. Proizvodnju kemokina treba poticati kako bi se olakšalo regrutiranje limfocita koji infiltriraju tumor selektivnim ciljanjem na različite PRMT-ove.

3.1.3 Prevladavanje inhibicijskih mreža u TME

TME se sada promatra kao složen tumorski ekosustav, a ne obrazac rasta usmjeren na tumorske stanice (62). Da bismo bolje razumjeli kako TME funkcionira, moramo razumjeti njegov izvanstanični matriks i sastav stromalnih stanica. Stromalne stanice su kategorizirane kako slijedi; infiltrirajuće imunološke stanice (IIC), angiogene vaskularne stanice i fibroblaste povezane s rakom (63). Antigen-specifične infiltrirajuće imunološke stanice sastoje se od urođenih imunoloških stanica (makrofage (Mjs), dendritične stanice (DC), MDSC, NK, mastociti, neutrofili i adaptivne imunološke stanice (T i B limfociti) koje reagiraju na različite podražaje) (64). Dok su u početku regrutirane iz okolnog tkiva ili koštane srži da omotaju tumorsko tkivo, te se stanice na kraju "preobrazuju" da postanu različite vrste stanica koje stvaraju kroničnu upalu i angiogenezu.

U ovom okruženju, stanice raka i okolna stroma međusobno se preslušavaju potiskivanjem imunološki korisnih gena i induciranjem signalizacije nenormalnog puta, u konačnici proizvodeći snažne citokine i kemokine koji utječu na imunološki nadzor domaćina kako bi se održao rast, progresija i metastaze stanica raka. Mnogo kliničkih dokaza sada pokazuje da TME značajno utječe na učinkovitost imunoterapije i kliničke ishode te da PRMT mogu pružiti nove terapijske ciljeve za imunoterapiju tumora modulacijom TME prema visokoj infiltraciji limfocita.

3.1.3.1 Ciljanje na proliferaciju i diferencijaciju T-stanica

Budući da su CD{0}}učinkovite T-stanice najsnažnije stanice koje ubijaju tumore, populacije T-stanica vrlo su aktualne teme istraživanja. CD8 plus citotoksične T stanice i CD4 plus T pomoćne stanice čine subpopulacije T stanica u TME. Naivne CD4 plus stanice uglavnom se diferenciraju u četiri različite populacije: T pomoćne 1 (Th1), Th2, Th17 i regulacijske T (Treg) stanice. Njihova je diferencijacija određena obrascima signala primljenih tijekom njihovih početnih interakcija s antigenima (65). T stanice u TME ne samo da vrše protutumorske efektorske funkcije, nego neke potiču rast tumora. Među njima, CD8 plus citotoksične T stanice i Th1 stanice, obično poznate kao CTL, imaju ulogu ubijanja tumora. Potonje stanice karakterizirane su proizvodnjom IFN-g, TNF-a i interleukina (IL)-2, koji podržavaju prvi tip stanica ili djeluju kao citotoksične T-stanice za izravno uklanjanje tumorskih stanica (66). Th2 stanice podržavaju B stanice otpuštanjem IL-4, IL-5 i IL-13, dok Th17 stanice potiču rast tumora proizvodnjom IL-17, IL-21 i IL22 (65, 67). Dodatno, Tregs prigušuje protutumorski imunološki odgovor posredovan T-stanicama izravnom inhibicijom funkcije T-stanica i proizvodnje citokina ili neizravnom inhibicijom predstavljanja antigena kako bi spriječio aktivaciju T-stanica (68, 69). Visok omjer Tregs-a prema CD8 plus T stanicama obično ukazuje na lošu prognozu raka (70). CD8 plus citotoksične T-stanice često ne uspijevaju inhibirati stvaranje tumora tijekom tumorigeneze zbog iscrpljenosti T-stanica, što se definira kao trajna ekspresija inhibitornih receptora T-stanica i progresivni gubitak proizvodnje IFN-g i funkcija degranulacije kao odgovor na dugotrajne čimbenike poput kronične upale ili stimulacije raka (71). IL-12 i IFN-g polariziraju naivne CD4 plus T stanice prema Th1 stanicama djelovanjem pretvarača signala i aktivatora faktora transkripcije T-box T-bet. Diferencijacija stanica Th2 zahtijeva GATA3, koji je nizvodno od IL-4. Diferencijacija Th17 stanica zahtijeva orphan receptor (ROR)gt povezan s retinoidom koji je faktor transkripcije induciran transformirajućim faktorom rasta (TGF-b) u kombinaciji s IL-6, IL-21 i IL{{55 }}. Diferencijacija Treg stanica također zahtijeva forkhead box P3 (FOXP3) kao transkripcijski faktor.

Sveobuhvatna karakterizacija metilacije arginina u primarnim T stanicama identificirala je regulatorne uloge PRMT-a u odlukama o sudbini T stanica. Koristeći masenu spektrometriju, Geoghegan et al. identificirali su 2502 mjesta metilacije arginina u 1257 proteina u ljudskim T stanicama (72). Na popisu su bile komponente signalnog mehanizma receptora antigena T stanica i ključni faktori transkripcije koji reguliraju određivanje sudbine T stanica. Štoviše, ovi su autori kvantificirali promjene u popunjenosti metilacije arginina tijekom primarne diferencijacije T-stanica i pokazali promjene u stehiometriji metilacije arginina tijekom stanične stimulacije u podskupu proteina kritičnih za diferencijaciju T-stanica (72).

Tri neovisne studije koje su koristile miševe s nedostatkom PRMT5- specifične za T stanice potvrdile su ključnu ulogu PRMT5 u održavanju perifernih T stanica i vođenju prijelaza naivnih T stanica na fenotip efektora/memorije (73-75). Inoue i sur. izvijestili su da u usporedbi s kontrolnim miševima, miševi s homozigotnim nedostatkom specifičnih za PRMT5 T stanice imaju manji invarijantni broj NK (iNK) T, CD4 plus T i CD8 plus T stanica. Također, PRMT5 je bio potreban za preživljavanje i proliferaciju T-stanica (74). Tanaka i sur. pokazalo je da je PRMT5 kritičan za prijelaz T-stanica iz naivnog u aktivirani fenotip, kao i za održavanje već zrelih T-stanica (73). Lindsay i sur. također je potvrdio da je PRMT5 potreban za održavanje normalne populacije iNKT, CD4 plus T i CD8 plus perifernih T stanica (75). I aktivnost simetrične dimetilacije arginina i razine ekspresije PRMT5 značajno su inducirane u aktiviranim T stanicama.

Štoviše, Inoue et al. također je izvijestio da je PRMT5 olakšao pre-mRNA spajanje iz Il2rg i Jak3 kako bi se povećala njihova razina ekspresije za održavanje populacije T-stanica. Il2rg kodira gc, koji je receptorska podjedinica koju dijele citokini, uključujući IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 i IL-21 (76). Obitelj gc citokina čvrsto regulira razvoj limfocita i funkcionira preko tirozin kinaza JAK1 i JAK3 (77). Neispravan razvoj limfocita, uključujući T, B, NK i iNKT stanice opažen je kod miševa s nedostatkom gc ili JAK3. Ovi su autori također pokazali da je simetrična dimetilacija argininskih ostataka u Sm proteinima pomoću PRMT5 možda odgovorna za promjene spajanja uzrokovane nedostatkom PRMT5 (74).

CD8 visoke gustoće plus citotoksične T stanice povezane su s boljom prognozom kod mnogih vrsta raka (78). Stoga su korelacije između PRMT-ova, proliferacije CD8 plus T stanica i sposobnosti proizvodnje citokina istražene u brojnim studijama. Kumar i sur. pokazalo je da je inhibicija CARM1 povećala broj CD8 plus T stanica koje infiltriraju tumor, pospješila ekspresiju granzima B i IFN-g i proliferaciju Ki-67 markera, što je omogućilo jači kapacitet ubijanja tumora u CD8 plus T stanicama, što ukazuje na inhibiciju CARM1 pojačana CD8 plus T proliferacija i proizvodnja citokina (79). Kumar i sur. također je pokazalo da Carm1-nokautirane T stanice izražavaju više razine memorijskih CD8 plus transkripcijskih faktora povezanih s T stanicama, kao što su Tcf7 i Myb (79). Myb je poticao stvaranje memorijskih CD8 plus T stanica preko transkripcijske aktivacije Tcf7 i Zeb2 potiskivanja (80). Naime, Carm1-nokautirane T-stanice koeksprimiraju niske razine inhibitornih receptora PD-1 i TIM3, koji su markeri iscrpljenosti T-stanica (79). Za razliku od CARM1, inhibicija PRMT5 potisnula je indukciju tumorskih antigen-specifičnih CD8 plus T stanica in vitro (81). Reakcije PRMT metilacije pretvorile su SAM, kao kofaktor koji donira metil, u sadenozil-l-homocistein (SAH), dok je SAM također pretvoren u metiltioadenozin (MTA). I SAH i MTA su inhibirali PRMT u petlji povratne sprege, dok je MTA učinkovito inhibirao aktivnost PRMT5 (82). MTA je smanjio proliferaciju i vitalnost CD8 plus T stanica, jer je inhibirao efektorske funkcije u ljudskim antigen-specifičnim CD8 plus citotoksičnim T stanicama smanjenjem kapaciteta degranulacije CD8 plus T stanica i inhibicijom izlučivanja IFN-g i IL-2 u način ovisan o dozi (81). Strobl i sur. izvijestili su da PRMT5-specifični inhibitor metiltransferaze, EPZ015666 suzbija proliferaciju, sposobnost preživljavanja i funkcionalnost CD8 plus T stanica (83).

Dodatno, ovi su autori povezali PRMT5 sa selektivnim spajanjem MDM4 koje je induciralo transdukciju signalne kaskade p53 da posreduje u zaustavljanju staničnog ciklusa i apoptozi u CD8 plus T stanicama. Inhibicija PRMT5 također je smanjila signaliziranje protein kinaze B (AKT)/ciljnog signala rapamicina (mTOR) kod sisavaca, što je umanjilo proliferaciju i preživljavanje CD8 plus T stanica (83).

CD28 vezan za B7 na APC-ima, a ko-stimulacija s TCR-om smanjila je prag aktivacije T-stanica, čime se potiče diferencijacija CD4 plus T-stanica i ekspresija citokina tipa Th2- (84). Blanchet i sur. izvijestio je da CD28 kostimulacijski signali induciraju metilaciju arginina u T stanicama (85). S obzirom na to da je S-adenozil-L-homocistein hidrolaza (SAHase) brzo eliminirala SAH i da je SAH inhibirao aktivnosti PRMT-a, SAHase služi kao aktivator PRMT-a. Farmakološki blokatori SAHase snažno su inhibirali aktivaciju nekoliko ključnih proteina stimuliranih TCR signalizacijom, uključujući AKT, izvanstanične regulirane protein kinaze (ERK)1/2 i NF-kB. dovodi do oslabljene aktivacije CD4 plus T stanica (86).

Stoga PRMT-ovi mogu imati važnu ulogu u aktivaciji i diferencijaciji CD4 plus T stanica. Selektivni inhibitori za PRMT5 mogli bi suzbiti proliferaciju Th2 stanica (87). Webb i sur. primijetio da je u PRMT5 T-stanično specifičnih miševa s homozigotnim nedostatkom, udio IFN-g plus T-bet plus, IFN-g plus i T-bet plus T stanica porastao tijekom diferencijacije Th1 stanica, ali ukupni broj diferenciranih Th1 stanica bio je smanjena, više nego vjerojatno zbog smanjene proliferacije Th1 (75). Osim toga, ovi su autori primijetili da se postotak GATA-3 plus IL-4 plus i IL-4 plus T stanica povećao tijekom Th2 diferencijacije (75). Dakle, inhibicija PRMT5 pojačala je diferencijaciju CD4 plus T stanica, ali je potisnula proliferaciju. Mehanički gledano, pokazalo se da inhibitori SAHase smanjuju metilaciju arginina faktora izmjene Vav guanin nukleotida 1 (Vav1), bitne molekule, što dovodi do ograničene aktivacije CD4 plus T stanica (86, 88). Dosljedno, Vav1 metiliran argininom nakupljao se u jezgri i aktivirao transkripcijski kompleks nuklearnog faktora aktiviranih T stanica (NFAT) i NF-kB za promicanje proizvodnje IL-2 i proliferacije T stanica (85). PRMT5 također regulira transkripciju IL-2 metilacijom određenih proteina koji sadrže sDMA (89).

Štoviše, smanjeno izlučivanje IL-2 inhibitorima PRMT5 pomoglo je u suzbijanju proliferacije i diferencijacije Th1 stanica (87). PRMT1 također je metilirao NFAT interagirajući protein, NIP45, što je omogućilo povezivanje s NFAT-om, nužnu modifikaciju za NIP45-induciranu moćnu augmentaciju NFAT transaktivacije i PRMT1 koaktivacije IL-4 promotora (90, 91). Zajedno, inhibitori SAHase djelomično kontroliraju proteine ​​stimulirane TCR signalizacijom kroz smanjenu Vav1 metilaciju, čime inhibiraju CD4 plus aktivaciju T stanica. PRMT5 također potiče proizvodnju IL-2 metiliranjem Vav1 ili NF-45 i NF-90. S obzirom da IL-2 ima kritičnu ulogu u polarizaciji naivnih CD4 plus T stanica na Th2 fenotip i u proliferaciji T stanica, visoke razine ekspresije IL-2 inducirane PRMT5 doprinijele su CD4 plus T stanicama diferencijacije i proliferacije (92, 93).

Nedavne studije pokazale su da disregulacija metilacije arginina pridonosi diferencijaciji Th17. S jedne strane, farmakološka inhibicija PRMT1 spriječila je stvaranje Th17 stanica (94). Mehanički gledano, kao odgovor na IL-6 i transformirajući faktor rasta-b (TGF-b), PRMT1 je stupio u interakciju s ključnim transkripcijskim faktorom u diferencijaciji stanica Th17, RORgt, i inducirao transkripciju i ekspresiju IL-17, što karakterizira Th17 fenotip (94). Nakon kombinacije s RORgt, PRMT1 je regrutiran za IL-17 promotor i asimetrično dimetilirani histon 4 arginin 3 (H4R3). Metilacija H4R3 stabilizirala je STAT3 aktiviran pomoću IL-6 i uklonila STAT5 aktiviran pomoću IL-2, čime se ublažio inhibicijski učinak STAT5 na promotor IL-17 i potaknula diferencijacija Th17 (95).

Međutim, s druge strane, diferencijacija Th17 bila je ozbiljno ometena u modelu s nedostatkom PRMT5 specifičnom za T stanice, pri čemu je broj stanica RORgt plus IL17 plus, IL-17 plus i RORgt plus Th17 stanica bio vrlo nizak u ovom modelu (96). Ova je situacija mogla nastati zbog sljedećeg: PRMT5 je simetrično dimetilirao SREBP1 na R321, što je inhibiralo njegovu fosforilaciju na S430 i spriječilo razgradnju SREBP1 putem ubikvitin-proteasomskog puta (96). Ova promjena pospješuje stabilnost i transkripcijsku aktivnost SREBP1, genskog transaktivatora koji potiče biosintezu kolesterola, što rezultira nakupljanjem snažnog endogenog RORg agonista, desmosterola (75, 97).

Osim učinaka na biosintezu kolesterola, PRMT5 je također poboljšao glikolitički mehanizam za regulaciju diferencijacije Th17. Inhibicija PRMT5 potisnula je ekspresiju čimbenika koji regulira glikolizu, čimbenika induciranog hipoksijom 1-a (HIF-1a) za promicanje diferencijacije Th17 putem izravne transkripcijske aktivacije RORgt i promicanje glikolitičkog puta ( 75, 83, 98). Sveukupno, metiliranjem histona za aktivaciju promotora IL-17 i reguliranje metaboličkog reprogramiranja, uključujući glikolizu i metabolizam lipida nakon aktivacije T stanica, PRMT-ovi su pospješili diferencijaciju Th17.

Za Treg stanice, FOXP3 je prijavljen kao regulator transkripcije koji određuje sudbinu, s visokim razinama FOXP3 i stabilnošću potrebnim za imunosupresivnu aktivnost Treg stanica (99, 100). PRMT-ovi su aktivno regulirali diferencijaciju i supresivnu aktivnost Tregs-a reguliranjem FOXP3. PRMT1-katalizirana izravna metilacija FOXP3 na R48 i R51 pojačala je supresivnu funkciju Treg stanica (101). Slično tome, PRMT1 je također mogao utjecati na aktivnost Treg reguliranjem drugih proteina u interakciji s FOXP3, kao što je Forkhead box protein O1 (FOXO1) i transkripcijski faktor 1 (Runx1) povezan s transkripcijskim faktorom Runt (102, 103). PRMT1 je metilirao FOXO1 na R248 i R250 kako bi stabilizirao protein, a također je metilirao Runx1 na R206 i R21 kako bi pojačao njegovu transkripcijsku aktivnost (104, 105).

Osim toga, liječenje PRMT1 inhibitorom AMI-1 ojačalo je Tregovu osjetljivost na TGF-b-induciranu ekspresiju FOXP3 i povećalo učestalost i supresivni učinak Tregs-a putem izravnog pojačavanja ekspresije FOXP3 (106, 107). Osim PRMT1, PRMT5 je također regulirao ekspresiju FOXP3 u naivnim T stanicama utječući na ekspresiju DNMT1 koja je kontrolirala metilaciju CpG u promotoru FOXP3 i stoga poboljšala transkripcijsku dostupnost regulatornim regijama FOXP3 (108, 109). Dodatno, inhibicija PRMT5 utjecala je na modifikaciju H3K27me3 u promotoru FOXP3 i olakšala ekspresiju FOXP3 (106). Budući da je PRMT5 stupio u interakciju s EZH2, što je kulminiralo povećanim taloženjem H3K27me3, promjene H3K27me3 u stanicama s nedostatkom PRMT5 možda su bile izazvane interakcijama PRMT5-EZH2 (110).

Suprotno tome, Yasuhiro i sur., u modelu nedostatka PRMT5-specifičnog za Treg stanice, uočili su supresivnu aktivnost i efekte/fenotip pamćenja Treg-a smanjeni, što je rezultat smanjenog markera simetrične dimetilacije lokusa FOXP3 R51 (111 ). Međutim, ovi su autori kasnije otkrili da je nedostatak PRMT5 vjerojatno povezan s neispravnim održavanjem, aktivacijom i proliferacijom Treg stanica putem oslabljenog gc signaliziranja, a ne metiliranog FOXP3 (73).

3.1.3.2 Aktivacija i diferencijacija ciljanih B stanica

Dok su T stanice dugo bile u fokusu istraživanja tumorske imunosti, druge podskupine imunoloških stanica relevantne su za ovo područje, posebno u vezi s konceptom tercijarne limfoidne strukture (TLS). Umjesto da se zahtijeva da DC migriraju s mjesta tumora na SLO, TLS hipoteza pretpostavlja da se ovaj fenomen događa izravno u ektopičnim limfoidnim organima, generiranim nelimfoidnim tkivom koje infiltrira rubove tumora i stromu (112). Takve se strukture sastoje od zone CD3 plus T stanica i zone CD20 plus B stanica, pri čemu prva sadrži DC pozitivne na membranski glikoprotein povezan s DC-lizosomom i retikulocite fibroblasta, a potonja sadrži germinativne centre, plazma stanice, folikularne DC i kompleksi antigen-protutijelo (113). U TLS-u, antigeni povezani s tumorom pokreću transformaciju B stanica u efektor/memorijski fenotip koji proizvodi antitijela i predstavlja tumorske antigene T stanicama, čime se pojačava prognostička funkcija CD8 plus T stanica i promiče rast T stanica (113). Povišene razine CD8 plus i CD4 plus T stanica koje su lokalizirane uz značajnu infiltraciju CD20 plus B stanica bile su povezane s dugotrajnim kliničkim preživljavanjem (114).

Štoviše, B-stanice su lučile nekoliko kemokina kako bi regrutirale DC, T-stanice i NK-stanice (113). I kliničke kohortne i analitičke studije TME-a identificirale su pozitivne korelacije između odgovora pacijenata na terapiju ICB-om i infiltracije B stanica i stvaranja TLS-a. Ove su studije istaknule dosad necijenjenu ulogu B stanica u ljudskom antitumorskom imunitetu, stoga tumori neosjetljivi na ICB mogu bolje reagirati na nove terapije usmjerene na aktivnost B stanica (115-117).

PRMT1, PRMT5 i PRMT7 reguliraju proliferaciju i diferencijaciju pre-B stanica, stvaranje središta klica i odgovore protutijela. U miševa s nedostatkom PRMT1- specifičnih za B-stanice, broj B-stanica u koštanoj srži i drugim perifernim limfoidnim organima bio je značajno smanjen (118), dok je razvoj B-stanica bio ozbiljno ograničen u fazi prije B-stanica (119 ). Aktivirane B stanice pokazale su povećane razine PRMT1 i arginin-metiliranog proteina. Regulacijom prema dolje, geni koji aktiviraju rekombinaciju, Rag1 i Rag2, FOXO1 je blokirao napredovanje diferencijacije B-stanica izvan stadija pro-B-stanice (120). Yamagata i sur. pokazalo je da PRMT1 izravno metilira FOXO1 kako bi inhibirao fosforilaciju pomoću AKT-a i naknadnu proteasomsku razgradnju (105). Štoviše, PRMT1 je također metilirao Iga podjedinicu B-staničnog receptora (BCR) kako bi inhibirao BCR-induciranu Syk aktivaciju i signaliziranje fosfoinozitid 3-kinaze (PI3K), blokirao razgradnju FOXO proteina i poticao diferencijaciju pre-B stanica umjesto proliferacija (121, 122).

Stoga je PRMT1 negativno regulirao B-staničke signalne događaje kao što su rekombinacija klase i odabir antigena putem PI3K-FOXO1 signalizacije, čime se olakšava razvoj od pre-B stanica do nezrelih B stanica. Dodatno, PRMT1 je posredovao u argininskoj metilaciji CDK4, destabilizirao CDK4-Cyclin-D3 kompleks, inducirao zaustavljanje staničnog ciklusa i pospješio diferencijaciju pre-B stanica (119). U modelu miša s nedostatkom PRMT1- perifernog odjeljka B stanica, proliferacija i diferencijacija zrelih B stanica nakon stimulacije bile su ozbiljno otežane, generacija stanica germinativnog centra B (GC-B) bila je neispravna, a aktivacija i proliferacija memorijskih B stanica bili su znatno smanjena (121). PRMT1 je također održavao broj folikularnih B (FO-B) stanica i poticao stvaranje germinalnog centra (GC) nakon aktivacije FO-B stanica (118). PRMT1 je zaštitio aktivirane B stanice od apoptoze reguliranjem ekspresije proteina za preživljavanje obitelji BCL2, MCL1, BCL2, A1 i BCLX (121).

Litzler i sur. izvijestili su da su i razine PRMT5 proteina i sDMA bile regulirane na gore u stadijima proliferacije B stanica i da PRMT5 potiče preživljavanje aktiviranih B stanica (123). PRMT5 je bio neophodan za razvoj B stanica u Pro-B i Pre-B stanicama. PRMT5 je zaštitio zrele B stanice od apoptoze i pospješio proliferaciju i stvaranje GC reguliranjem transkripcije B stanica i vjernosti spajanja (123). Štoviše, PRMT5 je izravno komunicirao s i metilirao BCL6 kako bi olakšao BCL6-posredovanu represiju transkripcije, regulirajući tako stvaranje GC (124). Ciljni geni BCL6 Irf4 i Prdm1, koji su posredovali u diferencijaciji plazma stanica, također su regulirani prema dolje pomoću PRMT5 (123).

Koristeći model miša s nokautom PRMT7 specifičnim za B stanice, Ying et al. pokazalo je da je gubitak PRMT7 oslabio razvoj B stanica smanjio B stanice rubne zone (MZ-B), povećao FO-B stanice i pospješio stvaranje GC nakon imunizacije (125). Deplecija PRMT7 povećala je ekspresiju Bcl6 regrutiranjem H4R3me1 i simetričnog H4R3me2 na Bcl6 promotor. Diferencijacija podtipova plazma stanica koje izlučuju IgA- i IgG1- također je bila smanjena u miševa s nedostatkom PRMT7-, vjerojatno zato što je gubitak PRMT7 inducirao regulaciju Bcl6 i inhibirao Irf4 i Prdm1 u GC-B stanicama (125 ).

3.1.3.3 Ciljanje na diferencijaciju makrofaga povezanih s tumorom (TAM) i ekspresiju drugih imunoloških stanica

Sve više dokaza sada pokazuje da TME mijenja imunološke stanice kako bi potisnuo imunološki nadzor i imunološke odgovore (126). Klasično aktivirani M1 makrofagi imaju tendenciju fagocitoze tumorskih stanica uspostavljanjem proupalnog okruženja i olakšavanjem Th1 i CTL odgovora.

Međutim, alternativno aktivirani M2 makrofagi kao što su TAM potiču rast i invaziju tumora pojačavanjem Th2 polarizacije, tumorske angiogeneze i inhibicijom antitumorskih imunoloških odgovora (127). DC su specijalizirani za obradu i prezentaciju antigena, dok NK učinkovito identificiraju tumorske stanice i koriste citotoksičnost posredovanu perforinom/granzimom da ograniče rast tumora, dok akumulirani MDSC imaju istaknute imunosupresivne učinke umjesto diferencijacije u zrele mijeloične stanice (128).

Koristeći mijeloidno specifični PRMT1 knock-out mišji model, Tikhanovich et al. pokazalo je da je PRMT1 potreban za diferencijaciju M2 makrofaga. Indukcija PRMT1 primijećena je tijekom diferencijacije monocita u makrofage, što je dovelo do taloženja H4R3me2a na promotor g receptora aktiviranog proliferatorom peroksisoma (PPARg) koji je pojačao ekspresiju PPARg (ključni faktor transkripcije potreban za diferencijaciju fenotipa M2). Makrofage-specifična delecija PPARg umanjila je sazrijevanje alternativno aktiviranih M2 makrofaga (129, 130). U skladu s ovom studijom, PRMT1 je inducirao polarizaciju makrofaga na tipove M2 i povećao ekspresiju IL-6 i nizvodno STAT3 promicanjem PPARg-ovisne eferocitoze makrofaga za konzumiranje apoptotičkih tijela u mišjem modelu hepatocelularnog karcinoma ovisnog o alkoholu (131).

Također, nedostatak PRMT1 smanjio je tipove M2 putem c-Myc-posredovanog PPARg puta, što je utjecalo na promet, eferocitozu, fagocitozu i alternativnu aktivaciju makrofaga (132-134). PRMT1 je također metilirao c-Myc na R299 i R346 kako bi poboljšao svoj kapacitet vezanja na p300, umjesto na HDAC1. Ovo pojačano regrutiranje kompleksa c-Myc-p300 na gene pokrenulo je kasniju M2 transkripciju, kao što su PPARg i promotori receptora manoze C-tipa 1 (MRC1) (129).

Nadalje, PRMT-ovi su utjecali na ekspresiju i funkciju c-MYC u drugim staničnim linijama kako slijedi: 1) PRMT1 i CARM1 deponirali su markere H4R3me2a na promotor gena cMYC, koje je očitao protein 3 (TDRD3)-topoizomeraza IIIB (TOP3B) koji sadrži Tudor domenu ) kompleks i olakšana c-MYC transkripcija (135). 2) PRMT5 je metilirao mjesta R218 i R225 u heterogenom nuklearnom ribonukleoproteinu A1 (hnRNP A1) kako bi regulirao translaciju c-MYC ovisnu o unutarnjem ribosomskom ulaznom mjestu (IRES) (136). 3) Inhibicija poliubikvitinacije c-MYC ovisna o enzimima pomoću PRMT3 eliminirala je razgradnju C-MYC posredovanu ubikvitinom (137), i 4) Označavanje H4R3me2 posredovano PRMT5- bilo je bogato vezanjem c-Myc na CANNTG E- elemente kutije, a također i reguliranu MYC funkciju (138).

PRMT6 je također pospješio progresiju tumora olakšavanjem diferencijacije makrofaga na fenotip M2 umjesto fenotipa M1 i podupiranjem neoangiogeneze tumora. PRMT6 je u interakciji s ILF2 u adenokarcinomu pluća regulirao sintezu faktora inhibicije migracije makrofaga kako bi inducirao alternativnu aktivaciju TAM (139, 140).

Metilacija arginina također je utjecala na druge imunološke stanice, osim makrofaga. Inhibitor male molekule CARM1, tumori tretirani EZM2302 bili su infiltrirani velikim brojem dendritičnih stanica, cDC1 stanica s unakrsnom prezentacijom i NK stanicama. Dosljedno, u modelu PRMT5-nokdaun tumora primijećena je veća zastupljenost NK, DC i MDSC u usporedbi s kontrolno-nokdaun modelom (19, 79).

Kada se kombiniraju, PRMT imaju bitnu ulogu u regulaciji diferencijacije makrofaga i proliferacije stanica NK, DC i MDSC. Ove funkcije ne samo da pružaju nove perspektive za alternativnu aktivaciju makrofaga, već bi mogle identificirati nove terapijske ciljeve za rak.

3.2 PRMT i IFN signalizacija tipa I

IFN-ovi tipa I olakšavaju imunološki nadzor raka, antitumorsku imunost i učinkovitost imunoterapije na nekoliko načina, ponajviše stimuliranjem sazrijevanja DC-a i poboljšanjem njihove sposobnosti obrade i prezentiranja antigena u ciklusu imunosti urođene raku (141). Tip IFN-a također povećava ekspresiju citotoksičnih medijatora u CTL-ovima i sprječava NK stanice da očiste aktivirane CD8 plus CTL-ove, dok istovremeno održava fenotip pamćenja i utječe na funkcije supresije Treg-a (142). Kada različite klase receptora za prepoznavanje uzoraka (PRR), uključujući Toll-like receptore (TLR), RNA-sensing retinoic acid inducible gen (RIG)-I-like receptore (RLR) i citosolne DNA senzore prepoznaju molekularne obrasce povezane s patogenima ili molekularnih uzoraka povezanih s oštećenjem, inducira se regrutiranje TBK1, zajedno sa sukcesivnom aktivacijom IRF3/7 i NF-kB, što konvencionalno povećava ekspresiju gena stimuliranog IFN-om (ISG) i generaciju IFN-a tipa I (143). Zamislivo je da bi se odgovarajuća stimulacija IFN-ova tipa I i povezanih signalnih putova mogla razviti kao učinkovita antitumorska imunoterapija.

3.2.1 PRMT i TLR putovi

Prepoznavanje molekularnog uzorka povezanog s patogenom putem TLR-a doprinosi pojačanoj regulaciji transkripcije različitih gena. Faktor 6 (TRAF6) povezan s receptorom faktora tumorske nekroze (TNFR) identificiran je kao ključni signalni put ovisan o primarnom odgovoru mijeloične diferencijacije 88 (MyD88) s imunoregulacijskim funkcijama, koji je nizvodno od TLR-ova (143). PRMT1 je metilirao i deaktivirao TRAF6 kako bi suzbio put TLR ovisan o TRAF6-. Ovo potiskivanje je poništeno jumonji domenom koja sadrži 6 (JMJD6), s TRAF6 demetiliranim pomoću JMJD6. Omjer PRMT1/JMJD6 odredio je aktivaciju TLR puta ovisnog o MyD88-. Argininska metilacija TRAF6 bila je povezana s nižom aktivnošću TRAF6 i nizvodno NF-kB, dok je izloženost ligandu TLR prolazno smanjila PRMT1, dovodeći do demetilacije TRAF6 aktivacijom JMJD6 i NF-kB, zatim, nakon što je signal prekinut, PRMT1 ponovno blokirao put ovisan o TRAF6- (144) (Slika 3).

3.2.2 PRMT-ovi i RIG-I put

U RIG-I putu, identificirana je važna uloga PRMT5 u metilaciji IFI16/IFI204; Metilacija IFI16/IFI204 aktivirala je dsRNA-inducirane RIG-I/TLR3-posredovane odgovore interferona tipa I, iako je IFI16/IFI204 obično služio proteinu koji osjeti DNA (19, 145). PRMT7 formira agregate za mono-metilaciju mitohondrijskog antivirusnog signalnog proteina (MAVS) na R52, inhibirajući njegovu interakciju s RIG-I i TRIM31-pokrećući MAVS K63-povezanu poliubikvitinaciju na katalitički ovisan način. PRMT7 je inhibirao aktivaciju MAVS-a i nizvodno virusom izazvane molekularne događaje (IRF3, IkB i STAT1 fosforilacija), ali ih je spasio PRMT7 inhibitor, SGC3027 (146). MAVS je regrutirao i TRAF3 i TRAF6 kako bi formirao kompleks MAVS/ TRAF3/TRAF6 koji je u interakciji s TBK1 i IKK aktivirao proizvodnju IRF3 i IFN tipa I (147). U ranim fazama infekcije virusom, PRMT7 je bio autometiliran na R32, onemogućavajući njegovu enzimsku aktivnost i agregaciju. SMURF1 je potom regrutiran u PRMT7 na način ovisan o MAVS-u kako bi katalizirao K48-povezanu poliubikvitinaciju PRMT7 kako bi se osigurala njegova pravovremena proteasomalna razgradnja i naknadna aktivacija RIG-I-MAVS, dok je SMURF1 razgradio MAVS, TRAF3, TRAF6 ili USP25 u kasnijim fazama virusne infekcije kako bi se izbjegla prekomjerna aktivacija RLR signala (146).

Kod zebrica, PRMT2, PRMT3 i PRMT7 oslabili su antivirusne odgovore potiskivanjem RIG-IMAVS signalnog puta. Lys63-povezana auto-ubikvitinacija TRAF6 spriječena je PRMT2-posredovanom asimetričnom dimetilacijom R100 na TRAF6, čime je inaktivirano Nemodependent TBK1/IKKϵ signaliziranje (148). PRMT2 se također natjecao s MAVS-om za vezanje TRAF6 i spriječio regrutiranje TBK1/IKKϵ na MAVS (148). Kroz dva gore navedena mehanizma, PRMT2 nepovoljno kontrolira fosforilaciju IRF3/IRF7 i ekspresiju nizvodno tip I IFN gena (148). Ovi su autori također sugerirali da i PRMT3 i PRMT7 utječu na fosforilaciju IRF3 i potiskuju proizvodnju IFN-a interakcijom s RIG-I (149, 150) (Slika 4).