Preliminarna studija o uzorcima tjestenine karakteriziranih antioksidativnim spojevima i njihovom biološkom djelovanju na bubrežne stanice

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Federico Di Marco i sur

Sažetak:Tjestenina je jedna od osnovnih namirnica uMediterandijeta i zbog toga je odabrano za ovu studiju da se procijene njegova antioksidativna svojstva. Odabrane su tri vrste tjestenine: heljdina, ražena i tjestenina od jaja. Kvalitativno-kvantitativne karakterizacijske analize proveo jeHPLC-DADidentificirati antioksidativne spojeve. Podaci su pokazali prisutnost karotenoida poput luteina i polifenola poput indooctene kiseline (karotenoidi od {{0}}.08 do 0,16 mg/100 g,polifenoliod 3,7 do 7,4 mg/100 g). Kako bi se procijenio učinak detektiranih metabolita, provedeno je in vitro eksperimentiranje nabubregmodeli stanica: HEK-293 i MDCK. Standardi karotena, indooctene kiseline, kavene kiseline, hidroalkoholnih i karotenoidima obogaćenih ekstrakata iz uzoraka tjestenine ispitani su u prisutnosti antioksidansa kako bi se odredile varijacije održivosti. -standardi karotena i indoloctene kiseline pokazali su zaštitni učinak na HEK-293 stanice, dok na MDCK nije zabilježen učinak. Ispitane koncentracije vjerojatno su u rasponu onih postignutih u tijelu nakon konzumacije standardnih jela od tjestenine. Ekstrakti obogaćeni karotenoidima i hidroalkoholni ekstrakti pokazali su različite učinke, promatrajući spas za hidroalkoholni ekstrakt ražene tjestenine i ekstrakt tjestenine od heljde obogaćen karotenoidima, dok je tjestenina od jaja pokazala blaže učinke ovisno o dozi pretpostavljajući prooksidativno ponašanje pri visokim koncentracijama. Preliminarni rezultati sugeriraju da se ponašanja mogu pratiti unatrag do cijelih fitokompleksa s obzirom na pojedinačne molekule i potrebna su daljnja istraživanja.

Ključne riječi:tjestenina;Mediterandijeta; polifenoli; karotenoidi; antioksidativni spojevi;bubregzdravlje;HPLC/DADanalize

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

1. Uvod

Unatoč tome, ne postoji jedinstvena definicijaMediteranprehrana—zbog varijacija i prilagodbi u kulinarskim tradicijama ne samo u mediteranskom području nego i diljem svijeta [1]—može se smatrati da mediteranska prehrana ima nekoliko komponenti koje ispunjavaju važne kriterije za zdravu prehranu: nizak udio zasićenih masne kiseline, visok sadržaj složenih ugljikohidrata, dijetalnih vlakana i antioksidativnih molekula te obilje povrća.

Teško je utvrditi koja se hrana ili aktivni sastojci u njoj nalazeMediterandijeta je najodgovornija za zdravstvene dobrobiti; prikupljeni podaci sugeriraju da njegove glavne prednosti leže u kombinaciji kompleksa i širokog spektra različitih hranjivih tvari koje međusobno djeluju sinergistički i aditivno [2].

Posljednjih godina sve je više literature (promatračke studije i randomizirana kontrolna ispitivanja) pokazalo zdravstvene dobrobiti povezane s mediteranskom prehranom, smanjujući rizik od razvoja višestrukih kroničnih bolesti kao što su kardiovaskularne bolesti [3-5], dijabetes [6-10], rak [11,12], pretilost [13-15] ili kognitivno zdravlje [16-19] i produženje očekivanog životnog vijeka [20].

Čini se da su poboljšanja krvnog tlaka [21], lipidnog profila [22,23], inzulinske rezistencije [24] i zaštita od oksidativnog stresa, upale, agregacije trombocita i endotelne disfunkcije [25-28] mehanizmi djelovanja odgovorni za blagotvoran učinak na opće zdravlje. Svi ovi biološki učinci potaknuti privrženošću mediteranskom načinu života mogli bi biti relevantni ne samo za gore navedene kronične bolesti, već i za prevenciju propadanja bubrega u općoj populaciji. Kronična bubrežna bolest (CKD) predstavlja globalni javnozdravstveni problem koji pogađa više od 750 milijuna ljudi diljem svijeta i često djeluje tiho i neometano zahvaljujući asimptomatskoj kliničkoj prezentaciji. Različiti dokazi naglašavaju snažnu vezu između mediteranske prehrane i očuvanja bubrega [29].

Uzimajući u obzir sve gore navedene učinke kao čimbenike rizika za smanjenje bubrežne funkcije, bubreg se može smatrati jednom od primarnih meta. Nedavna meta-analiza kohortnih studija pokazala je da su biljne dijete poput mediteranske dijete ili dijetalne dijete za zaustavljanje hipertenzije (DASH) povezane s manjim rizikom od incidenata.CKDi albuminurija u općoj populaciji [30]. Jedno objašnjenje moglo bi biti da voće i povrće sadrži bioaktivne spojeve koji štite od upale i endotelne disfunkcije koji potiču dinamičke promjene filtracijske frakcije, što rezultira progresivnim smanjenjem brzine glomerularne filtracije, povećanjem volumena izvanstanične tekućine, abnormalnom ionskom ravnotežom i bubrežnom hipoksijom, u konačnici što dovodi do gubitka funkcije bubrega [31-33]. Štoviše, povećanje konzumacije povrća, voća, žitarica i mahunarki moglo je dovesti do smanjenja konzumacije životinjskih bjelančevina pozitivno utječući na acidobaznu ravnotežu i glomerularnu hemodinamikububreg, štiteći ga od glomerularne skleroze i gubitka funkcije [34-37].

Unatoč tome, postoji nekoliko studija s oprečnim podacima o utjecaju visokoproteinske prehrane na smanjenje bubrežne funkcije u općoj populaciji [38-41], sve više dokaza sugerira da izvor proteina igra važnu ulogu u očuvanju bubrežne funkcije i da prijelaz sa životinjskog na biljni izvor proteina mogao bi biti koristan [42,43].

Tjestenina je jedna od najčešće konzumiranih namirnica na svijetu i jedna je od osnovnih namirnica mediteranske prehrane. Tradicionalno, Italija je glavni proizvođač i predvodnik u potrošnji tjestenine, iako se tjestenina konzumira diljem svijeta zbog niske cijene, ukusnosti i duljeg roka trajanja od ostalih pekarskih proizvoda [44]. Tjestenina je dobar izvor ugljikohidrata i energije (100 g kuhane tjestenine sadrži oko 31 g ugljikohidrata i oko 158 kcal), ali obično ima malo lipida, proteina, fosfora i kalija, hranjivih sastojaka koji su ograničeni u većini renalnih dijeta za bolesti bubrega (dostupno online na https://fdc.nal.usda.gov, pristupljeno 1. prosinca 2020.). Prirodno obogaćena pšenična tjestenina, koja predstavlja većinu komercijalno dostupne tjestenine, također nudi dobre razine tiamina, riboflavina, niacina, folata, željeza i selena, kao i polifenola. Nadalje, tjestenina se uvijek konzumira u kombinaciji s drugim namirnicama koje se mogu smatrati jačim izvorom polifenola, poput maslinovog ulja i povrća. Tjestenina se najčešće proizvodi od durum pšeničnog krupice, zbog izvrsnih reoloških svojstava, vrhunske boje tjestenine, kvalitete kuhanja i prihvaćenosti kod potrošača, no u posljednje vrijeme tjestenina se može proizvoditi i od drugih žitarica poput riže, heljda, raž, pir.

Potrošači su posljednjih godina postali svjesniji da uravnotežena prehrana, poput one mediteranske, može pozitivno utjecati na zdravlje, stoga prehrambena industrija nastoji udovoljiti tim zahtjevima proizvodnjom kvalitetne i funkcionalne hrane i sastojaka hrane.

Unatoč tome što se obogaćena hrana proizvodi u zdrave svrhe, ljudi bi se mogli navesti da je uzimaju umjesto uravnotežene prehrane. Ovo je toliko važna tema da je FDA potaknula da objavi ad hoc dokument pod naslovom "FDA-ina politika obogaćivanja" kako bi s jedne strane dala odgovor prehrambenoj industriji, a s druge akademskom svijetu [44].

Uravnotežena, primjerena i raznolika prehrana važan je korak prema sretnom i zdravom načinu života bez rizika od preopterećenja nekim dodanim komponentama sadržanim u obogaćenoj hrani. Upravo iz tog razloga ponovno su otkrivene netradicionalne žitarice i pseudožitarice koje su utrle put njihovoj upotrebi kao funkcionalnih sastojaka hrane budući da posjeduju neke nutritivne i funkcionalne kvalitete koje su odsutne ili nedostaju tradicionalnim žitaricama. Heljda i raž su bogati izvori fitokemikalija kao što su polifenoli, spojevi koji su snažno povezani s antioksidativnim djelovanjem [45,46].

Pokrenut u ožujku 2005., projekt MOLI-SANI uključio je oko 25000 građana s prebivalištem u Moliseu (Italija) u procjeni ekoloških i genetskih čimbenika koji leže u pozadini kardiovaskularnih bolesti, tumora i neurodegenerativnih bolesti. Prema studiji projekta MOLI-SANI, unos tjestenine povezan je s nižim BMI i nižim razinama središnje pretilosti. Mnoge studije su potvrdile da visokokalorične dijete dovode do debljanja, a ne dijete koje uključuju ugljikohidrate. Naime, ako je porcija tjestenine ispravna i umak nije previše kaloričan, tanjur tjestenine može imati kalorijski sadržaj koji poštuje dnevnu energetsku potrebu [47]. Tjestenina se visoko cijeni jer se njezine karakteristike povezuju ne samo s kontrolom tjelesne težine, već i s nekoliko pozitivnih zdravstvenih svojstava [48]. Randomizirana, kontrolirana studija provedena na zdravim ispitanicima pokazala je da proizvodi na bazi raži poboljšavaju regulaciju glikemije, povećavaju crijevne hormone uključene u regulaciju apetita i metabolizma. Raž smanjuje razinu postprandijalnog apetita smanjujući želju za jelom u sljedećim obrocima, povećavajući osjećaj sitosti i smanjujući osjećaj gladi povećanjem hormona sitosti GLP-1 (peptid sličan glukagonu-1) i peptid YY (PYY). Niži postprandijalni odgovor na glukozu primijećen je u skupini ljudi koji su konzumirali hranu na bazi raži u usporedbi sa skupinom ispitanika koji su konzumirali rafiniranu pšenicu. To se događa jer je raž žitarica niskog glikemijskog indeksa koja se također može koristiti kod dijabetičara [49]. Raž može poboljšati profil lipida u plazmi, zapravo je unos cijele raži obrnuto povezan s koncentracijom LDL kolesterola, omjerom LDL/HDL i koncentracijom triglicerida. Ovaj učinak je posljedica prisutnosti vlakana i -glukana [50].

Tjestenina je dobro poznata kao izvor ugljikohidrata, ali također može sadržavati manje spojeve, poput karotenoida [51], osobito luteina, i drugih vrsta antioksidansa poput polifenola. Ove bioaktivne molekule mogu se obogatiti u različitim vrstama tjestenine, ovisno o sirovinama. Na primjer, sadržaj karotenoida u durum pšenici veći je nego u krušnoj pšenici [52], a razina antioksidansa može se povećati uključivanjem frakcije mekinja i cijele jezgre durum pšenice u proizvode od tjestenine [53]. Heljda je značajan izvor fenolnih spojeva, vitamina i esencijalnih aminokiselina [54], dok dodatak jaja u pripremi tjestenine prenosi karotenoide i lutein. Karotenoidi sudjeluju u preventivnoj aktivnosti, posebice kod upalnog sindroma, a njihova uloga je zbog njihovih antioksidativnih svojstava [55] protiv slobodnih radikala i singletnog kisika [56]. Tjestenina sadrži različite vrste antioksidativnih molekula i za česte konzumente velika konzumacija može se smatrati važnim izvorom takvih zdravih spojeva.

Ovdje pokazujemo da različite vrste tjestenine, odnosno tjestenina od heljde, raži i jaja, sadrže različite količine antioksidativnih spojeva, koji imaju ulogu u poboljšanju održivosti bubrežnih stanica u stabilnom stanju ili nakon indukcije oksidativnog stresa.

2. Materijali i metode

2.1. Uzorci

Analizirana su i ispitana tri uzorka kuhane tjestenine: jedan uzorak tjestenine od integralnog zrna heljde (1), jedan uzorak tjestenine od integralnog zrna raži (2) i jedan uzorak tjestenine od jaja od tvrdog brašna mljevene durum pšenice (3).

2.2. Priprema uzoraka tjestenine

Ukupno 50 g integralne tjestenine od heljde ili integralne ražene tjestenine kuhano je u 500 mL vode 7 minuta; 50 g tjestenine od kameno mljevenog brašna durum pšenice kuhalo se u 500 mL vode 1 min prema navodima proizvođača.

Da bi se dobili ekstrakti obogaćeni karotenoidima, 10 g kuhane tjestenine otopljeno je u 100 mL acetona, hladno sonicirano 30 minuta. Uzorak je centrifugiran 5 minuta pri 5000 okretaja u minuti, supernatant je isparen na suho pomoću rotacijskog isparivača, a ostatak je otopljen u acetonu ili DMSO, ovisno o daljnjoj analizi. Za dobivanje ekstrakta obogaćenih polifenolima, 10 g svakog uzorka kuhane tjestenine otopljeno je u 50 mL 70:30 EtOH/H2O pri pH 3,2. Uzorci su mućkani 24 sata, centrifugirani 5 minuta na 1400 okretaja u minuti. Uzorak je centrifugiran 5 minuta na 5000 okretaja u minuti, a supernatant je sakupljen i analiziran u HPLC-DAD, dok je alikvot suho isparen, a ostatak otopljen u DMSO za obradu stanica.

2.3. HPLC-DA-MS analiza

Kvalitativno-kvantitativne analize karotenoida i polifenola provedene su korištenjem tekućinske kromatografije HP 1100 opremljene DAD detektorom kojom upravlja HP ​​9000 radna stanica (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, SAD) i povezana je sa skupnim spektrometrom s API/elektrosprej sučeljem (Agilent Technologies). Radni uvjeti masenog spektrometra bili su sljedeći: temperatura plina, 350 ◦C; protok dušika, 11,0 L/min; tlak nebulizatora, 40 psi; kvadrupolna temperatura, 100 ◦C; i kapilarni napon, 4000 V. Maseni spektrometar je radio u pozitivnom i negativnom modu na 80-180 eV.

Spojevi su odvojeni korištenjem 250 × 4,6 mm id, 5 µm LUNA C18 kolone (Phenomenex, Torrance, CA, SAD). UV/Vis spektri su snimljeni u rasponu od 190-600 nm, a kromatogrami su snimljeni na 250, 280, 330, 350 i 450 nm. Uzorci su analizirani gradijentnom elucijom pri jednakoj brzini od 0,8 mL/min. Mobilna faza za karotenoide bio je višestupanjski linearni sustav gradijenta otapala (otapalo A: aceton, otapalo B: H2O, pH 3,2 pomoću mravlje kiseline), počevši od 80 posto acetona do 100 posto u 30 minuta. polifenoli su eluirani korištenjem sljedećeg gradijenta: od 90 posto H2O (podešen na pH 3,2 mravljom kiselinom) do 100 posto CH3CN u 40 minuta. Sva upotrijebljena otapala bila su HPLC stupnja čistoće (BDHLaboratory Supplies, Poole, UK).

2.4. Kvantitativna analiza

Kvantifikacija pojedinačnih polifenolnih spojeva izravno je provedena pomoću HPLC-DAD pomoću regresijske krivulje s pet točaka (R2 veći od ili jednak 0.998) u rasponu od 0–30 µg na temelju autentični standardi. Konkretno, flavonoli su određeni na 350 zabavnog kvercetin 3-O-glukozida kao referentnog spoja, dok su derivati ​​kavene kiseline određeni na 330 nm koristeći klorogensku kiselinu kao referentni spoj, a derivat indol octene kiseline na 280 nm koristeći 3 indooctene kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Karotenoidi su određeni na 450 nm koristeći beta-karoten kao referentni spoj (Extrasynthese, Lione, Francia). U svim slučajevima, stvarne koncentracije derivata izračunate su nakon primjene korekcija za razlike u molekularnoj težini.

2.5. Ukupni sadržaj fenola

Ukupni sadržaj fenola određen je Folin–Ciocalteu metodom, koju su opisali Singleton i sur. [57] i malo modificiran prema Dewanto et al. [58]. U 125 µL prikladno razrijeđenog ekstrakta uzorka dodano je 0.5 mL deionizirane vode i 125 µL Folin-Ciocalteu reagensa. Smjesa je držana 6 minuta i zatim je dodano 1,25 mL 7 posto vodene otopine Na2C03. Konačni volumen je podešen na 3 ml s vodom. Nakon 90 minuta, apsorpcija je izmjerena na 760 nm u odnosu na vodu kao slijepu probu. Količina ukupnih fenola izražava se kao ekvivalenti galne kiseline (GAE, mg galne kiseline/100 g uzorka) preko kalibracijske krivulje galne kiseline. Kalibracijska krivulja bila je u rasponu od 20 do 500 µg/mL (R2=0.9969) [57,58].

2.6. Kultura stanica

Stanice ljudskog embrionalnog bubrega 293 (HEK-293) i stanice Madin-Darby psećeg bubrega (MDCK) uzgajane su u DMEM-u s dodatkom GlutaMAX-a, 10 posto (v/v), fetalnog goveđeg seruma, 100 U/mL penicilina i 100 µg /mL streptomicina na 37 ◦C s 5 posto CO2.

2.7. MTT test

5{{10}}00 stanica/jažici MDCK i HEK-293 stanice su nasađene u ploče s 96 jažica i ostavljene da prianjaju 24 sata. Za studije održivosti, stanice su inkubirane 24 h do 72 h s beta karotenom, indol-3-octenom kiselinom, kavenom kiselinom (u DMSO) i ekstraktima tjestenine samim ili u prisutnosti magnezijevog monoperoksi ftalata (MMPP, Sigma-Aldrich , St. Louis, MO, SAD). Za netretirane uzorke korišten je DMSO u mediju u jednakim koncentracijama onima koje se koriste za ispitivane spojeve. Ispitane koncentracije za standarde bile su u rasponu od 2 pM do 10 µM, dok su za MMPP od 0,001 do 0,05 mg/mL. Mjerena je održivost stanica 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolij bromid (MTT, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Ploče su inkubirane na 37 ◦C 1 sat, a zatim je formazan proizveden redukcijom MTT otopljen u DMSO. Apsorbancija je određena na čitaču mikropločica (Mithras LB 940-Berthold) na 570 nm. Postotak stanične vitalnosti izračunat je pomoću omjera AbsTEST/AbsCTRL.

2.8. Statistička analiza

Svaki pokus izveden je u četiri primjerka i ponovljen najmanje tri puta. Razlike u postocima održivosti procijenjene su korištenjem uparenog Studentovog t-testa i dvosmjerne ANOVA praćene posthoc testom s Holmovom korekcijom za višestruke usporedbe koncentracija metabolita (p < 0.05).="" rezultati="" su="" izraženi="" kao="" srednja="" vrijednost="" ±="" standardna="" pogreška,="" a="" analiza="" je="" provedena="" u="" okruženju="" r-studio="" [59]="" za="" r="" verziju="" 3.6.3="" [60]="" pomoću="" paketa="" "tidyverse"="">

3. Rezultati i rasprava

3.1. Određivanje kemijske kakvoće uzoraka tjestenine

Nutritivne informacije o hrani omogućuju donošenje informiranih odluka o hrani i prehrani. Tjestenina se tradicionalno priprema od krupice, ali čak i s drugim žitaricama, sve sadrže škrob kao glavni sastojak nakon kojeg slijede proteini, masti, vitamini, minerali i bioaktivni spojevi [62]. U tablici S1 navedeni su podaci o prehrani.

Kako bismo usporedili nutritivne vrijednosti nekoliko vrsta tjestenine obogaćene bioaktivnim spojevima zbog različitih izvora žitarica ili dopune specifičnih sastojaka, analizirali smo tjesteninu od heljde, raženu tjesteninu i tjesteninu od jaja. Kako bi se dobili ekstrakti obogaćeni različitim podrazredima spojeva prisutnih u uzorcima tjestenine, provedene su i analizirane hidroalkoholne i acetonske ekstrakcije. Pojedinačni polifenoli provizorno su identificirani korištenjem podataka iz HPLC-DAD-MS analize usporedbom i kombinacijom njihovih retencijskih vremena i masene spektrometrije i UV spektra (vidi slike S1-S5 za isti primjer MS spektra) i usporedbom rezultata sa standardima (kaempferol, kvercetin, rutin i ferulinska kiselina) i prethodni bibliografski radovi. Konkretno, u hidroalkoholnim ekstraktima identificirani su flavonoidi, kavena kiselina i derivati ​​indooctene kiseline (Tablica 1): derivat indooctene kiseline je glavni spoj kao što je prije opisano čak i za griz. [63]. Uzimajući u obzir relativne sastave, tjestenina od heljde pokazala je više razine flavonoida, posebice derivate kvercetina koji su glavni flavonoli kao što je ranije objavljeno u heljdi [64,65], te zanemarivu prisutnost derivata kafeinske kiseline; ražena tjestenina pokazala je više razine derivata kafeinske kiseline, posebno ferulinske kiseline [66] i nizak sadržaj flavonoida; tjestenina od jaja pokazala je samo nisku koncentraciju flavonoida (derivat apigenina [67]) i nije bilo derivata kafeinske kiseline.

Kao primjer, kromatografski profili uzoraka kuhane tjestenine, snimljeni na 350 nm, prikazani su na slici 1. Slika otkriva kvalitativni sastav analiziranih uzoraka.

Lutein je bio glavni karotenoid identificiran u acetonskim ekstraktima, sa sličnim relativnim sadržajem u odnosu na ukupne vrste karotenoida, kao što je prikazano u tablici 2, u skladu s prethodnim studijama [68]. Karotenoidi nisu otkriveni u raženoj tjestenini.

U uzorcima tjestenine također je procijenjena prisutnost sekundarnih metabolita antioksidansa (Tablica 3). Procijenjen je ukupni antioksidativni kapacitet biokomponenata, vjerojatno zbog aktivnosti fenola/polifenola, te je određen broj takvih molekula.

3.2. Učinak indol-3-octene kiseline,8-Karoten i kafeinska kiselina na vitalnost stanica

Mediteranska prehrana prepoznata je kao izvor antioksidativnih molekula koje štite organizam od oksidativnog stresa i podupiru njegovo zdravo stanje [2]. Stoga smo se pitali mogu li biomolekule otkrivene u našim uzorcima tjestenine utjecati na održivost stanica i u kojoj mjeri. Koristili smo HEK-293 i MDCK zdrave bubrežne stanice za određivanje aktivnosti standardnih spojeva indooctene kiseline, -karotena i kavene kiseline. Bubrezi su posebno osjetljivi na oksidativni stres, a nakupljanje slobodnih radikala dovodi do oštećenja funkcije bubrega [69]. Stanice su inkubirane sa skalarnom koncentracijom standardnih spojeva, a održivost stanica mjerena je u različitim vremenskim točkama (Slika 3 i Slika S6).

Utvrđeno je da nemaju nikakav toksični učinak na HEK{{0}} stanice za sve testirane koncentracije u vrijeme inkubacije. Samo je -karoten smanjio vitalnost stanica u obliku slova U na HEK-293 stanicama i na način ovisan o dozi u MDCK stanicama (Slika 3). Zanimljivo je da su koncentracije koje su vjerojatno postignute u tijelu nakon konzumiranja standardnog obroka tjestenine (obično 80 gr) u rasponu najniže ispitane (2 × 10_5 –2 × 10_4 uM, [70 ,71]), što je omogućilo slabo povećanje održivosti na obje stanične linije. S druge strane, pri višim koncentracijama iznad 0,2 uM, koje se mogu dobiti samo farmakološki, kavena kiselina je pokazala značajno poboljšanje stanične održivosti, dok su indooctena kiselina i -karoten pokazali usporedive učinke uz povećanje koncentracije (2-20 uM ) u HEK-293 ćelijama tijekom vremena.

3.3. Učinak indol-3-octene kiseline, -karotena i kavene kiseline na stanice tretirane MMPP-om

Zatim smo se pitali mogu li indoloctena kiselina, -karoten i kavena kiselina suprotstaviti se stresu izazvanom oksidirajućim agensom MMPP. Prvo smo testirali učinak MMPP izlaganjem stanica HEK-293 i MDCK serijskim razrjeđenjima (0.005–0,05 mg/mL) lijeka i određena je vitalnost stanica. Primijećeno je smanjenje ovisno o dozi nakon liječenja MMPP-om i IC50 je bio usporediv u dvije testirane stanične linije. Nakon inkubacije s 20-25 µg/mL MMPP-a, vitalnost stanica značajno je smanjena na oko 50-60 posto (Slika 4), a polumaksimalna inhibitorna koncentracija (IC50) izračunata je na 26 µg/mL za HEK{{16} } i 22 µg/mL za MDCK.

Zatim smo testirali zaštitnu aktivnost naših antioksidativnih molekula na stanicama tretiranim MMPP-om, nadopunjavanjem staničnog medija s 2 × 10_5 nM indooctene, -karotenske ili kavene kiseline. Blago pozitivan učinak na vitalnost stanica i HEK-293 i MDCK potvrđen je primjenom standarda kao takvih u dozi koja je vjerojatno izvedena iz dijela tjestenine (Slika 5).

Kao što se očekivalo, MMPP je smanjio održivost stanica na 60–65 posto; tretman s indooctenom kiselinom ili -karotenom poništio je učinak MMPP i spasio vitalnost stanica za 30 posto (p < 0,001)="" odnosno="" 27="" posto="" (p=""> 0,01) na HEK-293 stanicama, dok kafeinska kiselina nije imala značajan učinak. U prisutnosti oksidansa, beta-karoten i indooctena kiselina pokazali su zaštitni učinak na stanice u niskim koncentracijama, dok kavena kiselina nije spriječila oksidativni stres u koncentracijama potrebnim za povećanje stanične održivosti. Ti pozitivni učinci vjerojatno su posljedica antioksidativnih svojstava indooctene kiseline i karotenoida koji mogu značajno uravnotežiti citotoksičnost posredovanu MMPP-om u dozi korištenoj u ovom eksperimentalnom stanju. Usprkos tome, nije primijećeno značajno spašavanje na MDCK stanicama tretiranim MMPP-om, što sugerira da, čak i ako su sami standardi pokazali značajan pozitivan učinak na vitalnost stanica, oni nisu dovoljni za rješavanje oksidativnog stresa izazvanog MMPP-om. Čini se da embrionalne HEK 293 stanice brže uređuju obrambenu liniju protiv stresa od odraslih MDCK, vjerojatno zbog dodatnih sustava stanične redoks homeostaze.

3.4. Učinak frakcije obogaćene karotenoidima dobivene iz tjestenine na MMPP-induciranu citotoksičnost

Kako bi se procijenili učinci frakcija obogaćenih karotenoidima dobivenih ekstrakcijom acetonom tjestenine od heljde i tjestenine od jaja na bubrežne stanice u prisutnosti oksidativnog stresa, HEK-293 stanice su inkubirane s različitim koncentracijama ekstrakata rangiranih od 2 × { {3}} uM do 2 × 10_3 uM u prisutnosti MMPP tijekom 72 h (Slika 6 i Tablica S2). Upotrijebljena koncentracija odnosi se na koncentraciju -karotena otkrivenu u ekstraktu (tablica2). Sadržaj luteina bio je u rasponu od 1,5 × 10_6 uM do 1,5 × 10_3 uM u tjestenini od heljde i od 1,34 × 10_6 uM do 1,34 × 10_3 uM u tjestenini od jaja.

U oba acetonska ekstrakta, prisutnost prirodnih fitokompleksa, pokazala je različite učinke u odnosu na jedan standard, što je rezultiralo većom aktivnošću pri nižim koncentracijama. Kako se koncentracija ekstrakata iz tjestenine od jaja povećava, uočeno je smanjenje vitalnosti stanica. Najniža koncentracija karotenoidnih ekstrakata (2 × 10-6 µM) izazvala je skroman pozitivan učinak samog ili u prisutnosti MMPP-a na HEK-293 stanice. Ekstrakt tjestenine od heljde generirao je povećanje vitalnosti stanica kao sam ekstrakt, ali iu prisutnosti MPP u rasponu od 32 ± 5 posto u najnižoj koncentraciji do 21 ± 9 posto za 2 × 10-4 µM.

Aktivnost acetonskih ekstrakata procijenjena je i na MDCK stanicama u prisutnosti ili odsutnosti MMPP i uspoređena s onom dobivenom u HEK-293 stanicama (Slika 7 i Tablica S2).

Ekstrakti obogaćeni karotenoidima dali su ukupni učinak pro-viabilnosti u svim testiranim koncentracijama za obje vrste tjestenine. Što se tiče heljde HEK-293, ekstrakt tjestenine dao je bolji učinak nakon tretmana MMPP-om za sve doze u rasponu od 50 ± 7 posto do 82 ± 5 posto u usporedbi s HEK-239 stanicama; ekstrakti iz tjestenine s jajima pružili su mali spas samo pri najnižoj koncentraciji karotenoida 2 × 10_6 uM u prisutnosti MMPP-a, što sugerira da specifičan sastav ekstrakata igra ključnu ulogu u odgovoru. Dakle, tjestenina od heljde pokazala je veću sposobnost spašavanja vitalnosti stanica u odnosu na tjesteninu od jaja, a budući da su pokusi provedeni s istom količinom -karotena, razlika bi mogla biti posljedica prisutnosti manjih spojeva, kao što su flavonoidni spojevi, viši u bivšem.

Vrste karotenoida uključene su u različite kemijske reakcije koje pokazuju dvostruku prirodu oksidansa i antioksidansa, ovisno o biološkom kontekstu i njihovim koncentracijama: ova visoka reaktivnost posljedica je prisutnosti konjugiranih dvostrukih veza [72]. Njihova antioksidacijska uloga bila je povezana sa sposobnošću delokalizacije elektrona koje daju oksidativne vrste i radikali [73,74]. U prisutnosti visokih oksidativnih uvjeta, njihova se aktivnost može pretvoriti u prooksidacijsku [75]. U našim slučajevima, ovaj je nalaz primijećen u tjestenini od jaja za HEK-293 (sam i u prisutnosti MMPP) i MDCK stanica u prisutnosti MMPP, gdje su različite doze ekstrakta acetona proizvele suprotne učinke.

3.5. Učinak hidroalkoholnog ekstrakta na MMPP-induciranu citotoksičnost

Nakon toga smo procijenili učinke hidroalkoholnih ekstrakata iz tjestenine od heljde, ražene tjestenine i tjestenine od jaja na bubrežne stanice testiranjem različitih koncentracija u rasponu od 5 × 10_5 uM do 5 × 10_1 uM sa ili bez MMPP-a (Slika 8 i Tablica S3). Upotrijebljena koncentracija odnosi se na koncentraciju ukupnog sadržaja fenola otkrivenog u ekstraktu (tablica 3). Prema sadržaju uzoraka tjestenine navedenih u tablici 1, za tjesteninu od heljde koncentracija indooctene kiseline rangirana je od 1,85 × 10_5 uM do 1,85 × 10_1 uM, za derivate kavene kiseline rangirana je od 3,5 × 10_6 uM do 3,5 × 10_2 uM, a za sadržaj flavonoida rangiran je od 2,8 × 10_5 uM do 2,8 × 10_1 uM; za raženu tjesteninu, koncentracija indooctene kiseline bila je od 2,2 × 10_5 uM do 2,2 × 10_1 uM, za derivate kavene kiseline od 1,95 × 10_5 uM do 1,95 × {{37} } uM i za vrste flavonoida od 8,5 × 10_6 uM do 8,5 × 10_2 uM; za tjesteninu od jaja, koncentracija indooctene kiseline bila je rangirana od 4,25 × 10_5 uM do 4,25 × 10_1 uM, za vrste flavonoida od 7,5 × 10_6 uM do 1,85 × 10_2 uM dok nisu bili prisutni derivati ​​kafeinske kiseline.

Hidroalkoholni ekstrakt iz tjestenine s jajima nije imao nikakav značajan učinak na održivost HEK- 293 neovisno o prisutnosti oksidativnog stresa. Ekstrakt iz tjestenine od heljde pokazao je povećanje vitalnosti stanica nakon tretmana MMPP-om samo pri najvišoj koncentraciji (28 ± 6 posto). Sam ekstrakt ražene tjestenine pokazao je opće povećanje vitalnosti stanica za sve doze u rasponu od 14 ± 7 posto do 18 ± 1 posto, kao iu prisutnosti MMPP-a od 27 ± 3 posto do 13 ± 3 posto. Phyto kompleks predstavljen u ekstraktima pokazao se aktivnijim od pojedinačnih standarda, ostvarujući učinak na vitalnost stanica pri nižim koncentracijama u usporedbi s potonjim. Ovi rezultati upućuju na to da bi se u hidroalkoholnim ekstraktima glavna uloga u spašavanju mogla pripisati prisutnosti derivata kafeinske kiseline, promatrajući veći učinak za raženu tjesteninu i manji/zanemariv učinak za pastu od jaja, u kojoj se ne mogu otkriti.

Hidroalkoholni ekstrakt zatim je testiran na stanicama MDCK u istim uvjetima kao i prije i procijenjena je vitalnost stanica (Slika 9 i Tablica S4).

Hidroalkoholni ekstrakt iz tjestenine od heljde i jaja pokazao je suprotne učinke na vitalnost stanica: prvi ju povećava, dok je drugi smanjuje; nikakav učinak na liječenje MMPP-om nije otkriven za oba. Ekstrakt iz ražene tjestenine sam po sebi nije pokazao značajan učinak na vitalnost stanica, ali otkriva snažan zaštitni učinak protiv oksidativnog stresa posredovanog MMPP-om u svim koncentracijama u rasponu od 50 ± 7 posto do 61 ± 21 posto. U standardnim uvjetima.

U nedostatku MMPP-a, čini se da visok sadržaj indooctene kiseline u ekstraktu tjestenine od jaja ima toksični učinak na vitalnost stanica. Uspoređujući dva modela stanica, uočili smo različita ponašanja u odnosu na tjesteninu od heljde i raži u odsutnosti MMPP-a. Konkretno, HEK-293 je pokazao povećanje održivosti s potonjim, dok je MDCK s prvim. Razlike se odnose na djelovanje fotokompleksa koji se karakteriziraju većim sadržajem flavonoida za tjesteninu od heljde. Spašavanje vitalnosti stanica među uzorcima, kao što je uočeno za obje stanične linije, odgovara povećanom sadržaju derivata kafeinske kiseline u raženoj tjestenini.

Studija interakcije između fitokompleksa koji sadrže polifenole i bubrežnih stanica mogla bi pomoći u istraživanju poznatih važnih učinaka tih spojeva na fiziologiju bubrega [76], usredotočujući se na jedan od mogućih nosača, tjesteninu, koja se obično povezuje s prehranom zdravom za bubrege. Kao opće pravilo, metaboliti polifenola imaju poluvrijeme eliminacije u plazmi od nekoliko sati i brzo se eliminiraju putem bubrega i jetre: putem izlučivanja putem urina i žuči. Ukupna količina metabolita polifenola izlučenih u urinu korelira ne samo s njihovom maksimalnom koncentracijom u plazmi, već i s njihovom sposobnošću da se izlučuju bilijarnim, a ne urinarnim traktom. Na primjer, izlučivanje kvercetina i njegovih glikozida mokraćom iznosi 0.3–1,4 posto unesene doze [77]; kavena kiselina i ferulinska kiselina čine 5,9 posto odnosno 27 posto. Stoga polifenoli dobiveni iz tjestenine mogu imati pozitivan učinak na bubrežne stanice ovisno o njihovim

količina i metabolizam. Potrebna su daljnja istraživanja kako bi se bolje definirao njihov doprinos zdravlju bubrega.

Dopunski materijali:Sljedeće je dostupno online na https://www.mdpi.com/article/ 10.3390/nu13041131/s1, Tablica S1: Nutritivna tablica. Tablica S2—Detekcija varijacija stanične održivosti HEK-293 i MDCK inkubiranih s rastućom količinom frakcija obogaćenih karotenoidima iz tjestenine od heljde i tjestenine od jaja na mediju i MMPP za 72 (HEK-293) i 24 ( MDCK) sati. * p < {{20}}.5,="" **="" p="">< 0.01,="" ***="" p="">< {{30}}.001="" .="" tablica="" s3—detekcija="" varijacije="" stanične="" održivosti="" hek-293="" inkubirane="" s="" rastućom="" količinom="" hidroalkoholnog="" ekstrakta="" tjestenine="" od="" heljde,="" ražene="" tjestenine="" i="" tjestenine="" od="" jaja="" na="" mediju="" i="" mmpp-u="" tijekom="" 72="" sata.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" tablica="" s4—detekcija="" varijacije="" stanične="" održivosti="" mdck="" inkubirane="" s="" rastućom="" količinom="" hidroalkoholnog="" ekstrakta="" tjestenine="" od="" heljde,="" ražene="" tjestenine="" i="" tjestenine="" od="" jaja="" na="" mediju="" i="" mmpp-u="" tijekom="" 24="" sata.="" *="" p="">< 0,5,="" **="" p="">< 0,01,="" ***="" p="">< 0,001.="" slika="" s1:="" ms="" spektri="" kaempferola="" u="" hidroalkoholnom="" ekstraktu="" kuhane="" tjestenine="" od="" heljde.="" slika="" s2:="" ms="" spektri="" kvercetina="" u="" hidroalkoholnom="" ekstraktu="" kuhane="" tjestenine="" od="" heljde.="" slika="" s3:="" ms="" spektri="" rutina="" u="" hidroalkoholnom="" ekstraktu="" kuhane="" tjestenine.="" slika="" s4:="" ms="" spektri="" ferulinske="" kiseline="" jedan="" u="" hidroalkoholnom="" ekstraktu="" kuhane="" tjestenine.="" slika="" s5:="" ms="" spektri="" apigeninskih="" glikozida="" u="" hidroalkoholnom="" ekstraktu="" tjestenine="" kuhane="" u="" jajima.="" slika="" s6:="" detekcija="" stanične="" održivosti="" hek-293="" inkubirane="" s="" rastućom="" količinom="" indooctene="" kiseline,="" -karotena="" i="" kavene="" kiseline="" tijekom="" 24="" (a)="" i="" 48="" (b)="" sati="" prijavljene="" vrijednosti="" koje="" odgovaraju="" srednjoj="" vrijednosti="" stanične="" održivosti="" sa="" standardnom="" pogreškom="" preko="" tri="" biološka="" ponavljanja.="" postotak="" stanične="" vitalnosti="" izračunat="" je="" pomoću="" omjera="">

References

1. Lacatus,u, CM; Grigorescu, ED; Florija, M.; Onofriescu, A.; Mihai, BM Mediteranska prehrana: od kulture prehrane vođene okolišem do medicinskog recepta u nastajanju. Int. J. Okolina. Res. Javno zdravstvo 2019, 16, 942.

2. Jacobs, DR; Gross, dr. med.; Tapsell, LC Sinergija hrane: operativni koncept za razumijevanje prehrane. Am. J. Clin. Nutr.2009, 89, 1543S.

3. De Lorgeril, M.; Salen, P.; Martin, J.-L.; Monjaud, I.; Delaye, J.; Mamelle, N. Mediteranska prehrana, tradicionalni čimbenici rizika i stopa kardiovaskularnih komplikacija nakon infarkta miokarda. Naklada 1999, 99, 779–785.

4. Psaltopoulou, T.; Naska, A.; Orfanos, P.; Trichopoulos, D.; Mountokalakis, T.; Trichopoulou, A. Maslinovo ulje, mediteranska prehrana i arterijski krvni tlak: Grčka europska prospektivna studija o raku i prehrani (EPIC). Am. J. Clin. Nutr. 2004., 80, 1012–1018.

5. Estruch, R.; Ros, E.; Salas-Salvad6, J.; Covas, M.-I.; Corella, D.; Ar6s, F.; G6mez-Gracia, E.; Ruiz-Gutierrez, V.; Fiol, M.; Lapetra, J.; et al. Primarna prevencija kardiovaskularnih bolesti mediteranskom prehranom. Z. Gefassmedizin 2013, 10, 28.

6. Uusitupa, M.; Khan, TA; Viguiliouk, E.; Kahleova, H.; Rivellese, AA; Hermansen, K.; Pfeiffer, A.; Thanopoulou, A.; Salas- Salvad6, J.; Schwab, U.; et al. Prevencija dijabetesa tipa 2 promjenom načina života: sustavni pregled i meta-analiza. Nutrijenti 2019, 11, 2611.

7. Jannasch, F.; Kröger, J.; Schulze, MB Obrasci prehrane i dijabetes tipa 2: Sustavni pregled literature i meta-analiza prospektivnih studija. J. Nutr. 2017., 147, 1174–1182.

8. Esposito, K.; Chiodini, P.; Maiorino, MI; Bellastella, G.; Panagiotakos, D.; Giugliano, D. Koja dijeta za prevenciju dijabetesa tipa 2? Meta-analiza prospektivnih studija. Endokrine 2014, 47, 107–116.

9. Huo, R.; Du, T.; Xu, Y.; Xu, W.; Chen, X.; Sun, K.; Yu, X. Učinci mediteranske prehrane na kontrolu glikemije, gubitak tjelesne težine i čimbenike kardiovaskularnog rizika kod osoba s dijabetesom tipa 2: meta-analiza. Eur. J. Clin. Nutr. 2015, 69, 1200–1208.

10. Martin-Peldez, S.; Fito, M.; Castaner, O. Učinci mediteranske prehrane na prevenciju dijabetesa tipa 2, progresiju bolesti i povezane mehanizme. Recenzija. Hranjive tvari 2020, 12, 2236.

12. Milajerdi, A.; Namazi, N.; Larijani, B.; Azadbakht, L. Povezanost indeksa kvalitete prehrane i smrtnosti od raka: sustavni pregled i meta-analiza kohortnih studija. Nutr. Rak 2018, 70, 1091–1105.

12. Schwingshackl, L.; Schwedhelm, C.; Gilbert, C.; Hoffmann, G. Pridržavanje mediteranske prehrane i rizik od raka: ažurirani sustavni pregled i meta-analiza. Nutrijenti 2017, 9, 1063.

13. Say6n-Orea, C.; Razquin, C.; Bull6, M.; Corella, D.; Fit6, M.; Romaguera, D.; Vioque, J.; Alonso-G6mez, AM; Wärnberg, J.; Martinez, JA; et al. Učinak nutritivne intervencije i intervencije u ponašanju na pridržavanje mediteranske dijete smanjene energije među pacijentima s metaboličkim sindromom: privremena analiza randomiziranog kliničkog ispitivanja PREDIMED-Plus. JAMA J. Am. Med. Izv. 2019, 322, 1486–1499.

15. Bajerska, J.; Chmurzynska, A.; Muzsik, A.; Krzyz˙ anowska, P.; Ma˛dry, E.; Malinowska, AM; Walkowiak, J. Gubitak težine i metabolički zdravstveni učinci energetski ograničene mediteranske i srednjoeuropske prehrane u žena u postmenopauzi: randomizirano kontrolirano ispitivanje. Sci. Rep. 2018, 8, 11170.

15. Estruch, R.; Martinez-Gonzalez, MA; Corella, D.; Salas-Salvad6, J.; Fit6, M.; Chiva-Blanch, G.; Fiol, M.; G6mez-Gracia, E.; Ar6s, F.; Lapetra, J.; et al. Učinak mediteranske prehrane s visokim udjelom masti na tjelesnu težinu i opseg struka: analiza unaprijed određenih sekundarnih ishoda PREDIMED randomiziranog kontroliranog ispitivanja. Lancet Diabetes Endocrinol. 2019, 7, e6–e17.

16. Molendijk, M.; Molero, P.; Ortuño Sdnchez-Pedreño, F.; Van der Does, W.; Angel Martinez-Gonzalez, M. Kvaliteta prehrane i rizik od depresije: sustavni pregled i meta-analiza doze-odgovora prospektivnih studija. J. Afekt. Nered. 2018, 226, 346–354.

17. Wu, L.; Sun, D. Pridržavanje mediteranske prehrane i rizik od razvoja kognitivnih poremećaja: Ažurirani sustavni pregled i meta-analiza prospektivnih kohortnih studija. Sci. Rep. 2017, 7, 1–9.

18. Loughrey, DG; Lavecchia, S.; Brennan, S.; Lawlor, dipl. Kelly, ME Utjecaj mediteranske prehrane na kognitivno funkcioniranje zdravih starijih odraslih osoba: sustavni pregled i meta-analiza. Adv. Nutr. 2017, 8, 571–586.

19. Arnold, SE; Arvanitakis, Z.; Macauley-Rambach, SL; Koenig, AM; Wang, HY; Ahima, RS; Obrt, S.; Gandy, S.; Buettner, C.; Stoeckel, LE; et a Inzulinska rezistencija mozga kod dijabetesa tipa 2 i Alzheimerove bolesti: koncepti i zagonetke. Nat. Rev. Neurol. 2018, 14, 168–181.

20. Trichopoulou, A.; Vasilopoulou, E. Mediteranska prehrana i dugovječnost. Br. J. Nutr. 2020., 84, S205–S209.