Dio 1: Ehinakozid povećava količinu sperme kod štakora ciljanjem na hipotalamički androgen receptor
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Zhihui Jiang1,2, Bo Zhou2, Xinping Li2, Gordon M. Kirby3 i Xiaoying Zhang1,2
Kliknite ovdje za 2. dio
Muška neplodnost veliki je zdravstveni problem s procijenjenom prevalencijom od 4,2 posto muške neplodnosti diljem svijeta. Naš rani rad je to pokazaoEkstrakti cistančeštite od oštećenja sperme kod miševa i toehinakozid(ECH) jedna je od glavnih aktivnih komponenti. Ovdje izvješćujemo o ključnoj ulozi ECH-a, prirodnog proizvoda koji poništava ili štiti od oligoastenospermije kod štakora. ECH je ispitan HPLC-om, kvantiteta i kvaliteta sperme je procijenjena, a razina hormona je određena radio-imunosorbentnim testom. ECH je smanjio razine androgenog receptora (AR) i ključnih gena povezanih sa steroidogenima, što je utvrđeno Western blotom i qPCR analizom. Interakcija između ECH i AR procijenjena je neizravnom ELISA i molekularnim spajanjem. Rezultati pokazuju da ECH u kombinaciji s hipotalamičkim AR u džepu Met-894 i Val-713 inhibira prijenos AR iz citoplazme u jezgre u hipotalamusu. Dok je negativna povratna sprega regulacije spolnih hormona bila inhibirana, pozitivna povratna sprega je stimulirana da poveća izlučivanje luteinizirajućeg hormona i testosterona, što je posljedično povećalo količinu sperme. Uzeti zajedno, ovi podaci pokazuju da ECH blokira aktivnost AR u hipotalamusu kako bi se povećala količina sperme i zaštitio od oligoastenospermije kod štakora.
Proizvodnja testosterona u stanicama testisa snažno je regulirana osovinom hipotalamus-hipofiza-gonada (HPG) stvaranjem homeostatske povratne sprege1. Gonadotropin-oslobađajući hormon (GnRH), koji luči hipotalamus, može potaknuti lučenje luteinizirajućeg hormona (LH) iz hipofize, što dodatno potiče proizvodnju testosterona u Leydigovim stanicama testisa. Testosteron se biosintetizira nizom steroidogenih enzima. Kao jedan od glavnih putova, steroidogeni akutni regulatorni (StAR) protein može transportirati kolesterol iz intracelularnih izvora u mitohondrije2 gdje je izložen enzimu cijepanja bočnog lanca kolesterola (CYP11A1), 3 -hidroksisteroid dehidrogenazi (HSD3), { {10}}hidroksilaza (CYP17A1) i 17 -hidroksisteroid dehidrogenaza (HSD 17 ) koje kataliziraju pretvorbu kolesterola u testosteron3,4. Testosteron se zatim negativno vraća na HPG element kako bi smanjio daljnje lučenje LH na način ovisan o dozi.
Učinak testosterona na povratnu spregu HPG osi događa se vezanjem na androgeni receptor (AR), koji se nalazi i u hipotalamusu i u hipofizi5. U miševa, ablacija AR-a i minimalna proizvodnja testosterona uzrokuju povećanje razine LH i folikulostimulirajućeg hormona (FSH)6, što sugerira da AR sudjeluje u regulaciji negativne petlje hranjenja. Klasični genomski mehanizam signalizacije testosterona događa se kada testosteron difundira u stanicu i veže se za AR. Ovaj kompleks ligand-receptor zatim se translocira u jezgru gdje se veže za elemente androgenog odgovora (ARE) u regulatornim regijama gena koji reagiraju na testosteron kako bi modificirali njihovu translokaciju. Testosteron također inducira neklasični put djelovanja steroidnih hormona, karakteriziran brzim događajima koji dovode do aktivacije citosolnih signalnih kaskada koje inače pokreću faktori rasta7,8. Klasični i neklasični putevi testosterona doprinose održavanju spermatogeneze i plodnosti. Međutim, funkcija AR je važnija u klasičnom putu jer testosteron djeluje na povećanje kvalitete sperme.
Ehinakozid(ECH) jedna je od bioaktivnih komponenti dobivenih iz ljekovite biljne vrste Echinacea9 iCistanche10. Sa širokim spektrom farmakoloških aktivnosti, ekstrakti Echinacee su 1Research Center of Modern Biotechnology, School of Biotechnology and Food Engineering, Anyang Institute of Technology, Anyang, Henan, 455000, Kina. 2Koledž veterinarske medicine, Sveučilište Northwest A & F, Yangling, Shaanxi, 712100, Kina. 3Odjel za biomedicinske znanosti, Veterinarski fakultet Ontario, Sveučilište Guelph, Guelph, Ontario, N1G 2W1, Kanada. Korespondenciju i zahtjeve za materijale treba uputiti na XZ
jedan od najpopularnijih biljnih dodataka prehrani u Europi i SAD-u uglavnom zbog svojih antioksidativnih svojstava11 i sposobnosti sprječavanja prehlade12. Zanimljivo,Ekstrakti cistanče i ECH tradicionalno se koriste kao tonik za liječenje reproduktivne disfunkcije i za poticanje muške seksualne aktivnosti u tradicionalnoj kineskoj medicini10. Neki OTC proizvodi tvrtkeCistanche ekstrakti su razvijeni kao hranjivi dodaci prehrani i postaju sve popularniji na tržištima zdrave hrane u Kini i nekim drugim azijskim zemljama (Kineska agencija za hranu i lijekove)13. Međutim, temeljni mehanizmi djelovanja ECH ostaju nejasni.
Muška neplodnost je veliki zdravstveni problem s procijenjenom prevalencijom od 4,2 posto muške neplodnosti u svijetu14. Dijagnoza muške neplodnosti trenutno se temelji na proučavanju kvalitete sperme uključujući analizu sjemenih parametara kao što su koncentracija spermija, pokretljivost i morfologija15. Estrogen-mimik Bisfenol A (BPA) široko je rasprostranjen zagađivač okoliša koji je proučavan zbog svog utjecaja na plodnost muškaraca kod nekoliko vrsta životinja i ljudi16. BPA remeti hipotalamo-hipofizno-gonadalnu osovinu, inhibira ekspresiju steroidogenih enzima testisa i sintezu testosterona u muške mladunca17, uzrokujući stanje hipogonadotropnog hipogonadizma18. U ovoj studiji istražujemo učinke ECH na kvalitetu sperme i razine hormona. Osim toga, BPA je odabran kao sredstvo modela ozljede sperme za daljnje proučavanje zaštitnog učinka ECH protiv loše kvalitete sperme.
Ekstrakti cistanče
Rezultati
ECH povećava količinu sperme. Broj spermija u kaudi epididimisu, vitalnost spermija i pokretljivost spermija prikazani su u tablici 1. Liječenje s 80 mg/kg ECH i 15 mg/kg testosteron propionata (TP) značajno je povećalo broj spermija u epididimisu. Međutim, nije bilo značajne razlike u održivosti spermija i pokretljivosti spermija.
ECH povećava razinu testosterona i LH u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima. Liječenje ECH značajno je povećalo razine LH u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima (slika 1A). U skupini ECH(H), razine LH značajno su porasle za 1.1-put u serumu, 1.4-put u encefalonu plus hipofizi i 1.2-put u testisima. Testosteron je značajno povećan za 1,5 odnosno 1{10}}struko u encefalonu plus hipofizi i testisima, ali ne i u serumu nakon tretmana ECH(H). Nakon tretmana TP-om, razine testosterona bile su značajno povećane za 1,6, 1,8 i 1.4-put u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima.
ECH je povećao ekspresiju gena steroidogenog enzima. ECH je značajno povećao ekspresiju ključnih steroidogenih enzima u testisu (slika 1B). Razine mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 i HSD17 u ECH(H) skupini povećane su više od 3-puta, dok razine StAR mRNA nisu pokazale značajne razlike sa svim ECH tretmanima (p > 0.05). TP nije značajno promijenio ekspresiju CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 i HSD17. To se odražava u sveobuhvatnoj analizi toplinske karte učinka ECH na ekspresiju steroidogenih enzima koja ukazuje da je ECH značajno povećao razine mRNA CYP11A1, CYP17A1, HSD3 1/2 i HSD17, a posebno HSD3 1/ 2 (slika 1C).
ECH može prijeći krvno-moždanu barijeru i u manjoj mjeri krvno-testisnu barijeru. Za procjenu androgene povratne sprege na HPG-osi, sposobnost ECH da uđe u hipotalamus procijenjena je u nizu PK studija. Koncentracije ECH-a otkrivene su u hipotalamusu nakon 12 sati jednokratne oralne primjene 30 mg/kg ECH-a, a ECH je pokazao izrazito prodiranje u hipotalamus sa srednjim omjerom hipotalamus/plazma od 33,92 posto (slika 2A). Vrijednosti T1/2 bile su 2,61 ± 0,42 h, odnosno 1,88 ± 0,22 h u plazmi i hipotalamusu (slika 2B). Međutim, HPLC-om je detektiran vrlo ograničen pristup ECH u testis. Koncentracije ECH u testisima bile su 0.083 ug/mL, 0.043 ug/mL i 0,028 ug/mL 0,5 h, 1 h i 1,5 h, redom, nakon liječenje.
ECH smanjuje hipotalamičku translokaciju AR u jezgru. Kako bi se testirao učinak ECH na translokaciju AR, ekspresija AR u citoplazmi i jezgri testisa i hipotalamusa određena je pomoću Western blot analize. Kao što je prikazano na slici 3A, ECH je smanjio AR protein u hipotalamičkim jezgrama puta u usporedbi s kontrolnom skupinom. Liječenje enzalutamidom, inhibitorom AR, smanjilo je razine AR proteina u jezgrama hipotalamusa za 4.8-puta. Primjetno je da je citoplazmatski AR bio veći kod liječenja ECH-om i enzalutamidom nego kod kontrolne skupine, što sugerira da ECH blokira prijenos AR-a iz citoplazme u jezgru u hipotalamusu. Kao što se očekivalo, ECH ne inhibira transport AR iz citoplazme u jezgru u testisu (slika 3B).
ECH je povećao ekspresiju gena povezanih s HPG osi. ECH je značajno povećao ekspresiju LH, LHR, GnRH 1 i Gnrhr u mješavini encefalona i hipofize, međutim, nije bilo značajne razlike u razinama GnRH 1 nakon tretmana TP. Analiza toplinske karte pokazuje da su ekspresije GnRH 1 i LH bile najveće među genima povezanim s HPG-osi.
Slika 1. Učinak ECH na razine LH, testosterona i glavnih steroidogenih enzima. Napomena: (A) razine LH u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima (mIU/mL, srednja vrijednost ± SD);
razine T u serumu, encefalonu plus hipofizi i testisima (ng/mL, srednja vrijednost ± SD); (B) ekspresija glavnih steroidogenih enzima;
(C) hijerarhijsko grupiranje ekspresije mRNA različitih steroidogenih enzima u testisima. Zelena, zeleno-crvena i crvena boja predstavljaju niske,
srednje i visoke zastupljenosti, n=7. a,b,c Različita slova označavaju statistički različite skupine (p <>
Slika 2. Distribucija i farmakokinetički parametri ECH u hipotalamusu. Napomene: (A) omjeri hipotalamus/plazma (postoci) izračunati su na temelju izloženosti plazme i hipotalamusa ECH (koncentracija) na 0.5 h, 1.0 h, 1.5 h, 2.{ {8}} h, 2,5 h, 3.0 h, 6.0 h, 9.0 h i 12.0 h nakon oralne primjene. (B) Farmakokinetički (PK) parametri ECH u plazmi i hipotalamusu. T1/2, poluživot; Cmax, vršna koncentracija; Vz/F, prividni volumen distribucije; MRT, srednje vrijeme zadržavanja; AUC, površina ispod krivulje koncentracija-vrijeme.
AR je meta ECH-a. Kako bi se potvrdili odnosi između ECH i AR, uspješno je sintetiziran ECH-ovalbumin (ECH-OVA) (Sl. 5A,B). Molekulska težina ECH-OVA je veća od OVA, tako da imaju različite stope pokretljivosti (Slika 5A), a vrh apsorbancije ECH-OVA je između ECH i OVA (Slika 5B),
Ekstrakti cistanče
Lik 3. Učinak ECH na transport AR u testisima i hipotalamusu. Bilješke: (A) Učinak ECH na transport AR u hipotalamusu. Razine AR proteina određene su Western blot analizom, a stupci predstavljaju denzitometrijsku kvantifikaciju nuklearnog AR normaliziranog na Lamin B i citoplazmatskog AR normaliziranog na GAPDH. Svaka vrijednost predstavlja srednju vrijednost ± SD šest neovisnih eksperimenata. a,b,c Različita slova iznad stupaca označavaju statistički različite skupine (p < 0.05);="">B) Učinak ECH na transport AR u testisu.
što sugerira da je ECH uspješno konjugiran s OVA. Neizravni rezultati ELISA (slika 5C) pokazuju da je anti-AR antitijelo sposobno detektirati AR protein prisutan u jažicama koje sadrže ECH-OVA (naznačeno anti-OVA antitijelom) što sugerira da se ECH može vezati na AR protein.
ECH se kombinira s AR džepom Met-894 i Val-713. Spoj ECH je spojen na mjesto AF2 na površini ljudskog AR, a teoretski način vezanja ECH i AR prikazan je na slici 5D. Spoj ECH usvojio je kompaktnu konformaciju koja se veže na džep ljudskog AR. Dvije fenilne skupine ECH vežu se na hidrofobnu domenu AR džepa i održavaju bliske hidrofobne kontakte s ostacima Leu-712, Val-716, Met-734, Ile-737 , Met-894 i Ile-898, dok su druge dvije strane ECH bile postavljene na ulazu u džep i ostvarile su samo nekoliko kontakata. Detaljna analiza pokazala je da i Met-894 (duljina veze: 2,4 Å) i Val-713 (duljina veze: 2,7 Å) formiraju vodikove veze s hidroksi1 skupinama ECH, što je bila glavna interakcija između ECH i ljudski AR.
ECH smanjuje reproduktivna oštećenja izazvana BPA. Kako bi se istražio učinak ECH na reproduktivna oštećenja, ispitana je kvaliteta sperme i razina spolnih hormona i steroidogenih enzima u miševa induciranih BPA. Kao što je prikazano na slici 6, liječenje BPA značajno je smanjilo broj spermija i pokretljivost spermija za 26,5 posto, odnosno 39,2 posto. Primjena ECH-a spriječila je smanjenje broja spermija i pokretljivosti spermija za 35,5 posto, odnosno 30,1 posto. Primjena BPA također je rezultirala značajnim smanjenjem lučenja LH i T, a ECH je značajno povećao razine LH i T za 24,1 posto odnosno 18,3 posto u usporedbi sa samim liječenjem BPA (Slika 6A,B). Razine mRNA StAR, CYP17A1, 3 -HSD i 17 -HSD u liječenju BPA-ECH značajno su povećane u usporedbi s liječenjem BPA (Slika 6C,D).
Slika 4. Promjene u ekspresiji gena povezanih s HPA nakon tretmana ECH. Napomene: (A–D) stupci predstavljaju razine mRNA LH, LHr, Gnrh 1 i Gnrhr u encefalonu i hipofizi. a,b,c Različita slova iznad stupaca označavaju statistički različite skupine (p < 0.05).="" (e)="" hijerarhijsko="" grupiranje="" ekspresije="" mrna="" različitih="" steroidogenih="" enzima.="" zelena,="" zeleno-crvena="" i="" crvena="" boja="" predstavljaju="" nisku,="" srednju="" i="" visoku="" zastupljenost,="" n="7." kontrola="" (tretirana="" fiziološkom="" otopinom="" od="" 10="" ml/kg),="" ech(l)="" (tretirana="" s="" ech="" 5="" mg/kg),="" ech(m)="" skupina="" (tretirana="" s="" ech="" 20="" mg/kg),="" ech(h)="" (tretirana="" s="" ech="" 80="" mg/kg),="" tp="" (tretirano="" s="" tp="" 15="">
