Zaštitni učinak eteričnog ulja Thymus Serrulatus na nefrotoksičnost izazvanu kadmijem u štakora, kroz suzbijanje oksidativnog stresa i nižu regulaciju ekspresije NF-κB, INOS i Smad2 MRNA
Mar 17, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Mohd Nazam Ansari1,*, Najeeb Ur Rehman1,*, Aman Karim2, Faisal imam3 i Abubaker M. Hamad4,5
Cistanche deserticola ma za bubrežne bolesti, kliknite ovdje da biste dobili uzorak
Sažetak:
Svrha istraživanja bila je ispitati zaštitni učinak eteričnog ulja iz thymus serru latus Hochst. bivši Benth. (TSA ulje) protivkadmij(Cd)-induciranbubrežnitoksičnost. Eksperimentalni protokol osmišljen je korištenjem 30 zdravih odraslih Wistar albino štakora raspoređenih u grupe sa šest životinja u svakoj skupini. Skupina 1 tretirana je kao normalna kontrola, a skupine 2, 3, 4 i 5 su tretirane skadmijklorid (CdCl2, 3 mg/kg, IP) tijekom 7 dana. Grupa 3 također je tretirana silimarinom (100 mg/kg, PO) kao standardnom skupinom, dok su skupine 4 i 5 primile TSA ulje u dozama od 100 odnosno 200 mg/kg PO. Nefrotoksičnost je mjerena različitim parametrima kao što sububregfunkcionalni markeri, markeri oksidativnog stresa (glutation (GSH) i malondialdehid (MDA)) i razine ekspresije glasničke ribonukleinske kiseline (mRNA) čimbenika upale. Histološke studije također su procijenjene u eksperimentalnom protokolu. Grupe liječene CdCl2-pokazale su značajan porast u razinama serumabubregfunkcijskih markera zajedno s razinama MDA u homogenatu bubrega. Međutim,bubrežniUtvrđeno je da je razina GSH značajno smanjena. Utvrđeno je da CdCl2 značajno povećava razine nuklearnog faktora kappaB(NF-κB p65), inducibilne sintaze dušikovog oksida (iNOS) i malih majki protiv dekapentaplegičara (Smad2) u usporedbi s normalnom kontrolnom skupinom. S druge strane, TSA ulje značajno je poboljšalo povećane razine serumskih markera funkcije bubrega, neenzimskih antioksidansa i lipidne peroksidacije. Osim toga, TSA ulje značajno je smanjilo povećanu ekspresiju NF-κBp65, iNOS i Smad2 u štakora pijanih Cd. Štoviše, histološke promjene u uzorcima tkiva bubrega skupina tretiranih kadmijem značajno su poboljšane u skupinama tretiranih silimarinom i TSA uljem. Ova studija otkriva da TSA ulje ublažava Cd-induciranbubrežniozljede, a također se predlaže da bi uočeni nefroprotektivni učinak mogao biti posljedica antioksidativnog potencijala TSA ulja i zacjeljivanja zbog njegovog protuupalnog djelovanja.
Ključne riječi:kadmij; upala; NF-κB; ozljeda bubrega; Smad 2; Thymus serrulatus
1. Uvod
Izloženost okoliša kemikalijama ostaje veliki javnozdravstveni problem na globalnoj razini. Izloženost kadmiju (Cd), jednom od najreaktivnijih toksičnih metala, povećala se u biosferi iz prirodnih i antropogenih izvora [1]. Izloženost Cd također je posljedica kontaminacije u tlu, zraku, vodi i hrani, kao i dimu cigareta [2]. Značajno povećana apsorpcija uz smanjenu brzinu izlučivanja dovodi do povećanog opterećenja Cd u različitim organima. Cd može oštetiti više organa ovisno o dozi, putu i trajanju, ali uglavnom utječebubregai uzrokuje oštećenje bubrega [3].
Thebubregasu vitalni organi u ljudskom tijelu i odgovorni su za različite bitne funkcije, uključujući uklanjanje štetnih metabolita, dušikovog otpada i nekih lijekova s urinom [4]. Ranije studije su pokazale da toksičnost Cd dovodi do nepovratne disfunkcijebubrežnitubula [5] i uzrokuje smanjeno uklanjanje toksičnih kemikalija, lijekova ili obojega što dovodi do akutnogbubregneuspjeh. Štoviše,bubrežniozljeda uzrokovana kroničnim izlaganjem Cd može dovesti do kroničnog zatajenja bubrega, a ako se ne liječi može dovesti do smrti [6,7]. Nakupljanje kadmija u proksimalnim zavijenim tubulima ometa tubularnu reapsorpciju i rezultira poliurijom i proteinurijom. Provedene su studije o uobičajenim abnormalnim učincima Cd na funkciju bubrega, ali još uvijek nedostaju detaljne informacije o molekularnim mehanizmima i potreba da se to dalje istraži [8].
Studije u posljednjih nekoliko desetljeća otkrile su da je najveća vjerojatnostbubrežnioštećenje je zbog otpuštanja kadmija u stanici koji izaziva oksidativni stres [9,10]. Jedan od predloženih mehanizama je poremećaj u prirodnom antioksidativnom obrambenom sustavu, koji dodatno uzrokuje prekomjernu proizvodnju slobodnih kisikovih radikala (OFR) [11] i rezultira smanjenom razinom glutationa (GSH) i, zauzvrat, apoptozom povezanom s oksidativnim stresom. 12]. Od nekoliko prijavljenih mehanizama, smanjeni sadržaj GSH i oštećenje stanica uzrokovano OFR-om uglavnom su odgovorni za peroksidaciju lipida [13,14].
Prijašnja literatura također otkriva da korelacija između oksidativnog stresa i upale pojačava različitebubrežnibolesti [15]. Stoga se može sugerirati da je renalna toksičnost uzrokovana Cd kroz složene unutarstanične signalne putove koji su uglavnom usmjereni oksidativnim stresom. Nuklearni faktor-κB (NF-κB) kontrolira nekoliko upalnih gena u svim vrstama stanica [16]. NF-κB je glavni uzrok raznihbubregbolesti i može se aktivirati izlaganjem Cd. Kronična bubrežna bolest otkrivena je i na ljudskim i na životinjskim modelima pojačanom regulacijom Smad2 proteina [9]. Ranije studije su pokazale da bi regulacija NF-κB i Smad2 mogla biti korisni mehanizmi za protuupalne lijekove [17].
Među politikama liječenja, hipoteza je da se smanjenje oksidativnog stresa izazvanog kadmijem korištenjem antioksidansa iz prirodnih ili sintetskih izvora smatra glavnim mogućim pristupom liječenju nefrotoksičnosti izazvane kadmijem. Stoga su istraživači nedavno tražili obrambene mehanizme protiv toksičnosti uzrokovane kemikalijama ili lijekovima te su također razmatrali biološki aktivne spojeve s antioksidativnim i upalnim učinkom [18,19].
U različitim dijelovima svijeta različite vrste roda Thymus tradicionalno se koriste za liječenje raznih poremećaja kao što su bronhitis, astma, pertusis, laringitis, tonzilitis i kašalj [20]. Thymus serrulatus Hochst. Ex Benth (obitelj Lamiaceae) raste u Etiopiji i tradicionalno se koristi za liječenje gripe [21] i kašlja [22]. T. serrulatus je mnogo razgranati višegodišnji grm koji raste u afromontanskom i afroalpskom području Etiopije i Eritreje [23].
T. serrulatus ima anthelmintičko, antibakterijsko, fungicidno [23], diuretičko [22], vazodilatacijsko [24] i antihiperlipidemsko [25] djelovanje. Nadalje, objavljeno je da eterično ulje T. serrulatus (TSA ulje) posjeduje antiseptička, antifungalna i svojstva protiv glista, među ostalim [26]. Eterično ulje biljke iz različitih etiopskih lokaliteta pokazalo je obećavajuće hepatoprotektivno djelovanje kod štakora [27]. Dodatno, prethodne studije su pokazale da su farmakološke aktivnosti eteričnog ulja u pozitivnoj korelaciji s prisutnošću aktivnih sastojaka kao što su timol, karvakrol, p-cimen, -terpinen i ružmarinska kiselina [26,27]. S druge strane, timol i karvakrol, koji su pronađeni kao glavni sastojci eteričnog ulja, važni su prirodni proizvodi s djelovanjem hvatanja slobodnih radikala i antioksidativnim svojstvima [28]. Prethodno istraživanje pokazalo je da kombinacija timola i karvakrola ima sinergistički nefroprotektivni učinak
učinak koji se može pripisati antioksidativnom, protuupalnom i antiapoptotičkom djelovanju [29]. Osim toga, timol i karvakrol, koji su pronađeni kao glavni sastojci u biljkama koje sadrže eterična ulja, također uzrokuju smanjenje imunoglobulina E (IgE), interleukina-4 (IL-4), interleukina{ {6}} (IL-5) i interleukina-13 (IL-13) kao i broj upalnih stanica koje uzrokuju poremećaje dišnih putova [30].
Koliko je nama poznato, učinak T. serrulatus na nefrotoksičnost nije prijavljen. Stoga smo u ovoj studiji postavili hipotezu i pokušali istražiti nefroprotektivni učinak eteričnog ulja ekstrahiranog iz T. serrulatus etiopskog podrijetla protiv nefrotoksičnosti izazvane Cd koristeći Wistar albino štakore procjenombubregfunkcijski markeri, upalni markeri, antioksidativni status i histološke promjene.
2. Rezultati
2.1. Prinos eteričnog ulja (postotak)
Hidrodestilacijom nadzemnog dijela T. serrulatusa dobiveno je 0,09 posto (v/w) blijedožutog eteričnog ulja karakterističnog mirisa.
2.2. Učinak TSA ulja na biomarkere funkcije bubrega
Utvrđeno je da su razine ureje u krvi, mokraćne kiseline, kreatinina i dušika ureje u krvi (BUN) značajno povišene (p < 0.01)="" kod="" štakora="" koji="" su="" bili="" liječeni="" samo="" kadmijem="" (3="" mg/kg,="" ip="" )="" 7="" dana.="" međutim,="" primjena="" tsa="" ulja="" i="" silimarina="" kod="" štakora="" pijanih="" cd-om="" znatno="" je="" poboljšala="">bubregoštećenja kao što je određeno smanjenim razinama uree u krvi, mokraćne kiseline, kreatinina i BUN-a (Slika 1A-D).
2.3. Učinak TSA ulja na peroksidaciju lipida i oksidativni stres
Thebubrežnitkivo štakora pokazalo je značajno povećane razine lipidne peroksidacije u smislu MDA i smanjenje sadržaja GSH nakon primjene Cd. Uz to, tretman TSA uljem u dozama od 100 i 200 mg/kg smanjuje razine MDA ovisno o dozi u štakora intoksikovanih kadmijem. Nadalje, razine GSH bile su značajno povišene u skupinama koje su primale TSA ulje i silimarin u usporedbi sa skupinom Cd (Slika 2A, B).
2.4. Učinci TSA ulja na ekspresiju mRNA p65, NF-κB, iNOS i Smad2
Promjene u signalnim događajima procijenjene su Western blotom. Western blot analiza sugerira da je izloženost Cd značajno (p < 0.001)="" povećala="" ekspresiju="" mrna="" nf-κb="" p65,="" inos="" i="" smad2="" u="" usporedbi="" s="" referentnom="" skupinom.="" tretman="" tsa="" uljem="" značajno="" je="" smanjio="" ekspresiju="" p65,="" nf-κb,="" inos="" i="" smad2="" mrna="" na="" način="" ovisan="" o="" dozi="" u="" odnosu="" na="" štakore="" koji="" su="" bili="" izloženi="" samo="" cd="" (slika="">
2.5. Učinak TSA ulja na histopatologiju
Histopatološka analiza štakora kontrolne skupine pokazala je normalnebubreghistološku arhitekturu s normalnim zavojitim tubulima, glomerulom i Bowmanovom kapsulom s normalnim prostorom, kao i normalnim statusom kolagenih vlakana i periodičnih Schiffovih (PAS)-pozitivnih materijala kao što je bazalna membrana (Slika 4). Fotomikrografije toksične skupine pokazuju abnormalne glomerule (G), degeneraciju (D) i nekrozu (N) uvijenih tubula te degeneriran i gotovo odsutan Bowmanov prostor. Abnormalni uvijeni tubuli ukazuju na histološki poremećaj (T), blokiran oštećenim tkivom (B) i nekrozu. Fotomikrografija toksične skupine obojene Massonovim trihomom (MT) pokazuje povećani kolagenski materijal (C). Štoviše, fotomikrografija toksične skupine obojene PAS-om pokazuje abnormalno taloženje PAS-pozitivnih materijala (P) koji su istisnuli parenhim bubrega; također pokazuje slabost ili gubitak intaktne bazalne membrane (L). Tretman TSA uljem u niskim dozama vratio je normalne glomerule i normalne zakrivljene tubule, iako je još uvijek bilo blagih toksičnih učinaka u obliku blokiranja tubula (B) i malo povećanog kolagenskog materijala (C), kao i abnormalnog taloženja PAS-pozitivni materijali (P). Tretman TSA uljem u visokoj dozi dao je histološke slike gotovo normalnog histološkog izgleda vrlo blizu standardnog tretmana (povećanje 400× i skala 20 µm za sve fotomikrografije).
3. Rasprava
U okolišu su teški metali obično prisutni i skloni su apsorpciji, oksidaciji i utjecaju na sudbinu stanica. Konkretno, Cd je prirodni industrijski spoj koji uzrokuje brojne toksične i opasne učinke, uključujući nefrotoksičnost, na ljudsko zdravlje [31,32]. Njegovo taloženje u raznim organima uzrokuje oksidativni stres koji slabi funkciju nativnog antioksidativnog sustava i posljedično dovodi do razvoja raznih teških patoloških bolesti [33]. Put toksičnosti uzrokovane kadmijem uključuje proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), što kasnije uzrokuje oštećenje bubrega [34]. Stoga se može pretpostaviti da bi antioksidansi mogli biti dobra meta za mogući terapeutski pristup toksičnosti povezanoj s kadmijem [35]. U ovom smo izvješću proučavali obećavajući meliorativni učinak TSA ulja na oksidativni stres izazvan kadmijem i oštećenje bubrega koristeći štakore.
Ozbiljno oštećenje bubrega izazvano kadmijem može biti povezano s povišenim razinama uree, mokraćne kiseline i kreatinina u serumu zbog curenja u krvotok [36,37]. U ovoj studiji, značajno povećane razine uree, mokraćne kiseline i kreatinina u serumu također su zabilježene nakon izlaganja Cd tijekom 7 dana, što je potvrdilo ozbiljno oštećenje bubrega (Slika 1). Uočeni rezultati potvrđuju prethodne studije [19,38]. Primjena TSA ulja u obje doze (100 i 200 mg/kg, PO) značajno poboljšava bubrežnu disfunkciju induciranu Cd koja je podržana sniženim razinama uree, mokraćne kiseline i kreatinina u serumu. U ovoj studiji primijećeno je da izloženost Cd dovodi dobubregoštećenja pojačavanjem peroksidacije lipida i remećenjem prirodnog antioksidativnog sustava, što ukazuje na povećani oksidativni stres. Promatrani nalazi sugeriraju da TSA ulje može spriječiti Cd-inducirane promjene u varijablama povezanim s antioksidansima kod štakora. Ovi su nalazi u skladu s onima Kawamota i sur. [39], koji su prijavili povećanu peroksidaciju lipida nakon izlaganja Cd. Ranije studije su pokazale da je kronična izloženost Cd rezultirala smanjenim neenzimskim (tkivnim GSH) antioksidansima [40]. Nalazi iz ove studije potvrđuju one Koyuturk et al. [41], koji su opisali smanjeni sadržaj GSH u bubrezima u štakora intoksiciranih kadmijem. Smanjeni sadržaj GSH mogao bi biti posljedica njegove potrošnje u prevenciji peroksidacije lipida uzrokovane oksidativnim stresom [41] i detoksikaciji teških metala [42,43]. Međutim, naši se nalazi ne slažu s onima Kamiyame i sur. [44], koji su opisali povišenu razinu bubrežnog GSH u štakora tretiranih kadmijem. Peroksidacija lipida i razina antioksidansa u štakora tretiranih kadmijem bili su značajno modulirani primjenom ulja TSA, što ukazuje na smanjenje ROS-a, ponovno uspostavljanje ravnoteže antioksidativnog obrambenog sustava ili oboje. Ovi nalazi potvrđuju one iz ranije studije koja je opisala učinak poboljšanja timokinona protiv kemijski induciranog oštećenja bubrega [45].
Apoptoza se javlja u tkivima i varira od nekroze kod određenih funkcionalnih poremećaja [46]. Apoptoza je jedna od glavnih karakteristika povezanih s Cdbubregozljeda. Ranije je opisano da toksičnost Cd uzrokuje apoptozu u proksimalnim tubulima kroz stimulaciju NF-kB puta, što pridonosi bubrežnoj disfunkciji [47,48]. U ovoj studiji također je uočena povećana ekspresija proteina NF-kBp65 kod štakora tretiranih kadmijem. Međutim, primjena TSA ulja kod štakora tretiranih Cd značajno je obnovila ekspresiju proteina NF-kBp65. Promatrani nalazi su u skladu s prethodnim nalazima [18,19]. Stoga je inhibicija NF-kB u štakora pijanih Cd dokazala protuupalno djelovanje TSA ulja.
Inducibilna sintaza dušikovog oksida (iNOS) jako je izražena u upalnim stanjima i infekcijama. Stoga je vitalna komponenta adaptivnog odgovora domaćina na štetne podražaje. Ranije je objavljeno da je oštećenje bubrega izazvano kadmijem posredovano sintezom dušikovog oksida stimulacijom iNOS [49]. U ovoj studiji također je otkriveno da izloženost Cd uzrokuje povećanu ekspresiju iNOS-a (Slika 3B), dok TSA ulje u obje doze može značajno preokrenuti ekspresiju iNOS-a u štakora pijanih Cd-om.
Prijašnja literatura navodi da je Cd jedan od najotrovnijih teških metala i da se uglavnom apsorbira u proksimalnim tubulima i akumulira uglavnom u bubrežnom korteksu, što dovodi do lezija u proksimalnim uvijenim tubulima [50]. Ovi nalazi potvrđuju nalaze ove studije. Majorbubregoštećenje je potvrđeno prisutnošću značajnog oštećenja glomerula u štakora tretiranih kadmijem. Ovi nalazi potvrđuju one Damek Poprawa i Sawicka-Kapusta [51], koji su izvijestili o atrofiji glomerularnih kapilara i nekrozi proksimalnih tubula. Nalazi odbubregfunkcijski markeri i markeri oksidativnog stresa—gdje je TSA ulje ublažilo degenerativne promjene izazvane kadmijem i poboljšalobubregdjelovanje zahvaljujući mogućim antioksidativnim i protuupalnim učincima—potvrđeno je histopatološkim promatranjima.
4. Materijali i metode
4.1. Kemikalije i reagensi
Kadmijev klorid (CaCl2) dobiven je od Sigma Chemicals Co. (St. Louis, MO, SAD).Bubregsetovi za dijagnostiku funkcije dobiveni su od Crescent Diagnostics (Jeddah, KSA). Protutijela (primarna i sekundarna) nabavljena su iz Santa Cruza (Dallas, TX, USA). Upotrijebljene kemikalije bile su analitičke čistoće i visoke kvalitete koje nisu zahtijevale daljnje pročišćavanje.
4.2. Biljni materijal i ekstrakcija
Svježi nadzemni dijelovi T. serrulatus Hochst. ex Benth prikupljen je iz područja planine Amba Alajemo, Južni Tigray, Etiopija. Biljni materijal potvrdio je botaničar, dr. Getinet Masresha, Odsjek za biologiju, Sveučilište Gondar, a uzorak je pohranjen u herbariju sveučilišta (TH-001/2011).
Svježi nadzemni dijelovi izrezani su na male komadiće i podvrgnuti hidrodestilaciji 3 sata uz pomoć Clevenger aparata. Hidrodestilacija je obavljena 11 puta dok se nije prikupila dovoljna količina. Dobiveno eterično ulje osušeno je bezvodnim natrijevim sulfatom i pohranjeno u dobro zatvorenoj posudi na 4 ◦C do daljnje uporabe [26]. Izračunati prinos eteričnog ulja izražen je u postocima (postotak v/w), na temelju težine svježeg biljnog materijala.
4.3. Životinje
Trideset mužjaka albino štakora težine 180-220 g dobiveno je iz Animal House, College of Pharmacy, Prince Sattam Bin Abdulaziz University (PSAU), KSA. Štakori su aklimatizirani 1 tjedan i držani u ciklusima svjetlo/tama od 12 sati sa standardnim laboratorijskim objektima. Tijekom pokusnog i aklimatiziranog razdoblja životinje su hranjene peletiranom hranom i slobodnim pristupom vodi. Upute i smjernice koje je dala jedinica za brigu o životinjama, PSAU, KSA, pridržavale su se prilikom izvođenja svih pokusa. Protokol je prethodno odobrio Odbor za bioetička istraživanja (BERC), PSAU (BERC-004-12-19).
4.4. Eksperimentalni dizajn
Za procjenu nefroprotektivnog učinka TSA ulja protiv toksičnosti izazvane kadmijem, štakori su nasumično raspoređeni u pet skupina (n=6). Grupa 1 (normalna kontrola) primala je fiziološku otopinu soli (0.9 posto NaCl) dnevno tijekom 7 dana. Grupa 2 (kontrola toksičnosti) primila je kadmijev klorid (3 mg/Kg, IP, 7 dana). Grupi 3 (pozitivna kontrola) su primijenjeni CdCl2 i silimarin (100 mg/kg, PO) 7 uzastopnih dana. Grupe 4 i 5 su zajedno davale CdCl2 i TSA ulje u dozama od 100 odnosno 200 mg/Kg (PO, 7 dana). Doza CdCl2 odabrana je na temelju prethodno objavljene literature [19,52].
Nakon 24 h tretmana, svi mužjaci štakora anestezirani su malom količinom dietil etera kako bi se prikupili uzorci krvi iz retro-orbitalnog pleksusa nakon čega je uslijedilo centrifugiranje, te je provedeno odvajanje seruma i pohranjeno na -20 ◦C do daljnje uporabe za određivanjebubregmarkeri funkcije (kao što su mokraćna kiselina, kreatinin i urea). Nakon uspješnog prikupljanja seruma, oba su bubrega izolirana od svih štakora. Lijevobubregodmah je pohranjen na -80 ◦C do daljnje analize markera oksidativnog stresa (MDA i GSH) i Western blot analize. U međuvremenu je desni bubreg pohranjen za histopatološke studije.
4.5. Određivanje biomarkera bubrežne funkcije
sBiomarkeri odbubregmokraćna kiselina, urea i kreatinin, procijenjeni su korištenjem specifičnih komercijalnih kompleta prema metodama navedenim u protokolima proizvođača.
4.6. Određivanje markera oksidativnog stresa u bubrezima
Tkiva su homogenizirana i samljevena (10 posto w/v) u ledeno hladnom 0,1 M fosfatnom puferu na pH 7,4, a otopina je centrifugirana 30 minuta na 12,000× g i 4 ◦ C. Dobiveni homogenat korišten je za procjenu razine GSH i MDA.
MDA marker lipidne peroksidacije procijenjen je prethodno opisanom metodom [53]. Ukratko, 0.25 mL homogenata je inkubirano na temperaturi od 37 stupnjeva 1 h u metaboličkoj mućkalici. Nakon inkubacije, dodano je 0.5 mL 0.67 posto tiobarbiturne kiseline (TBA) i 0.5 mL 5 posto (w/v) ohlađene trikloroctene kiseline (TCA) , nakon čega slijedi centrifugiranje (1000 x g, 15 min). Nakon toga, supernatant je držan u kipućoj vodenoj kupelji 10 minuta. Razvijena apsorbancija je izmjerena na 535 nm, tj. uočena je ružičasta boja.
Za GSH, Jollow et al. [54] slijedila se metoda. Ukratko, nakon taloženja 1 mL PMS-a s 1 mL sulfosalicilne kiseline (4 posto), testni uzorci su inkubirani (4 ◦C, 1 h), nakon čega je uslijedilo centrifugiranje (1200× g , 15 min, 4 ◦C). Testna smjesa sadržavala je supernatant (0.1 mL), fosfatni pufer (0.1 M, pH 7.4) (1.7 mL) i ditiol-bis-2-nitrobenzojevu kiselinu (DTNB) (0.4 posto u fosfatnom puferu, 0.1 M, pH 7,4) (0,2 mL) u ukupnom volumenu od 2,0 mL. Apsorpcija uzoraka je analizirana na 412 nm unutar 5 minuta nakon dodavanja DTNB u reakcijsku smjesu.
4.7. Western Blot tehnika
Western blot analiza i ekstrakcija proteina provedeni su kao što je spomenuto u prethodnoj studiji [55].Bubregtkiva su usitnjena i homogenat je pripremljen u smjesi inhibitora proteaze i hladnom puferu za lizu proteina [55]. Kako bi se izolirali ukupni proteini, tkivni lizati su čuvani u ledu 60 minuta, uz alternativno vrtloženje (nakon 10 minuta), nastavljeno centrifugiranjem na 12,000× g (4 ◦C, 10 minuta). Metoda Lowryja i sur. [56] je praćen kako bi se odredio ukupni protein. Za Western blot analizu, protein (25-50 µg) je nakratko izoliran iz svake skupine i premješten na nitrocelulozne membrane dobivene od Bio-Rad USA. Trenutno blokiranje proteinskih mrlja je učinjeno na 4 ◦C (tijekom 24 h); nakon toga je provedena inkubacija s primarnim protutijelima protiv NF-κB p65, iNOS i Smad2 i sekundarnim protutijelima konjugiranim s peroksidazom na sobnoj temperaturi. Proteini su analizirani uz pomoć pribora za detekciju kemiluminiscencije (GE Health Care, Mississauga, Kanada). Intenzitet proteinskih traka normaliziran je na beta-aktinske trake pomoću ImageJ (NIH, Bethesda, SAD). Slike su snimljene aC-Digit kemiluminescentnim Western blot skenerom dobivenim od LI-COR, SAD.
4.8. Histopatološka analiza
Pravobubreguzorci tkiva fiksirani u 10 posto neutralnom formalinu obrađeni su u stroju za obradu tkiva (ASP300s, Leica Biosystems, IL, SAD); svaki uzorak je ugrađen u parafinski vosak i narezan na dijelove debljine 4–5-µm. Odabrana su tri dijela svake skupine i obojena bojom hematoksilinom i eozinom (H&E), bojom periodnom kiselinom po Schiffu (PAS) i bojom Massonovim trikromom (MT) [57]. Svi dijelovi tkiva analizirani su pomoću mikroskopa (Olympus BX 52) za histopatološki opis koji je zabilježio histopatolog, slijep za eksperimentalne skupine. Za fotografiranje je korišten fotoaparat Olympus DP21 fiksiran iznad mikroskopa.
4.9. Statistička analiza
Vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SEM. Jednosmjerna ANOVA analiza korištenjem post hocTukey testa korištena je za mjerenje značajnosti biokemijskih podataka različitih skupina. Razlike su značajno izmjerene pri p vrijednostima < 0.05="" u="" odnosu="" na="" normalnu="" kontrolnu="" ili="" toksičnu="" kontrolnu="" skupinu.="" statističko="" istraživanje="" provedeno="" je="" korištenjem="" graphpadprism="" v.="" 4.0="">
5. Zaključci
Ova studija zaključuje da je eterično ulje T. serrulatus ublažilo oštećenje bubrega izazvano kadmijem, koje je vjerojatno bilo posredovano poboljšanjem promijenjenih biokemijskih i parametara oksidativnog stresa uz poboljšanje histoloških struktura. Nadalje, T. serrulatus bi mogao biti prikladno sredstvo koje će se u budućnosti razviti za zaštitu bubrega ibubreg-povezani poremećaji.
Financiranje:Ovo istraživanje nije dobilo vanjska sredstva.
Izjava o dostupnosti podataka:Dijeljenje podataka nije primjenjivo.
Sukob interesa:Autori izjavljuju da nema sukoba interesa. Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije; u prikupljanju, analizi ili interpretaciji podataka; u pisanju rukopisa; odnosno u odluci o objavi rezultata.
Dostupnost uzorka:Uzorci eteričnog ulja TSA dostupni su od autora.
Reference
1. Dua, TK; Dewanjee, S.; Khanra, R.; Bhattacharya, N.; Bhaskar, B.; Zia-Ul-Haq, M.; De Feo, V. Učinci dviju uobičajenih jestivih biljaka, Ipomoea aquatic i Enhydra fluctuans, na patofiziologiju izazvanu kadmijem: fokus na oksidativnu obranu i anti-apoptotski mehanizam. J. Transl. Med. 2015, 13, 245. [CrossRef] [PubMed]
2. Elkhadragy, MF; Abdel Moneim, AE Zaštitni učinak metanolnog ekstrakta Fragaria ananassa na hepatotoksičnost izazvanu kadmijevim kloridom (CdCl2) u štakora. Toxicol. Mech. Metode 2017, 27, 335–345. [CrossRef]
3. Wu, H.; Liao, Q.; Chillrud, SN; Yang, Q.; Huang, L.; Bi, J.; Yan, B. Izloženost kadmiju u okolišu: procjena rizika za zdravlje i njezina povezanost s hipertenzijom i oštećenom funkcijom bubrega. Sci. Rep. 2016, 6, 29989. [CrossRef]
4. Ferguson, MA; Vaidya, VS; Bonventre, JV Biomarkeri nefrotoksične akutne ozljede bubrega. Toksikologija 2008, 245, 182–193. [CrossRef] [PubMed]
5. Ibrahim, mr.; Almaden, AH; El Moneim, MA; Tammam, HG; Khalifa, AM; Nasibe, MN Hematološka, bubrežna i jetrena toksičnost izazvana kadmijem: poboljšanje pomoću Spirulina platensis. Saudi J. Forensic Med. Sci. 2018, 1, 5–13. [CrossRef]
6. Galley, HF Može li se akutno zatajenje bubrega spriječiti? JR Coll. Surg. Edinb. 2000, 45, 45–50. [PubMed]
7. Finn, W.; Porter, G. Urinarni biomarkeri i nefrotoksičnost. U Clinical Nephrotoxins, 2. izdanje; Kluwer Academic Publishers: Norwell, MA, SAD, 2003.; str. 621–655.
8. Prozialeck, WC; Edwards, JR Mehanizmi ozljede proksimalnog tubula izazvane kadmijem: Novi uvidi s implikacijama za biomonitoring i terapijske intervencije. J. Pharmacol. Exp. Ther. 2012, 343, 2–12. [CrossRef] [PubMed]
9. Lan, HY Različite uloge TGF-8/Smads u fibrozi i upali bubrega. Int. J. Biol. Sci. 2011, 7, 1056–1067. [CrossRef] [PubMed]
10. Luo, T.; Liu, G.; Dugi, M.; Yang, J.; Pjesma, R.; Wang, Y.; Yuan, Y.; Bian, J.; Liu, X.; Gu, J.; et al. Liječenje oksidativnog oštećenja bubrega izazvanog kadmijem u štakora primjenom alfa-lipoične kiseline. okoliš. Sci. Onečišćenje. Res. Int. 2017, 24, 1832–1844. [CrossRef] [PubMed]
12. Angeli, JK; Cruz Pereira, CA; de Oliveira Faria, T.; Stefanon, I.; Padilha, AS; Vassallo, DV Izloženost kadmiju uzrokuje vaskularnu ozljedu zbog endotelnog oksidativnog stresa: uloga lokalnog angiotenzina II i COX-2. Slobodan Radić. Biol. Med. 2013, 65, 838–848. [CrossRef]
12. Orororo, OC; Asagba, SO; Tonukari, NJ; Okandeji, OJ; Mbanugo, JJ Učinci Hibiscus Sabdarrifa L. antocijanina na oksidativni stres izazvan kadmijem kod Wistar štakora. J. Appl. Sci. okoliš. Upravitelj 2018, 22, 465–470. [CrossRef]
13. Inoue, M. Zaštitni mehanizmi protiv reaktivnih spojeva kisika. U Jetra: biologija i patobiologija, 5. izdanje; Arias, IM, Boyer, JL, Fausto, N., Jokoby, WB, Schachter, DA, Shafritz, DA, ur.; Raven Press: New York, NY, SAD, 2011.; str. 443–459.
14. Yadav, RK; Singh, M.; Roy, S.; Ansari, MN; Saeed, AS; Kaithwas, G. Modulacija odgovora na oksidativni stres lanenim uljem: uloga lipidne peroksidacije i temeljni mehanizmi. Prostaglandini Ostali lipidni mediji. 2018, 135, 21–26. [CrossRef] [PubMed]
15. Gong, X.; Ivanov, VN; Davidson, MM; Hei, TK Tetrametilpirazin (TMP) štiti od nefrotoksičnosti izazvane natrijevim arsenitom potiskivanjem proizvodnje ROS, mitohondrijske disfunkcije, proupalnih signalnih putova i programirane stanične smrti. Arh. Toxicol. 2015, 89, 1057–1070. [CrossRef] [PubMed]
16. Bonizzi, G.; Karin, M. Dva puta aktivacije NF-KB i njihova uloga u urođenom i adaptivnom imunitetu. Trendovi. Immunol. 2004, 25, 280–288. [CrossRef]
17. Imam, F.; Al-Harbi, NE; Al-Harbi, MM; Ansari, MA; Al-Asmari, AF; Ansari, MN; Al-Anazi, WA; Bahashwan, S.; Almutairi, MM; Alshammari, M.; et al. Apremilast sprječava doksorubicinom izazvanu apoptozu i upalu u srcu inhibicijom aktivacije NF-B signalnih putova posredovane oksidativnim stresom. Pharmacol. Rep. 2018, 70, 993–1000. [CrossRef]
19. Erboga, M.; Kanter, M.; Aktas, C.; Sener, U.; Erboga, ZF; Donmez, YB; Gurel, A. Thymoquinone ublažava kadmijem induciranu nefrotoksičnost, apoptozu i oksidativni stres kod štakora temelji se na njegovim anti-apoptotičkim i antioksidativnim svojstvima. Biol. Trace Elem. Res. 2016, 170, 165–172. [CrossRef]
19. Ansari, MN; Aloliet, RI; Ganaie, MA; Khan, TH; Rehman, N.; Imam, F.; Hamad, AM Roflumilast, inhibitor fosfodiesteraze 4, smanjuje renalnu toksičnost izazvanu kadmijem putem modulacije aktivacije NF-KB i indukcije NQO1 u štakora. Ljudsko iskustvo Toxicol. 2019, 38, 588–597. [CrossRef]
20. Begrow, F.; Engelbertz, J.; Feistel, B.; Lehnfeld, R.; Bauer, K.; Verspohl, EJ Utjecaj timola u ekstraktima majčine dušice na njihovo antispazmodičko djelovanje i čišćenje cilijara. Planta Med. 2010., 76, 311–318. [CrossRef]
