Priprema kompleksa ferulinske kiseline i fosfolipida za poboljšanje topljivosti, otapanja i aktivnosti inhibicije stanične melanogeneze B16F10

Sažetak

Pozadina

Ferulinska kiselina(FA; 4-hidroksi-3-metoksi cimetna kiselina) prisutna je u mnogim namirnicama, uključujući pšenicu, rižu, ječam, zob, citrusno voće i rajčice [1]. Pokazalo se da FA pruža značajnu zaštitu kože od oksidativnog stresa izazvanog UV zračenjem [2]. Vraća kronično oksidativno oštećenje izazvano UVB zračenjem u tumorima kože miševa modulirajući ekspresiju faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF), inducibilne sintaze dušikovog oksida (iNOS), faktora nekroze tumora (TNF)- i interleukina (IL){{7} } [3]. Također modulira ekspresiju mutiranog p53, Bcl-2 i Bax u tumorima kože miševa izazvanim UVB [4]. Nekoliko je studija pokazalo da FA inhibira ekspresiju citotoksičnih enzima i enzima povezanih s upalom [5] i matriksnih metaloproteinaza (MMP), te smanjuje razgradnju kolagenih vlakana [6].

Prema relevantnim studijama,cistancheje uobičajena biljka koja je poznata kao "čudotvorna biljka koja produžuje život". Njegova glavna komponenta jecistanozid, koji ima različite učinke poput antioksidativnog, protuupalnog i promicanja imunološke funkcije. Mehanizam izmeđucistancheiizbjeljivanje koželeži u antioksidativnom učinku glikozida cistanhe. Melanin u ljudskoj koži nastaje oksidacijom tirozina koju katalizira tirozinaza, a reakcija oksidacije zahtijeva sudjelovanje kisika, pa radikali bez kisika u tijelu postaju važan čimbenik koji utječe na proizvodnju melanina.Cistanchesadrži cistanozid, koji je antioksidans i može smanjiti stvaranje slobodnih radikala u tijelu, čime inhibira proizvodnju melanina.

Osim toga, cistanche također ima funkciju poticanja proizvodnje kolagena, što može povećati elastičnost i sjaj kože te pomoći u obnavljanju oštećenih stanica kože. Cistanche Phenylethanol glikozidi imaju značajan učinak regulacije naniže na aktivnost tirozinaze, a pokazalo se da je učinak na tirozinazu kompetitivna i reverzibilna inhibicija, što može pružiti znanstvenu osnovu za razvoj i korištenje sastojaka za izbjeljivanje u Cistancheu. Stoga cistanka ima ključnu ulogu u izbjeljivanju kože. Može inhibirati proizvodnju melanina kako bi se smanjila promjena boje i tupost; i potiče proizvodnju kolagena za poboljšanje elastičnosti i sjaja kože. Zbog raširenog prepoznavanja ovih učinaka cistanche, mnogi proizvodi za izbjeljivanje kože počeli su sadržavati biljne sastojke kao što je cistanche kako bi zadovoljili potražnju potrošača, čime se povećala komercijalna vrijednost cistanche uproizvodi za izbjeljivanje kože. Ukratko, uloga cistanhe uizbjeljivanje kožeje presudno. Njegov antioksidativni učinak i učinak stvaranja kolagena mogu smanjiti diskoloraciju i tupost, poboljšati elastičnost i sjaj kože te tako postići učinak izbjeljivanja. Također, široka primjena Cistanche u proizvodima za izbjeljivanje kože pokazuje da se njegova uloga u komercijalnoj vrijednosti ne može podcijeniti.

Kliknite Cistanche za izbjeljivanje

Zatraži više:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

Fosfolipidni kompleksi naširoko se koriste u farmaceutskoj industriji. Imaju dobru propusnost i sigurnost te dobivaju sve veću pozornost za primjenu u kozmetici. Budući da su fosfolipidi biofunkcionalni surfaktanti s dobrim svojstvima topljivosti, mogu se koristiti kao sustavi nosači za manje topljive lijekove [7], poboljšavajući transdermalno prodiranje i kumulativnu stopu prodiranja lokalnih lijekova [8]. Transdermalno prodiranje lijekova uključuje otapanje, distribuciju i difuziju u kožu. Fizikalna i kemijska svojstva, posebice koeficijent raspodjele ulje-voda lijeka koji se daje, utječu na ovaj proces [9].

metode

Materijali

Kultura stanica

Priprema FA–PC isparavanjem otapala

Provjera optimalnog udjela ferulinske kiseline i fosfolipida

FA i fosfolipidi u molarnim omjerima 2:1, 1:1, 1:2, 1:3 i 1:4 dodani su u tikvicu s okruglim dnom od 100 mL i otopljeni u bezvodnom etanolu (FA, 2,0 mg/mL). Smjese su stalno miješane na 40 stupnjeva 1 sat, a zatim je bezvodni etanol uklonjen rotacijskim otparavanjem. Osušeni FA-PC kompleksi stavljeni su u eksikator na 24 sata.

Provjera optimalne reakcijske temperature za pripremu FA–PC

Provjera optimalnog vremena reakcije za pripremu FA–PC

Provjera optimalne koncentracije FA

Karakterizacija FA–PC

Diferencijalna skenirajuća kalorimetrija (DSC)

Topljivost i koeficijent raspodjele ulje-voda

Topljivost

Topivost praškastih FA i FA–PC određena je dodavanjem viška uzoraka u 10.0 mL [10] vode ili n-oktanola i zatim mućkanjem na pokretnoj podlozi 3 h na 37 stupnjeva. Smjese su centrifugirane na 15,000 okretaja u minuti 10 minuta kako bi se uklonile netopljive FA. Zatim su supernatanti filtrirani kroz membrane od 0,45 µm. Nakon toga, filtrati su deseterostruko razrijeđeni metanolom, a sadržaj FA određen je pomoću UV spektrofotometra (UV-3150; Shimadzu; Japan).

Uzorci (10 mL) FA i FA–PC u n-oktanolu zasićenom vodom su pripremljeni i protreseni. Voda zasićena n-oktanolom (10 mL) dodana je svakom uzorku, a tekućina koja se miješala miješana je 24 h. Nakon toga, uzorci su ostavljeni da odstoje radi slojevanja. Koncentracija FA u svakoj fazi određena je UV spektrofotometrijom (UV-3150; Shimadzu; Japan). Analize su provedene u tri primjerka.

In vitro difuzija

Studije difuzije in vitro provedene su korištenjem Franzovih difuzijskih stanica (TK-20A; Shanghai Xie Kai Financial Information Service Co., Ltd.; Kina). Uz to, upotrijebili smo Strat-M® membrane, sintetičke membrane s difuzijskim karakteristikama koje više odgovaraju ljudskoj koži nego modeli životinjske kože [11]. Membrane su stegnute između donorske i prijamne komore vertikalnih difuzijskih stanica, a prijamne komore su napunjene fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS; pH 7,4) kako bi se otopio FA ili FA–PC i osigurali uvjeti potonuća.

Kromatografsko odvajanje provedeno je korištenjem sustava serije Agilent 1260LC (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, SAD) opremljenog mrežnim vakuumskim degazerom, kvaternarnom pumpom, autouzorkovačem, termostatiranim odjeljkom za kolonu i detekcijom niza dioda (DAD ). Upotrijebljen je Agilent Technologies ChemStation softver za tekućinsku kromatografiju (LC; B.02.01), a HPLC separacija provedena je pomoću kolone Eclipse plus-C18 (4,6 × 250 mm, 5 μm). Valna duljina detekcije bila je 0,05 posto octene kiseline (A) i metanola (B) (40:60, v/v). Brzina protoka bila je 1,0 mL/min. Temperatura kolone postavljena je na 30 stupnjeva. Napravljene su kumulativne korekcije kako bi se utvrdila količina FA otpuštena u svakom vremenskom intervalu. Sva mjerenja su izvedena u triplikatu, a postotak kumulativne FA koja je prošla kroz membranu (postotak Q) prikazan je kao funkcija vremena.

Inhibicija melanogeneze

Test viabilnosti stanica B16F10

Preživljavanje stanica i proliferacija stanica procijenjeni su pomoću {{0}}(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolij bromida (MTT) analiza [2]. B16F10 stanice prethodno su tretirane s 0.25, 0.5, 1.0, 2,0 i 4,0 mg/mL koncentracije FA i FA–PC. Nakon inkubacije od 48 sati, dodana je otopina MTT (konačna koncentracija: 5 mg/mL), a stanice su inkubirane 3 sata na 37 stupnjeva. Konačno, apsorbancija svakog uzorka izmjerena je na čitaču mikropločica na 570 nm kako bi se dobio postotak živih stanica.

Mjerenje sadržaja melanina

Sadržaj melanina mjeren je kako je prethodno opisano [6] uz neke izmjene. Stanice melanoma B16F10 nasađene su (2 × 105 stanica/jažici u 3 mL medija) u ploče sa šest jažica za kulturu i inkubirane preko noći kako bi se omogućilo stanicama da prianjaju. Na kraju tretmana, stanice su isprane s PBS-om i lizirane s 1 M NaOH koji sadrži 10 posto dimetil sulfoksida (DMSO) tijekom 30 minuta na 80 stupnjeva. Apsorbancija (optička gustoća; OD) je izmjerena na 475 nm pomoću čitača mikropločica. Sadržaj melanina izračunat je prema sljedećoj formuli:

Analiza podataka

Statistička značajnost razlika između srednjih mjerenja svake tretirane skupine i one kontrolne skupine određena je pomoću Dunnett-ovog t-testa. P vrijednosti<0.05 were considered statistically significant.

Rezultati i rasprava

Optimalna priprema FA–PC

Topljivost i koeficijent raspodjele ulje-voda FA-PC

Tablica 1 prikazuje topljivost FA, PM i FA–PC u vodi i n-oktanolu. FA-PC pokazao je dobru topljivost u vodi i n-oktanolu (1,68 odnosno 7,77 mg/mL), a utvrđeno je da je topljivost FA-PC u n-oktanolu značajno veća od topljivosti FA (1,34 mg/mL) .

Lipofilnost se obično mjeri kao koeficijent raspodjele (P) između dvije faze koje se ne miješaju. Obično se izražava kao log P. Određeni su prividni koeficijenti raspodjele FA i FA–PC u sustavu n-oktanol/voda. Rezultati su pokazali da je log P viši za FA–PC (1,21) nego za FA (0,99) kada se mjeri na pH 5.0. Blago povećani log P bio je povezan sa značajno poboljšanom topljivošću FA–PC u n-oktanolu u usporedbi s onom FA. Povećana topljivost FA–PC u n-oktanolu može se objasniti amorfnim karakteristikama FA–PC. Budući da su lipofilnost i propusnost u dobroj korelaciji, ovi rezultati sugeriraju da bi se transdermalna propusnost FA mogla poboljšati primjenom kao fosfolipidnog kompleksa.

DSC 

DSC je pouzdana metoda za provjeru kompatibilnosti lijeka i pomoćnih tvari i daje maksimum informacija o mogućim interakcijama između lijekova i pomoćnih tvari [10]. Prisutnost interakcije može se zaključiti iz eliminacije endotermnih vršnih vrijednosti, pojave novih vršnih vrijednosti, promjena u obliku i početku vršne vrijednosti, vršne temperature/tališta i relativnog područja ili entalpije. Slika 1 prikazuje DSC termograme FA (Slika 1a), PC (Slika 1b), PM (Slika 1c) i FA–PC (Slika 1d). Toplinska krivulja za čistu FA ima tipično oštro endotermno taljenje na oko 172,7 stupnjeva, što ukazuje na njegovo bezvodno i kristalno stanje, dok ona fosfolipida pokazuje manji endotermni vrh na 231,7-248,6 stupnjeva. DSC krivulja za PM, koja se sastoji od superponiranih toplinskih profila za FA i fosfolipide, ne pokazuje značajnepromjene osim malog pomaka prema višoj temperaturi (175,9 stupnjeva), što ukazuje da nema interakcija između komponenti. FA–PC ima jedan glavni vrh na 158,2 stupnja, štorazlikuje se od vrha FA, što ukazuje na interakciju između FA i PC. Naši rezultati sugeriraju da su različiti stupnjevi interakcije i/ili amorfizacije različitismjese ili kompleksi mogu se dobiti ovisno o načinu njihove pripreme, a to je povezano s razlikama u topljivosti.

FTIR

FTIR spektroskopija može potvrditi stvaranje FA–PC usporedbom spektra FA–PC sa spektrom čiste FA. Slika 2 prikazuje FTIR spektre FA, PC, PM i FA–PC. FA spektar (slika 2a) pokazuje karakterističnu vrpcu istezanja hidroksila na 3436 cm−1. Sve to postaje široki singlet u spektrima FA–PC, PM i fosfolipid (Slika 2b–d). FA spektar (slika 2a) pokazuje karakteristične vrhove na 1620 cm−1 (C=C rastezanje) i 1450 cm−1 (C=C rastezanje aromatskog prstena). U spektru FA–PC (slika 2b), ova dva vrha nisu vidljiva, vjerojatno zbog slabljenja ili uklanjanja, ili zaštite od strane fosfolipidne molekule.

FA spektar (slika 2a) pokazuje karakteristične nezasićene karboksilne vrhove na 1691 cm−1 (C=O istezanje) i 1664 cm−1 (C=C rastezanje). U spektru FA-PC (slika 2b), ova dva vrha nisu vidljiva, vjerojatno zbog privlačnih sila između negativnog karboksilnog naboja u FA i pozitivnog naboja dušika u fosfolipidima. Spektar fosfolipida (slika 2d) dosegao je vrhunac na 1733 cm−1 (C=O istezanje), 1238 cm−1 (P=O rastezanje) i 1087 cm−1 (P–O –C rastezanje). The

SEM

Površinske morfologije FA, PC, PM i FA–PC ispitane su pomoću SEM (Sl. 3). Na slici 3c, FA izgleda kristalno, gotovo pravokutno, dok se čestice FA–PC (slika 3a) čine nepravilnog oblika s glatkom površinom. FA–PC ima značajno drugačiji oblik i topografiju površine u usporedbi s FA i PC (Sl. 3b). To vjerojatno duguje potpunoj mješljivosti FA u PC-u. U PM skeniranju (slika 3d), i FA i fosfolipidi se lako razlikuju.

Studije difuzije in vitro

Nedavno je uvedena sintetička Strat-M® membrana kao zamjena za in vitro studije difuzije ljudske kože [11]. Membrana Strat-M® sastoji se od dva sloja polietersulfona koji su otporni na difuziju. Slojevi polietersulfona leže na jednom sloju poliolefina, koji je otvoreniji i difuzniji. Ovu sintetičku membranu karakterizira niska varijabilnost od serije do serije, čime se pružaju dosljedniji podaci. Štoviše, pokazalo se da podaci o difuziji za Strat-M® membrane dobro koreliraju s onima za ljudsku kožu [11].

Kako bi se procijenio utjecaj PC-a na in vitro difuzijska svojstva FA, postotak Q FA-a i FA-PC-a nacrtan je u odnosu na vrijeme. Rezultati u ovom radu pokazali su trend da fosfolipidi značajno povećavaju prodiranje FA u Strat-M® membranu. Osim toga, FA-PC se zadržao dulje na Strat-M® membrani nego FA (slika 4). Stoga, ugradnja fosfolipida u FA možda povećava vrijeme njegovog zadržavanja u stratum corneumu i čini ga prikladnijim za prodiranje kroz kožu. Što se tiče vremena prodiranja, iako je zabilježeno da Strat-M® membrana ima dobru korelaciju s membranom ljudske kože [11], ona također ima razlike u teksturi u usporedbi s ljudskom kožom. Čimbenici utjecaja vremena propusnosti mogu biti uključeni otapalo, koncentracija spojeva, pH vrijednost, et al. U budućoj analizi trebalo bi provesti više eksperimenata.

Inhibicija melanogeneze

Učinak FA–PC na sintezu melanina

Prema literaturi, FA može inhibirati aktivnost stanične tirozinaze i melanogenezu u stanicama melanoma B16F10 putem niže regulacije staničnih proteina c-kit i ERK1/2 [12]. U ovoj studiji, FA-PC smanjio je sadržaj melanina u stanicama B16F1{{10}} očitije nego FA pri testiranim koncentracijama od 0,25, 0,5 i 1,0 mg/mL (Tablica 2). Stoga smo utvrdili da je FA–PC učinkovitiji od FA u inhibiciji sinteze melanina u stanicama B16F10.

Zaključak

Prilozi autora

LL i LY dali su značajan doprinos koncepciji i dizajnu, ili prikupljanju podataka, ili analizi i interpretaciji podataka; XY i WX sudjelovali su u izradi nacrta rukopisa ili njegovoj kritičkoj reviziji za važan intelektualni sadržaj; a ZJ i DY dali su konačno odobrenje za verziju koja će biti objavljena. Svi su autori pročitali i odobrili konačni rukopis.

Priznanja

Ovaj je rad poduprla Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (31501402).

Suprotstavljeni interesi

Autori izjavljuju da nemaju suprotstavljenih interesa.

Primljeno: 27. prosinca 2016. Prihvaćeno: 14. ožujka 2017

Objavljeno online: 22. ožujka 2017

Reference