Zaštitni učinci novog Wenshen Shengjing decoctiona na ciklosporinom izazvano oštećenje sinteze testosterona i spermatogene apoptoze
Mar 03, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
XIAOYAN PAN, XIYAN WANG, XUENAN WANG, WANSHENG ZHANG4, ZHANXUAN SUN1, XUAN XUAN LIANG, XUE ZHANG, WENJUN LI i ZHIXIN LI
Sažetak
Cilj ove studije bio je istražiti potencijalne zaštitne učinke novog Wenshen Shengjing decoctiona (novi WSSJD; uključujući Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum i Angelica Sinensis) na ciklosporinom izazvano oštećenje sinteze testosterona i spermatogene apoptoze u miševa. Ukupno 90 odraslih mužjaka Kunming miševa podijeljeno je u sljedećih 6 skupina: kontrola (bez intervencije), dimetilsulfoksid (DMSO; primao samo DMSO), ciklosporin A (CSA), klomifen citrat (CC; CsA plus CC, 15 mg/kg /dan), WSSJD (CsA plus WSSJD, sirovi lijek 12 g/kg/dan) i novi WSSJD (CsA plus novi WSSJD, sirovi lijek 12 g/kg/dan). Svi miševi su liječeni 30 dana oralnom sondom. Testisi su zatim fiksirani i obojeni hematoksilinom i eozinom kako bi se procijenio razvoj sjemenonosnog epitela. Imunohistokemijske tehnike korištene su za otkrivanje ekspresije receptora luteinizirajućeg hormona (LHR) i cijepanja bočnog lanca P450 (P450scc) u Leydigovim stanicama testisa. Osim toga, apoptoza spermatogenih stanica u testisima otkrivena je pomoću terminalne deoksinukleotidil transferaze posredovane dUTP nick-end analize, a protočna citometrija korištena je za analizu stope preživljavanja i rane apoptoze spermija u epididimisu. U usporedbi sa skupinama CsA i CC, nova primjena WSSJD značajno je povećala razine serumskog testosterona i ekspresije LHR i P450scc u Leydigovim stanicama testisa (P<0.05), while="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" seminiferous="" tubules="" and="" early="" apoptosis="" of="" mature="" sperm="" were="" significantly="" decreased=""><0.05). these="" results="" suggest="" that="" new="" wssjd="" may="" ameliorate="" csa-induced="" spermatogenic="" damage="" in="" male="" mice="" by="" enhancing="" testosterone="" synthesis="" and="" the="" secretion="" of="" testicular="" leydig="" cells,="" and="" by="" reducing="" the="" apoptosis="" of="" spermatogenic="">
Uvod
Ciklosporin A (CSA) često je korišteno imunosupresivno sredstvo koje specifično cilja T-stanice i inhibira izlučivanje interleukina-2 te dramatično povećava stopu uspjeha transplantacija jetre, bubrega i rožnice, kao i stopu preživljavanja primatelji (1-3). Međutim, imunosupresija izazvana dugotrajnom primjenom CsA značajno povećava rizik od kardiovaskularnih bolesti, infekcija i malignih tumora (4). Eid i suradnici (5) izvijestili su da su koncentracija i pokretljivost spermija u negativnoj korelaciji s koncentracijom CsA u serumu kod muških primatelja transplantiranog bubrega, što sugerira da CsA može inducirati disfunkciju reproduktivnog sustava kod muških primatelja. Nadalje, dokumentirano je da CsA može biti odgovoran za oslabljenu spermatogenezu i oštećenje muškog reproduktivnog sustava (6).
Prethodne studije pokazale su da CsA smanjuje razinu testosterona u serumu utječući na biosintezu i izlučivanje testosterona u testisima. He i suradnici (7) primijetili su da su štakori tretirani s 40 mg/kg/dan CsA pokazali značajno više razine luteinizirajućeg hormona (LH) i značajno niže razine testosterona u serumu, što je dovelo do oslabljenog razvoja testisa. Ali i suradnici (8) izvijestili su da je liječenje CsA smanjilo ekspresiju LH receptora (LHR) na membrani Leydigovih stanica, što je potom smanjilo LH-posredovanu sintezu testosterona i izlučivanje iz Leydigovih stanica. Drugo istraživanje Seethalakshmija i suradnika (9) izvijestilo je da CsA smanjuje razinu testosterona nekooperativnom inhibicijom aktivnosti 17 alfa-hidroksilaze i kompetitivnom aktivnošću 17 -hidroksisteroid dehidrogenaze tijekom biosinteze testosterona, a primarno mjesto za inhibiciju CsA bio je prekinuti ciklički adenozin monofosfatna stimulacija. Nadalje, ovo je izvješće pokazalo da smanjeno lučenje testosterona izazvano CsA u Leydigovim stanicama izravno utječe na razvoj muškog reproduktivnog sustava i održavanje reproduktivne sposobnosti. Seethalakshmi i suradnici (10) ubrizgali su egzogeni testosteron u štakore tretirane CsA kako bi povećali razinu endogenog testosterona. Uočeno je da su povišene doze egzogenog testosterona značajno obnovile težinu reproduktivnih organa, serumske razine folikulostimulirajućeg hormona (FSH) i povećale broj zametnih stanica, što ukazuje da se oštećenje spermatogeneze izazvano CsA može djelomično spriječiti egzogenim davanje testosterona (10). Međutim, utvrđeno je da egzogeni testosteron nije dovoljan u popravljanju oštećenog tkiva testisa, budući da je izlučivanje testosterona i spermatogeneza još uvijek pod utjecajem CsA, a visoke stope apoptoze primijećene su u spermi i spermatogenim stanicama (10).
Wenshen Shengjing decoction (WSSJD) sastoji se od 15 biljnih lijekova, prvenstveno uključujući Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicorneum i Angelica Sinensis (11). Dokazano je da WSSJD ublažava spermatogenu apoptozu izazvanu ciklofosfamidom (11). Kako bi se dodatno poboljšao terapijski učinak WSSJD-a, ova je studija razvila novi WSSJD koji se temelji na mehanizmu oštećenja tkiva testisa uzrokovanog CsA-om prilagođavanjem doze komponenti WSSJD-a. Suvremene farmakološke studije pokazale su da baršunasti rogovi kod WSSJD-a mogu djelovati kao spolni hormon (12); Radix Astragali može poboljšati proliferaciju i opskrbu Sertolijevim stanicama testisa hranjivim tvarima (13), a Panax ginseng može smanjiti razine hiperoksida u testisima i inhibirati spermatogenu apoptozu (14). Gore navedeni lijekovi također mogu poboljšati rad bubrega i potaknuti razvoj spermatogenih stanica (12-14). U prethodnim kliničkim studijama dokazano je da klomifen citrat (CC) ima terapeutski učinak na mušku neplodnost (15,16). Nadalje, CC je povezan s poboljšanim parametrima testosterona i sjemena, a zaštitni mehanizmi CC mogu biti slični onima kod WSSJD (15,16). Osim toga, u studiji koju su proveli Wang i suradnici (17), CC je korišten kao kontrola liječenja kako bi se istražio učinak kineskog lijeka Shengjing na poremećaje spermatogeneze kod miševa. Na temelju toga, CC je korišten kao pozitivna kontrola u ovoj studiji.
U ovoj studiji istražen je mehanizam na kojem se temelji zaštitni učinak novog WSSJD-a u tkivima testisa kako bi se odredila terapijska učinkovitost modificiranog lijeka. Razjašnjavanje zaštitnog mehanizma može pružiti osnovu za korištenje novog WSSJD-a u poboljšanju spermatogenog oštećenja izazvanog CsA.
Učinci Cistanche deserticola: Spriječitispermatogena oštećenja
Materijali i metode
Životinje. Ukupno 90 mužjaka Kunming miševa (starih 8- tjedana; 35-40 g) osigurao je Changchun Institute of Biological Products Co., Ltd. (Changchun, Kina). Ovo istraživanje provedeno je uz odobrenje Etičkog odbora Medicinskog sveučilišta Jilin (Changchun, Kina). Miševi su držani na 21±3˚C i 55-65 posto relativne vlažnosti u ciklusu tama-svjetlo od 12 sati. Miševi su dobili slobodan pristup standardnoj prehrani laboratorijskih miševa i sterilnoj vodi.
Priprema WSSJD. 15 komponenti kineske medicine WSSJD-a, uključujući Cornu Cervi Nippon Parvum, Panax ginseng, Cynomorium solarium,Cistanche deserticola, Radix Astragali, Epimedium brevicornum i Angelica Sinensis (11), kupljeni su od Tongrentanga (Peking, Kina). Ovi materijali su dekoktirani prema tradicionalnoj metodi kineske medicinske dekokcije (18). Ukratko, sastojci su vagani prema receptu i dodano je ukupno 250 ml destilirane vode da se začinsko bilje potopi. Bilje se namače 30 minuta i zatim zagrije. Biljke su najprije kuhane 10 minuta, a zatim je vatra smanjena na laganoj vatri 20 minuta. Nakon 30 min zagrijavanja, tekući dekokt je odvojen od biljaka, koje su dalje dekoktirane sa 200 ml destilirane vode na 80˚C još 30 min. Ovaj postupak je ponovljen i konačni volumen dekokcijske tekućine je filtriran kroz 4-5 slojeva gaze. U procijeđeni uvarak iscijedila se i tekućina iz biljaka. Uvarak je zatim zagrijavan na 80°C u vodenoj kupelji 6-7 h dok koncentracija nije dosegla 2 g sirove droge/ml, a uvarak je pohranjen na 4°C prije upotrebe. novi WSSJD pripremljen je na temelju formulacije WSSJD s manjim prilagodbama doza Panax ginsenga, Cynomorium solarium, Radix Astragali i Epimedium brevicornum. Metoda dekoktiranja bila je ista kao kod WSSJD. novi WSSJD sastoji se od sljedećeg: Panax ginseng, 6 g; Cynomorium solarij, 9 g; Radix Astragali, 12 g; Epimedium brevicornum, 6 g; Cornu Cervi Nippon Parvum, 1 g;Cistanche deserticola, 9 g; Angelica Sinensis, 6 g; Flatstem Milkvetch sjeme, 9 g; Rhizoma Dioscoreae, 15 g; Velika glavica Atractylodes Rhizome, 6 g; Ligusticum wallichii, 3 g; Radix Paeoniae Alba, 6 g; Cinnamomum cassia, 1 g; Costustoot, 1,5 g, i Fructus Foeniculi, 3 g.
Koncentracije sirovih ekstrakata lijeka određene su kako slijedi: Težina sirovog materijala/konačni volumen. Ova metoda izračuna naširoko se koristi u proučavanju tradicionalne kineske medicine (19-21). Primjena lijekova. Miševi su nasumično podijeljeni u 6 skupina (15 miševa po skupini) i primijenjen im je lijek intragastrično. Skupine su bile sljedeće: Kontrola (normalna fiziološka otopina); dimetilsulfoksid (DMSO); CsA; CC; WSSJD; i novi WSSJD. Miševima u skupinama s CsA, CC, WSSJD i novim WSSJD intraperitonealno (ip) je ubrizgavano 15 mg/kg/dan CsA (Shanxi Powerdone Pharmaceutics Co., Ltd., Datong, Kina) tijekom 30 dana, kako je prethodno opisano (8 ). Miševi u kontrolnoj i DMSO skupini podvrgnuti su dnevnoj ip injekciji s jednakim volumenom fiziološke otopine ili DMSO otapala, redom, tijekom 30--dnevnog eksperimentalnog razdoblja. Koncentracija DMSO razrijeđenog u fiziološkoj otopini bila je 3,25 posto (v/v). Skupini CC primijenjeno je 21,6 mg/kg/dan CC (GKH Pharmaceutical, Ltd., Guangzhou, Kina) kao što je prethodno opisano (13), koji je također razrijeđen u 3,25 posto (v/v) DMSO (pH{{14} }.2). Miševima u skupinama s WSSJD i novim WSSJD davano je 12 g sirovog lijeka/kg/dan WSSJD, odnosno novog WSSJD.Bojanje hematoksilinom i eozinom (H&E). Testisi miševa su sakupljeni i odmah fiksirani u 4 posto paraformaldehidu (pH =7.2) na sobnoj temperaturi tijekom 24 sata, nakon čega je uslijedila dehidracija etanolom, tretman ksilenom za uklanjanje etanola, umetanje voska i rezanje. Histološki isječci (5 um) dobiveni su uporabom rotacijskog mikrotoma. Oni su pričvršćeni na stakalce za H&E bojenje. Isječci testisa promatrani su korištenjem histopatološke mikroskopije s istaknutim točkama kako bi se procijenio razvoj sjemenih tubula i dobili histometrijski podaci. Razvijenost sjemenih tubula procijenjena je Johnsenovim sustavom bodovanja (22).
ELISA. Na dan 30 tretmana, miševi su anestezirani s 10 posto kloral hidrata (Shanghai Guoyao Chemical Reagent Co., Ltd) pri 0,004 ml/g tjelesne težine ip prije eutanazije s CO2. Krv trupa je sakupljena, a serum je odvojen i pohranjen na -20˚C. Ukratko, krv je skupljena u epruvete od 1,5 ml i pohranjena na 4°C preko noći. Epruveta je zatim centrifugirana na 1300 xg na 4˚C tijekom 6 minuta i serum je sakupljen. ELISA setovi (Shanghai Elisa Biotech Co., Ltd., Šangaj, Kina) korišteni su za određivanje sadržaja testosterona u serumu (kat. br. EIA-2380) i LH (kat. br. EIA-2385 ) prema protokolu proizvođača. Optička gustoća (OD) određena je pomoću čitača mikropločica Model 680 (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, SAD), a razine testosterona i LH određene su na temelju standardne krivulje.
Imunohistokemija. Tkiva testisa su fiksirana u 4 postotnom formaldehidu na sobnoj temperaturi 24 sata i uklopljena u parafin. Parafinske sekcije su izrezane na sekcije od 5 µm i zatim deparafinizirane. Vraćanje antigena postignuto je inkubacijom sekcija u 0.01 M citratnom puferu (pH=6.0) na 95-98˚C tijekom 5 minuta. Sekcije su zatim blokirane s 5 posto goveđeg serumskog albumina (Sigma-Aldrich; Merck KGaA, Darmstadt, Njemačka; A3675) na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata. Nakon blokiranja, sekcije su inkubirane sa zečjim poliklonalnim antitijelima protiv LHR (kat. br. L6792; Sigma-Aldrich; Merck KGaA; 1:200) ili P450 cijepanja bočnog lanca (P450scc; kat. br. ab75497; Abcam, Cambridge, UK ; 1:200) na 4˚C preko noći u mraku. Metoda streptavidin-biotin kompleksa (SABC) korištena je za otkrivanje ekspresije LHR i P450scc pomoću SABC kita (SA2010; Boster Biological Technology, Pleasanton, CA, SAD), prema protokolu proizvođača. Za tkiva izolirana iz miševa negativne kontrole, primarno antitijelo je zamijenjeno PBS-om. Leydigove stanice sa žutim ili smeđim bojama na membrani ili plazmi smatrale su se LHR-pozitivnim stanicama. Pet slajdova je dobiveno iz svakog uzorka i pet polja u područjima Leydigovog tkiva je odabrano nasumično i procijenjeno pod fluorescentnim mikroskopom (povećanje, x400). Prosječna OD pozitivnih stanica u područjima Leydigovog tkiva dobivena je pomoću softvera Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, Inc., Rockville, MD, SAD). Ekspresije LHR i P450scc bile su proporcionalne vrijednostima OD, pri čemu više vrijednosti OD predstavljaju veću ekspresiju proteina.
Test dUTP nick-end označavanja (TUNEL) posredovan terminalnom deoksinukleotidil transferazom (TdT). Testisi miša su secirani, umetnuti u vosak i izrezani. Sekcije (debljine 5- µm) zatim su obojene korištenjem kompleta za ispitivanje TUNEL (MK1024; Boster Biological Technology), u skladu s protokolom proizvođača. Ukratko, tkiva testisa iz kontrolnih (normalna fiziološka otopina), DMSO, CsA, CC, WSSJD i novih WSSJD skupina obojena su upotrebom 1:100 razrjeđenja antitijela na digoksin obilježenog biotinom tijekom 30 minuta na 37˚C. Obojano intersticijsko epitelno tkivo štakora (dostavljeno u kompletu) korišteno je kao pozitivna kontrola, a uzorci inkubirani s PBS umjesto biotinom obilježenog digoksin protutijela korišteni su kao negativna kontrola. Učestalost TUNEL-pozitivnih stanica koje pokazuju zeleno obojenje jezgre procijenjena je pomoću laserskog skenirajućeg konfokalnog mikroskopa. Ukupno 10 nasumičnih polja procijenjeno je pod velikim povećanjem (x400) i izbrojane su pozitivne stanice. Izračunat je srednji broj pozitivnih stanica po polju.
Bojanje propidijevim jodidom (PI) ili aneksin V‑fluorescein izotiocijanatom (FITC) i analiza protočnom citometrijom. Kauda epididimis je sakupljen slijedećim žrtvovanjem i epidermis je izrezan oštricom da se oslobodi sperma iz epididimisa u 2 ml PBS na 37°C da se dobije suspenzija epididimisa. Suspenzije su zatim inkubirane na 37˚C 10 minuta kako bi spermija isplivala. Agregacije sperme su odbačene, a preostali uzorci sperme su izolirani i resuspendirani u PBS da se dobije koncentracija od 106 stanica/ml. Apoptoza spermija analizirana je pomoću pribora za otkrivanje apoptoze Annexin V-FITC (Nanjing KeyGen Biotech Co., Ltd., Nanjing, Kina), prema protokolu proizvođača. Ukratko, 1 ml suspenzije sperme obojen je s 10 µl PI ili s 500 µl pufera za vezanje i 5 µl Annexin V-FITC u mraku 10 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su odmah analizirane Epics XL protočnom citometrijom (Beckman Coulter, Inc.) i korištenjem TetraONE™ sustava (6915050; Beckman Coulter, Inc.). Stanice u ranim fazama apoptoze identificirane su Annexin V-pozitivnim bojanjem, a nekrotične stanice su identificirane PI-pozitivnim bojanjem.
Statistička analiza. Analiza podataka provedena je pomoću softvera SPSS 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL, SAD) i izražena kao srednja vrijednost plus ili ± standardna devijacija kako je naznačeno. Razlike između skupina procijenjene su u smislu značajnosti pomoću jednosmjerne analize varijance nakon koje je slijedio Tukeyev post hoc test. P<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Cistanche deserticola
Rezultati
Učinci novog WSSJD-a na razvoj sjemenih tubula testisa. Kako bi se istražio potencijalni zaštitni učinak novog WSSJD-a na razvoj sjemenih tubula testisa miša, morfologija testisa miša obojenih H&E uspoređena je pod svjetlosnim mikroskopom. Seminiferni tubuli miševa iz CsA i CC skupina pokazali su skupljanje ruba tubula, smanjeni promjer tubula i smanjene slojeve testikularnog sjemenog epitela u usporedbi s kontrolom. Osim toga, spermatogene stanice pokazale su neuredan raspored, broj spermatogenih stanica je smanjen i nekoliko zrelih spermija bilo je vidljivo u lumenu (slika 1). U miševa iz DMSO, WSSJD i novih WSSJD skupina bilo je vidljivo više slojeva sjemenonosnog epitela testisa, a rubovi sjemenovoda bili su integrirani bez skupljanja ili kolapsa (slika 1). Johnsen rezultati nisu se značajno razlikovali između DMSO skupine i kontrolnih skupina, ili između CC i DMSO skupina. Međutim, Johnsen rezultat bio je značajno smanjen u skupini CsA i skupini WSSJD u usporedbi s kontrolnom skupinom, a rezultati skupina WSSJD i novih WSSJD bili su značajno povećani u usporedbi s grupom CC ili CsA (P<0.05; table="" i).="" these="" results="" indicated="" that="" new="" wssjd="" and="" wssjd="" promoted="" the="" development="" of="" seminiferous="" epithelium="" following="" csa="">
Učinci novog WSSJD-a na serumski testosteron i LH. Nakon toga su izmjerene razine testosterona i LH u serumu. Serumske razine testosterona i LH nisu bile promijenjene nakon primjene DMSO-a. Nasuprot tome, serumski testosteron bio je značajno smanjen, a LH je bio značajno pojačan u miševa tretiranih CsA, u odnosu na kontrole (P<0.05; fig.="" 2),="" and="" new="" wssjd="" administration="" significantly="" restored="" testosterone="" to="" near="" control="" levels=""><0.05; fig.="" 2).="" for="" serum="" lh,="" the="" protective="" effects="" of="" wssjd="" were="" similar="" to="" that="" of="" cc;="" however,="" new="" wssjd="" decreased="" serum="" testosterone="" to="" a="" significantly="" lower="" level="" than="" that="" observed="" with="" cc="" and="" wssjd=""><0.05; fig.="" 2),="" suggesting="" a="" superior="" protective="" effect="" of="" new="" wssjd="" over="" cc="" or="">
Učinci novog WSSJD na ekspresiju LHR i P450scc. Ekspresija P450scc i LHR procijenjena je u Leydigovim stanicama testisa imunohistokemijom (Slike 3 i 4). U kontrolnoj skupini, LHR je eksprimiran na vanjskim membranama Leydigovih stanica između sjemenih tubula (Slika 3A), a P450cc je eksprimiran u citoplazmi Leydigovih stanica testisa (Slika 4A). Tretman DMSO nije imao značajan učinak na ekspresiju LHR i P450scc. Nasuprot tome, liječenje CsA značajno je smanjilo ekspresiju LHR i P450scc u usporedbi s kontrolnim miševima (P<0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" turn,="" the="" expressions="" of="" lhr="" and="" p450scc="" were="" significantly="" increased="" by="" treatment="" with="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" compared="" with="" the="" csa="" group=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b).="" in="" addition,="" levels="" of="" lhr="" and="" p450scc="" in="" testicular="" leydig="" cells="" were="" significantly="" higher="" in="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" mice="" compared="" with="" cc="" mice=""><0.05; figs.="" 3b="" and="" 4b),="" and="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" upregulation="" than="" wssjd=""><0.05; figs.="" 3b="" and="">
Učinak novog WSSJD na apoptozu spermatogenih stanica. Apoptoza spermatogenih stanica u testisima miša analizirana je TUNEL testom. Jezgre apoptotskih stanica uglavnom su uočene u spermatogoniji i primarnim spermatocitima (slika 5A). Spermatogoniji su veći od spermatocita i nalaze se bliže bazalnoj membrani (23). Liječenje DMSO-om nije imalo značajan učinak na broj apoptotičkih spermatogenih stanica u testisima. Nasuprot tome, tretman s CsA značajno je povećao broj apoptotskih spermatogenih stanica u usporedbi s kontrolnim i DMSO skupinama (P<0.05; fig.="" 5b).="" in="" turn,="" administration="" of="" cc,="" wssjd,="" or="" new="" wssjd="" significantly="" reduced="" csa-induced="" apoptosis=""><0.05; fig.="" 5b).="" furthermore,="" the="" number="" of="" apoptotic="" testicular="" spermatogenic="" cells="" in="" the="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" groups="" was="" significantly="" reduced="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05), and="" new="" wssjd="" was="" significantly="" more="" effective="" than="" wssjd=""><0.05; fig.="">
Učinci novog WSSJD-a na preživljavanje i ranu apoptozu spermija. Kako bi se potvrdili zaštitni učinci novog WSSJD protiv apoptoze spermija izazvane CsA, utvrđeno je preživljavanje i rana apoptoza spermija u epididimisu. Epididimalni spermiji obojeni su PI ili Aneksinom V i analizirani protočnom citometrijom (slike 6 i 7). Nakon gore navedenih rezultata, liječenje CsA značajno je smanjilo postotak živih spermija i značajno povećalo postotak ranih apoptotičkih spermija (P<0.05; figs.="" 6b="" and="" 7b),="" while="" dmso="" treatment="" had="" no="" effect.="" wssjd="" and="" new="" wssjd="" significantly="" increased="" the="" percentage="" of="" live="" sperm=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" reduced="" the="" percentage="" of="" early="" apoptosis="" sperm=""><0.05; fig.="" 7b)="" compared="" with="" csa="" treatment.="" the="" percentages="" of="" live="" and="" early="" apoptotic="" sperm="" in="" wssjd="" and="" cc="" mice="" did="" not="" differ="" significantly,="" while="" new="" wssjd="" induced="" a="" significantly="" greater="" increase="" in="" live="" sperm="" percentage="" compared="" with="" the="" cc="" group=""><0.05; fig.="" 6b)="" and="" significantly="" decreased="" the="" percentage="" of="" early="" apoptotic="" sperm="" compared="" with="" the="" cc="" and="" wssjd="" groups=""><0.05; fig.="">
Rasprava
Prethodno je dokumentirano da dugotrajna uporaba CsA kao imunosupresivnog sredstva utječe na reproduktivnu sposobnost (6). Xu (24) je izvijestio da su morfologija i vitalnost spermija u pacijenata liječenih CsA bili znatno niži nego u neliječenoj skupini, što je primijećeno u uzorcima sjemena 26 primatelja bubrežnog presatka liječenih različitim dozama CsA i 12 zdravih dobrovoljaca. Također je primijećeno da su stope deformacije glave sperme bile značajno veće u primatelja liječenih CsA (24). Ovi rezultati sugeriraju da CsA ima učinak ovisan o dozi na parametre sjemena. Stoga su opravdane studije kako bi se identificirali novi farmakološki agensi sposobni ublažiti oštećenje testisa izazvano CsA i poboljšati mušku reproduktivnu sposobnost nakon transplantacije organa.
Specifično mikrookruženje testisa potiče spermatogenezu, pa stoga oštećenje strukture i funkcije testisa može dovesti do zaustavljanja spermatogeneze (25). Monteiro i suradnici (26) tretirali su Wistar štakore s CsA u dozi od 15 mg/kg dnevno tijekom 56 dana, te su uočili povećan volumetrijski udio vezivnog tkiva i smanjen volumetrijski udio Leydigovih stanica u štakora tretiranih s CsA. Također je uočeno da je CsA uzrokovao degeneraciju sjemenog epitela, što je rezultiralo vakuolizacijom Sertolijevih stanica, abnormalnim okruglim i izduženim spermatidima i nakupljanjem rezidualne citoplazme na rubu epitela uz lumen (26). U ovoj studiji Kunming miševi su tretirani s 15 mg/kg CsA dnevno tijekom 30 dana, što je dovelo do skupljanja i smanjenog promjera sjemenih tubula, smanjenja slojeva sjemenog epitela, poremećaja rasporeda sjemenih stanica, smanjenja zrelih spermija u lumenu i značajno smanjen Johnsen rezultat.
Osim toga, tretman s CsA ozbiljno je oštetio strukturu testisa. Ova studija također je procijenila zaštitne učinke novog WSSJD-a, kao novog kineskog lijeka, na testise miševa tretiranih CsA. Uočeno je da su slojevi sjemenog epitela testisa i raspored sjemenih stanica obnovljeni nakon tretmana novim WSSJD-om. Osim toga, miševi u novoj WSSJD skupini pokazali su integrirane sjemenonosne tubule bez skupljanja ili kolapsa i imali su značajno viši Johnsen rezultat u usporedbi s miševima tretiranim CsA. Ovi rezultati sugeriraju da je WSSJD značajno popravio oštećenje testisa izazvano CsA, što ukazuje da bi ovaj biljni lijek mogao biti učinkovit tretman u prevenciji oštećenja testisa izazvanog CsA. Ovisi li ovaj popravak stanica o niši unutar epitela također je važno pitanje koje bi trebalo istražiti u budućim studijama.
Os hipotalamus-hipofiza-testisi ima važnu ulogu u regulaciji genitalne aktivnosti (27). Razvoj i funkcionalnost muških spolnih organa regulirani su hormonima iz hipotalamusa i hipofize (28). Krueger i suradnici (29) tretirali su štakore Sprague Dawley s 25 mg/kg/dan CsA ili 40 mg/kg/dan CsA tijekom 6 dana i primijetili da su razine LH i FSH u serumu porasle 2-4 puta, dok je ekspresija P450scc smanjio na 30 posto u odnosu na kontrolnu skupinu. Osim toga, razine testosterona u serumu bile su značajno smanjene kod miševa tretiranih CsA, što je rezultiralo oslabljenom spermatogenezom (29). U ovom je istraživanju pokazano da liječenje CsA značajno smanjuje ekspresiju LHR u Leydigovim stanicama. Iako je LH u serumu bio povećan, smanjena ekspresija LHR-a mogla je oslabiti oporavak biosinteze testosterona posredovan LH-om i smanjiti ekspresiju P450scc, kao enzima koji ograničava brzinu biosinteze testosterona (30), čime je utjecao na biosintezu testosterona u Leydigovim stanicama. Novi sastojci u novom WSSJD-u, kao što je dlakavi rog, pokazuju učinke slične spolnim hormonima (12), koji mogu poboljšati razinu testosterona u serumu i smanjiti razinu LH u serumu, čime se povećava ekspresija LHR-a i p450scc u Leydigovim stanicama. Značajno, sadašnji rezultati pokazuju da je novi WSSJD stimulirao biosintezu i lučenje testosterona u Leydigovim stanicama za poticanje spermatogeneze.
Oksidativni stres uzrokovan CSA-om i oštećenje testisa uzrokuju displaziju spermija i spermatogenih stanica (31). Zabilježeno je da dugotrajno liječenje CsA oštećuje antioksidativni sustav u tkivima testisa životinja, što dovodi do smanjenih razina glutationa, glutation peroksidaze i vodikovog peroksida te povećanih razina malonskog dialdehida u testisima (31). Stoga se prekomjerne razine reaktivnih vrsta kisika u tkivima testisa ne mogu eliminirati, što dovodi do peroksidacije lipida membrane spermija, oštećenja DNA i smanjene vitalnosti spermija. U ovoj studiji uočeno je da liječenje CsA značajno povećava lomljenje DNA i stopu apoptoze spermatogenih stanica u sjemenovodnim tubulima. Stopa preživljenja spermija u epididimisu također se smanjila, dok je postotak rano apoptotičnih spermija povećan, što ukazuje na značajno oštećenje spermatogene aktivnosti testisa. Türk i suradnici (32) dokumentirali su da je zaštitni učinak elaginske kiseline na CsA-inducirano oštećenje testisa bio povezan s oksidativnim stresom u mužjaka štakora. Novi WSSJD korišten u ovoj studiji sadrži različite antioksidativne komponente, uključujući biljni lijek Ginseng, za koji je prethodno dokazano da značajno smanjuje razine hiperoksida u testisima (14).
U ovoj su studiji ispitivani učinci novog WSSJD-a na CsA-inducirano oštećenje sinteze testosterona i spermatogene apoptoze, te je uočeno da je novi WSSJD značajno smanjio stope apoptoze spermatogenih stanica i spermija, te tako popravio oštećenje testikularnog sjemenovoda epitel. Morfologija sjemenih tubula testisa i apoptoza spermatogenih stanica i spermija istraženi su histokemijom i protočnom citometrijom. Iako distribucija staničnog ciklusa i dnevna proizvodnja sperme nisu istraženi, oni će biti u fokusu budućih studija naše grupe.
WSSJD je značajno povećao razinu testosterona u testisima i smanjio apoptozu spermatogenih stanica i spermija, što je učinkovito popravilo oštećenje testisa izazvano CsA. Ovi rezultati pokazuju da bi novi WSSJD mogao biti koristan farmakološki agens u liječenju i prevenciji oštećenja testisa izazvanog CsA.
Cistanche deserticola cijelo korijenje
Reference
1. Pedersen M i Seetharam A: Infekcije nakon ortotopske transplantacije jetre. J Clin Exp Hepatol 4: 347-360, 2014.
2. Vora GK i Ciolino JB: Reakcija alografta rožnice povezana s nonokularnom upalom. Digit J Ophthalmol 20: 29-31, 2014.
3. De Pasquale C, Veroux M, Indelicato L, Sinagra N, Giaquinta A, Fornaro M, Veroux P i Pistorio ML: Psihopatološki aspekti transplantacije bubrega: Učinkovitost multidisciplinarnog tima. World J Transplant 4: 267-275, 2014.
4. El-Gowelli HM i El-Mas MM: Centralna modulacija hipertenzije izazvane ciklosporinom. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol 388: 351-361, 2015.
5. EidMM, Abdel-Hamid IA, SobhMA i el-SaiedMA: Procjena karakteristika kretanja spermija u neplodnih primatelja transplantata bubrega korištenjem kompjuterizirane analize. Int J Androl 19: 338-344, 1996.
6. Zahra A, Gholamreza N, Farokhi F i Shalizar Jalali A: Ublažavanje oštećenja sperme izazvanog ciklosporinom i embriotoksičnosti vodenim ekstraktom ploda crataegus monogyna. Ćelija J 15: 198-205, 2013.
7. He Z, Qiu J, LiJ, Zhao D, Chen G i Chen L: Dugoročni učinci pretvorbe s ciklosporina na rapamicin na funkciju i morfologiju testisa u modelu transplantacije štakora. Transplant Proc 45: 763-769, 2013.
8. AliRB, KlouzA, Boubaker S, LakhalM i BelkahiaC: Životinjski model toksičnosti testisa ciklosporinom: Procjena i zaštita. Fundam Clin Pharmacol 23: 241-246, 2009.
9. Seethalakshmi L, Flores C, Malhotra RK, Pallas JD, Tharakan D, Khauli RB i Menon M: Mehanizam djelovanja ciklosporina u inhibiciji biosinteze testosterona Leydigovim stanicama štakora in vitro. Transplantacija 53: 190-195, 1992.
10. SeethalakshmiL, FloresC, CarboniAA i Menon M: Kvantitativno održavanje spermatogeneze u štakora tretiranih ciklosporinom egzogenom primjenom testosteron propionata. J Androl 11: 491-497, 1990.
11. Pan XY, Wang XY, Wang XN, Sun ZX, Wang D, Wang X, Yang YY i Li ZX: Učinci 'Wenshen Shengjing decoction' na apoptozu spermatogenih stanica izazvanu ciklofosfamidom i dimetilaciju histona H3K9. Shanghai Zhong Yi Yao Za Zhi 48: 82-86, 2014. (na kineskom).
12. Xu ZH, Li SF, Wang JY, Zhou R i Tian SJ: Ekstrakcija spolnog hormona iz baršunastog roga superkritičnim CO2. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 32: 2000-2003, 2007. (na kineskom).
13. Zhao LP, Xu Z, Zhang M, Sun HC i Tang F: Učinci Fructus Lycii i Radix astragali na funkciju Sertolijevih stanica u testisima štakora. Zhonghua Nan Ke Xue 13: 82-86, 2007. (na kineskom).
14. Xu L, Liu XH i Zhang L: Učinci ukupnih ginsenozida na NO, NOS i ukupni kapacitet antioksigena u testisu miša. Acta Academiae Medicinae CPAPF 5: 507-508, 2006 (na kineskom).
15. Patel DP, Brant WO, Myers JB, Presson AP, Johnstone EB, Dorais JA, Aston KI, Carrell DT i Hotaling JM: Sigurnost i učinkovitost klomifen citrata u hiperandrogenih i subfertilnih muškaraca. Int J Impot Res 27: 221-224, 2015.
16. ElSheikh MG, Hosny MB, Elshenoufy A, Elghamrawi H, Fayad A i Abdelrahman S: Kombinacija vitamina E i klomifen citrata u liječenju pacijenata s idiopatskim oligo kao azoospermijom: prospektivna, randomizirana studija. Andrologija 3: 864-867, 2015.
17. Wang R, Xu L, Zhang WX, Wu YF, Shi JH i Zhang YX: Granule Shengjing: učinkovit kineski lijek za spermatogene poremećaje kod miševa. Zhonghua Nan Ke Xue 14: 1046-1049, 2008 (na kineskom).
18. Fan BT: Kineska medicina Pharmacy, Shanghai Science and Technology Press 12: 62-68, 1997. (na kineskom).
19. Zhang J, Li H, Lu L, Yan L, Yang X, Shi Z i LiD: Formula Yiqi i Yangyin ublažava ozljede hematopoetskog sustava izazvane zračenjem cijelog tijela. J Radiat Res 58: 1-7, 2017.
20. Minami M, Konishi T, Jiang Z, Arai T i Makino T: Učinak Shin'iseihaita na mišju alergijsku reakciju izazvanu nazalnom senzibilizacijom. J Tradit Complement Med 6: 252-256, 2015.
21. Rong R, Li RR, Hou YB, Li J, Ding JX, Zhang CB i Yang Y: Uvarak Mahuang-xixin-fuzi smanjuje infekciju virusom influence a kod miševa sa sindromom nedostatka bubrega. J Ethnopharmacol 192: 217-224, 2016.
22. Johnsen SG: Testicular biopsy score count-metoda za registraciju spermatogeneze u ljudskim testisima: normalne vrijednosti i rezultati kod 335 hipogonadalnih muškaraca. Hormoni 1: 2-25, 1970.
23. Mays-Hoopes LL, Bolen J, Riggs AD i Singer-Sam J: Priprema spermatogonija, spermatocita i okruglih spermatida za analizu ekspresije gena korištenjem razvrstavanja stanica aktiviranih fluorescencijom. Biol Reprod 53: 1003-1011, 1995.
24. Xu LG: Utjecaj ciklosporina A na parametre sjemena pacijenata nakon transplantacije bubrega. J Clin Urol 20: 603-605, 2005.
25. Pintus E, Ros-Santaella JL, i Garde JJ: Izvan veličine testisa: Poveznice između spermatogeneze i svojstava sperme kod sezonskog rasplodnog sisavca. PLoS One 10: e0139240, 2015.
26. Monteiro JC, Predes FS, Matta SL i Dolder H: Infuzija Heteropterys aphrodisiaca smanjuje kolateralne učinke ciklosporina A na testise. Anat Rec (Hoboken) 291: 809-817, 2008.
27. Oseko F, Napomena S, Morikawa K, Endo J, Taniguchi A i Imura H: Utjecaj kronične hiperprolaktinemije inducirane sulpiridom na osovinu hipotalamo-hipofiza-testisi u normalnih muškaraca. Fertil Steril 44: 106-111, 1985.
28. Wisniewski P, Romano RM, Kizys MM, Oliveira KC, Kasamatsu T, Giannocco G, Chiamolera MI, Dias-da-Silva MR i Romano MA: Izloženost odraslih bisfenolu A (BPA) kod Wistar štakora smanjuje kvalitetu sperme uz poremećaj osovine hipotalamus-hipofiza-testisi. Toksikologija 329: 1-9, 2015.
29. Krueger BA, Trakshel GM, Sluss PM i Maines MD: Depresija receptora luteinizirajućeg hormona posredovana ciklosporinom i biosinteza hema u testisima štakora: mogući mehanizam za smanjenje serumskog testosterona. Endokrinologija 129: 2647-2654, 1991.
30. Nolan CJ i Payne AH: Genotip na lokusu P450scc određuje razlike u količini proteina P450scc i maksimalnoj proizvodnji testosterona u Leydigovim stanicama miša. Mol Endocrinol 4: 1459-1464, 1990.
31. Türk G, Ateşşahin A, Sönmez M, Yüce A i Ceribaşi AO: Likopen štiti od toksičnosti testisa izazvane ciklosporinom A kod štakora. Theriogenology 67: 778-785, 2007. 32. Türk G, Sönmez M, Ceribaşi AO, Yüce A i Ateşşahin A: Ublažavanje ciklosporinom A induciranih oštećenja testisa i spermija povezanih s oksidativnim stresom elaginskom kiselinom. Int Immunopharmacol 10: 177-182, 2010.
