Prediktivni značaj ekspresije proteina 8 povezanog s bubrežnim mijeloidom u bolesnika s bolestima bubrega povezanim s pretilošću ili dijabetesom tipa 2

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Masato Kasahara^1,3, Hideki Yokoi¹, Hirotaka Imamaki¹,Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Shinji Yasuno³, Kenji Ueshima³, Takashi Morikawa⁵,Yoshio Konishi⁵, Masahito Imanishi⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Odjel za medicinu i kliničke znanosti, Medicinski fakultet Sveučilišta Kyoto, Kyoto, Japan,

²Medicinski inovacijski centar, Medicinski fakultet Sveučilišta Kyoto, Kyoto, Japan,

³Odjel za EBM istraživanje, Institut za unapređenje kliničke i translacijske znanosti, Sveučilišna bolnica Kyoto, Kyoto, Japan,

⁴Odjel za nefrologiju, bolnica Crvenog križa Osaka, Osaka, Japan,

5 Odjel za nefrologiju i hipertenziju, Opća bolnica grada Osake, Osaka, Japan,

6 Odjel za farmakologiju, Medicinski fakultet Sveučilišta Kagawa, Kagawa, Japan

Sažetak

Pozadina i cilj: Izvijestili smo da toll-like receptor 4 (TLR4) i jedan od njegovih endogenih liganada, protein 8 povezan s mijeloidom (MRP8 ili S100A8), igraju važnu ulogu u napredovanju dijabetičke nefropatije kod miševa. Cilj ovog istraživanja bio je procijeniti značajbubregEkspresija MRP8 u bolesnika spretilost- ili dijabetes tipa 2bolesti bubrega. Metode: U dijabetičara, pretilih ili kontrolnih subjekata, MRP8 mRNA i razine ekspresije proteina u uzorcima bubrežne biopsije određene su RT-PCR-om u stvarnom vremenu i imunohistokemijom (n=28 odnosno 65) i njihova povezanost s osnovnom vrijednošću te su analizirani prognostički parametri. Učinci MRP8 na ekspresiju proupalnih gena ispitivani su pomoću makrofaga. Rezultati:BubregRazine ekspresije gena MRP8 i proteina bile su povišene u skupinama s pretilošću ili dijabetičarima u usporedbi s kontrolnom skupinom. Među svim subjektima, prema univarijatnoj linearnoj regresijskoj analizi, glomerularni MRP8-pozitivan broj stanica i tubulointersticijski MRP8-pozitivna površina na početku su bili u korelaciji ne samo s različitim poznatim čimbenicima rizika za dijabetičku nefropatiju (kao kao što su sistolički krvni tlak, proteinurija i kreatinin u serumu), ali i s opsegom glomeruloskleroze i tubulointersticijske fibroze. Neovisni čimbenici koji predviđaju razine proteina u mokraći godinu dana kasnije ispitani su multivarijantnom analizom, a uključivali su glomerularni MRP8-pozitivan broj stanica (b=0.59, P,0.001), proteinuriju (b=0.37, P=0.002) i sistolički krvni tlak (b=0.21, P=0.04) na početku, nakon prilagodbe za poznati rizik čimbenici. Ekspresija MRP8 proteina opažena je u CD68-pozitivnim makrofagima i atrofičnim tubulima. U uzgojenim mišjim makrofagima ekspresija proupalnih citokina izazvana proteinom MRP8 također je pokrenula autoindukciju MRP8 na način ovisan o TLR4-.

Zaključci: Čini se da je ekspresija glomerularnog MRP8 povezana s progresijom proteinurije kod pretilih pacijenata ili pacijenata s dijabetesom tipa 2, vjerojatno induciranjem upalnih promjena u makrofagima putem TLR4 signalizacije.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Uvod

Kronična upala ima važnu ulogu u patogenezi dijabetesa ilipretilosti njegove kardiovaskularne komplikacije [1]. Uključenost urođenih imunoloških receptora i endogenih liganada u proces kronične upale je implicirana. Protein 8 povezan s mijeloidom (MRP8, također poznat kao S100A8 ili kalgranulin A) izvorno je identificiran kao citoplazmatski protein koji veže kalcij u neutrofilima i monocitima [2] i postao je široko prepoznat kao snažan endogeni ligand za toll-like receptor 4 (TLR4) ) kod raznih bolesti uključujući septički šok, vaskularne i autoimune poremećaje [3,4,5]. Nedavno smo predložili da MRP8/TLR4 signalizacija igra važnu ulogu u progresiji dijabetičke nefropatije uzrokovane hiperlipidemijom [6]. Glomerularni makrofagi i stanice sabirnih kanalića glavni su izvori MRP8 u mišjim modelima dijabetičke nefropatije[6] odnosno bubrežne fibroze [7]. Razine MRP8 u plazmi, koji obično tvori heterodimerni kompleks s veznim partnerom MRP14 u krvotoku, povećane su u pretilih osoba [8,9]. Međutim, nije bilo izvješća o ispitivanju bubrežne ekspresije MRP8 kod pacijenata s pretilošću ilitip2 dijabetesi njegovu povezanost s bubrežnom prognozom.

Cilj ovog istraživanja bio je odrediti razine ekspresije mRNA i proteina MRP8 ububregjapanskih pacijenata s dijabetičkom nefropatijom (DN),pretilost-povezana glomerulopatija (ORG), nefrotski sindrom minimalne promjene (MCNS) ili manja glomerularna abnormalnost (MGA), koji su svi dijagnosticirani biopsijom bubrega, te za procjenu može li bubrežna ekspresija MRP8 predvidjeti bubrežne ishode.

Cistanche može poboljšati rad bubrega

Materijali i metode

Etička izjava

Studija na ljudima provedena je u skladu s načelima izraženima u Helsinškoj deklaraciji, a odobrili su je etički odbori za istraživanje na ljudima Medicinskog fakulteta Sveučilišta Kyoto i Opće bolnice grada Osake. Svi su sudionici dali pismeni informirani pristanak. Protokol studije na životinjama odobrio je Odbor za istraživanje životinja Medicinskog fakulteta Sveučilišta Kyoto (Broj dozvole: Med Kyo 13318). Svi kirurški zahvati na životinjama izvedeni su pod anestezijom natrijevim pentobarbitalom i uloženi su svi napori da se patnja svede na minimum.

Predmeti studija

Proteinurijski pacijenti spretilostili dijabetesa tipa 2 koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega bili su uključeni u ovu studiju. Isključeni su pacijenti s infektivnim bolestima, rakom, bolešću jetre ili kolagenom. Proteinurija je definirana kao protein u mokraći veći od 0.5 g/g kreatinina ili albumin u mokraći veći od 300 mg/g kreatinina u najmanje dva uzastopna mjerenja.Pretilostdefiniran je kao indeks tjelesne mase (BMI) veći od 25.0 (kg/m²). Dijagnosticirana je dijabetes tipa 2 prema kriterijima Svjetske zdravstvene organizacije. Biokemijska mjerenja pri prijemu za biopsiju bubrega korištena su kao osnovne karakteristike za analizu presjeka. Procijenjena brzina glomerularne filtracije (eGFR) izračunata je pomoću pojednostavljene jednadžbe predviđanja koju je predložilo Japansko društvo za nefrologiju: eGFR (ml/min/1,73 m²)=1946 [dob (godine)]20.287 6 [serumski kreatinin (mg perdl)]21.094 60.739 (za žene), što je validirana lokalna modifikacija MDRD [ 10]. Serumske koncentracije kreatinina mjerene su enzimskom metodom.

Za imunohistokemiju je analizirano 65 japanskih pacijenata koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega na Odjelu za medicinu i kliničku znanost Sveučilišne bolnice Kyoto između 2000. i 2011. godine. Biopsijom dokazane dijagnoze svih pacijenata tijekom ovog razdoblja navedene su u tablici S1 u datoteci S1. Subjekti ispitani u ovom radu uključivali su DN (n=19), ORG (n=10) i kontrolne subjekte koji nisu pretili, nisu dijabetičari i kojima je dijagnosticiran MGA (n=19) ili MCNS (n=17). Neki slučajevi u ovim kategorijama bili su isključeni jer su rezidualni dostupni uzorci sadržavali manje od 10 glomerula. Definicija DN sastojala se od (1) trajanja više od 5 godina nakon pojave dijabetesa, (2) postojanja mikro- ili makro-albuminurije, (3) kompatibilnih histopatoloških promjena s DN kao što su zadebljanje bazalne membrane glomerula, mezangijalna ekspanzija, nodularni skleroza (Kimmelstiel-Wilsonovi noduli) i/ili arteriolarna hijalinoza, i (4) isključivanje drugih uzroka bubrežnih poremećaja [11]. ORG je morfološki definiran kao žarišna segmentalna glomeruloskleroza i/ili glomerulomegalija u ispitanika koji imaju obojepretilosti proteinurija, čije su definicije opisane gore [12,13].

Za analizu ekspresije mRNA isključeni su uzorci niske kvalitete u kojima su razine 18S ribosomske RNA (rRNA) bile niže od granice osjetljivosti detekcije RT-PCR-om u stvarnom vremenu. Uključeni subjekti sastojali su se od 22 pacijenta s dijabetesom tipa 2 koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega u Općoj bolnici grada Osake između 2000. i 2010. i 6 kontrolnih subjekata bez dijabetesa, koji su imali MGA dokazan biopsijom.

Tablice 1 i 2 sažimaju osnovne kliničke karakteristike pacijenata koji su pregledani imunohistokemijskom analizom ili analizom ekspresije gena. Za svjetlosnu mikroskopiju uzorci tkiva obrađeni su prema standardnim postupcima. Sekcije su obojene hematoksilin-eozinom, periodnom kiselinom-Schiffom, periodnom kiselinom metenamin srebra ili Massonovim trikromom (slika S1). Omjere broja glomerula s globalnom sklerozom među ukupnim glomerulima i relativnim područjima tubulointersticijske fibroze neovisno su procijenila dva patologa nesvjesna dijagnoze i kliničkih podataka.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Definicija bubrežnih ishoda

Sljedeća dva prognostička pokazatelja ispitana su analizama linearne regresije i logističke regresije: (1) opseg proteinurije izmjeren godinu dana nakon biopsije i (2) bubrežni događaj definiran kao godišnji porast kreatinina u serumu za 0,50 posto od početne vrijednosti ili početka kronične dijalize.

Imunohistokemija

Imunohistokemija MRP8 i CD68 provedena je pomoćububregsekcije (debljine 4 mm) fiksirane s 4 posto puferiranim paraformaldehidom. Nakon pronalaska antigena citratnim puferom, dijelovi bubrega su inkubirani s 10 posto kozjeg seruma, nakon čega su inkubirani mišji anti-ljudski MRP8 (1:100; BMA biomedicals, Augst, Švicarska) [14] ili mišji anti-ljudski CD68 antitijela (1:50 ; DAKO, Ely, UK). Primarna protutijela vizualizirana su sekundarnim protutijelom konjugiranim s peroksidazom hrena i 3,3-diaminobenzidin tetrahidrokloridom (Dako USA, Carpinteria, CA). Jezgre su obojene hematoksilinom. MRP8-pozitivne stanice izbrojane su u više od 10 glomerula, a MRP8-pozitivna površina u tubulointersticiju izmjerena je kvantitativno kako bi se dobio prosjek za svakog ispitanika pomoću softvera MetaMorph 7.5 (Molecular Devices, Downingtown, PA, SAD ). Kolokalizacija CD68- i MRP8-pozitivnih stanica procijenjena je serijskim rezovima. Nije bilo niti MRP8 niti CD68 signala u negativnim kontrolama obojenim bez prvog antitijela (slika S2). Prethodnom inkubacijom anti-MRP8 antitijela s 20 molarnog viška rekombinantnog humanog MRP8 proteina (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) na 4ºC preko noći, bojanje je značajno smanjeno, ako ne i potpuno, dodatno podržavajući specifičnost antitijela (Slika S3) .

Cistanche za liječenje bubrega

Procjena ekspresije mRNA

Smrznutobubregsekcije su odvojene u glomerula i neglomerula tkiva laserskom mikrodisekcijom (LM200; Olympus, Tokyo, Japan) kako je prethodno opisano [15]. Ukupna RNA ekstrahirana je mini kitom RNeasy (Qiagen, Tokyo, Japan). Razine ekspresije mRNA određene su TaqMan PCR-om u stvarnom vremenu (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) [16,17]. Razine ekspresije svih gena normalizirane su razinama 18S rRNA (unutarnja kontrola). Pogledajte tablicu S2 u datoteci S1 za sekvence primera i sonde. Eukariotska 18S rRNA detektirana je s unaprijed razvijenim reagensima za ispitivanje TaqMan (Applied Biosystems).

Tablica 1. Osnovne kliničke karakteristike pacijenata na biopsiji bubrega kod kojih je imunohistokemijski analizirana ekspresija proteina MRP8.

MGA: manja abnormalnost glomerula, MCNS: nefrotski sindrom minimalne promjene, ORG:pretilost-povezana glomerulopatija, DN: dijabetička nefropatija, BMI: indeks tjelesne mase, BUN: dušik uree u krvi, CRP: C-reaktivni protein. Podaci su sredstva 6 SD. *Sveukupne razlike između MGA, MCNS, ORG i DN grupa uspoređivao je ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 tretman makrofaga

Makrofagi dobiveni iz koštane srži stvoreni su iz divljeg tipa ili TLR4 nokautiranih (KO) miševa [18] na genetskoj pozadini C57BL/6J (Oriental BioService, Kyoto, Japan) kako je prethodno opisano [6]. Ukratko, nakon lize crvenih krvnih stanica, stanice koštane srži resuspendirane su u mediju koji je sadržavao 20 posto fetalnog telećeg seruma i 50 ng/ml rekombinantnog humanog faktora stimulacije kolonije makrofaga (Peprotech, Rocky Hill, NJ, SAD) i uzgajane na 37uC u atmosferi s 5 posto CO2. Dana 7, makrofagi su inkubirani s rekombinantnim mišjim MRP8 (Abnova, Taipei, Tajvan) ili nosačem 4 sata. Polimiksin B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japan) dodan je u svaku jažicu kako bi se smanjila kontaminacija endotoksinom kao što je prethodno opisano [3,19]. Noendotoksin je detektiran u bilo kojoj koncentraciji MRP8 testiranog ovdje nakon inkubacije s 25 mg/ml polimiksina B pomoću ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, SAD). Ukupna RNA iz stanica ekstrahirana je RNeasy MiniKitom, a razine ekspresije mRNA interleukina-1 beta (IL-1b), faktora nekroze tumora-alfa (TNFa) i MRP8 određene su TaqMan-om u stvarnom vremenu RT-PCR. Razine ekspresije svih gena normalizirane su razinama GAPDH glodavaca (unutarnja kontrola, unaprijed razvijeni reagensi za ispitivanje TaqMan). Sekvence primera i sonde za PCR u stvarnom vremenu navedene su u tablici S2 u datoteci S1.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost 6 SD, ili srednja vrijednost 695 posto intervala pouzdanosti (CI) kada je to prikladno. Za usporedbu između četiri skupine korištena je jednosmjerna ili dvosmjerna ANOVA s Bonferronijevom post-hoc analizom, a kategoričke varijable uspoređene su korištenjem x2 testa. Studentov nespareni t-test primijenjen je za usporedbu između dviju skupina prema potrebi. Spearmanovi koeficijenti korelacije procijenjeni su kako bi se odredile povezanosti između dviju varijabli. Kako bi se ispitali učinci osnovnih kovarijabli koje određuju opseg glomerularne ili tubulointersticijske ekspresije MRP8 ili razine proteina u mokraći godinu dana nakon biopsije, provedene su univarijatne i multivarijatne linearne regresijske analize. Logistička regresijska analiza korištena je za analizu eksplanatornih varijabli koje predviđaju pojavu bubrežnih događaja. Svi podaci analizirani su pomoću softvera StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Cary, NC, SAD). P vrijednosti,0.05 smatrane su statistički značajnim.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Rezultati

Usporedili smo razine ekspresije proteina MRP8 ububregmeđu DN, ORG i skupinama koje nisu pretile, kontrolne skupine bez dijabetesa (MGA i CNS). Imunohistokemijska analiza otkrila je da su i glomerularni MRP8-pozitivni broj stanica (Slika 1A) i tubulointersticijsko MRP8-pozitivno područje (Slika 1B) u DN bili značajno veći od onih u drugim skupinama uključujući MGA, MCNS, i ORG (P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Tablica 2. Osnovne kliničke karakteristike pacijenata na biopsiji bubrega kod kojih je analizirana ekspresija MRP8 mRNA pomoću RT-PCR u stvarnom vremenu.

Asocijacije izmeđububregMRP8 signali i osnovni klinički parametri u vrijeme biopsije bubrega analizirani su poprečno (Tablica 3). Univarijatnom analizom, ekspresija glomerularnog i/ili tubulointersticijalnog MRP8 proteina bila je značajno povezana s dobi, sistoličkim i dijastoličkim krvnim tlakom, proteinima u urinu, serumskim razinama kreatinina, BUN i HDL kolesterola, eGFR-om i opsegom globalne glomeruloskleroze i tubulointersticijske fibroze. Ti su parametri dodatno ispitani multivarijantnom analizom nakon isključivanja dijastoličkog krvnog tlaka, eGFR i BUN zbog kolinearnosti. Postotak tubulointersticijske fibroze bio je u neovisnoj korelaciji s glomerularnim MRP8 signalima (b=0.62, prilagođeni P=0.02) i tubulointersticijskim MRP8 signalima (b=0.85, prilagođeni P ,0,001), odnosno. Dodatno, tubulointersticijski MRP8 signali također su bili u neovisnoj korelaciji s osnovnom proteinurijom (b=0.20, prilagođeni P=0.01). Analize raspršenih dijagrama između MRP8 signala u glomerulima ili tubulointersticiju i klinički parametri pokazuju da je MCNSgroup različit uzorak distribucije u odnosu na druge skupine, posebno u pogledu razina proteina u urinu i LDL kolesterola u serumu (Slika S5A–D, S6A–D). Isključivanje MCNS skupine poboljšalo je korelaciju između signala MRP8 i razina proteina u mokraći ili LDL-kolesterola u serumu (Slika S5E–F, S6E–F). Stoga smo proveli pod-analizu isključujući pacijente s MCNS-om i otkrili da je protein u mokraći nezavisan čimbenik u korelaciji s glomerularnim MRP8 signalima multivarijantnom analizom (tablica 4; b=0.36, prilagođeni P=0.03 ).

Zatim smo proveli linearnu regresijsku ili logističku regresijsku analizu kako bismo identificirali čimbenike koji objašnjavaju bubrežne ishode, a to su bili opseg proteinurije godinu dana kasnije i bubrežni događaj unutar godine dana. Budući da je postojala dobra povezanost između glomerularnih i tubulointersticijskih MRP8 signala (Slika S7; R=0.67,P, 0.001), ti su parametri alternativno uvršteni u daljnje analize . Višestrukom regresijskom analizom procijenili smo povezanost između osnovnih parametara i proteina u urinu godinu dana nakon biopsije bubrega. Kao što je prikazano u tablici 5, glomerularni MRP8 signal (b=0.59, prilagođeni P,0.001) bio je prediktivni faktor za opseg proteinurije godinu dana kasnije, kao i osnovni sistolički krvni tlak (b {{13} }.21, prilagođeni P=0.04) i osnovna proteinurija (b=0.37, prilagođeni P=0.002) bili su. Ovi su parametri bili neovisni o drugim poznatim čimbenicima rizika za dijabetičku nefropatiju, uključujući bubrežnu disfunkciju (serumski kreatinin) i opseg globalne skleroze i tubulointersticijske fibroze [11,21-24]. S druge strane, tubulointersticijski MRP8 signal (b=0.34, prilagođeni P=0.09) nije bio neovisni prediktivni faktor za razine proteina u mokraći godinu dana kasnije. Bubrežni događaji javili su se u 7 bolesnika (6 u DN i 1 u ORG slučajevima) unutar godinu dana nakon biopsije bubrega. Univarijantnom analizom, ne samo opseg glomeruloskleroze i tubulointersticijske fibroze, te glomerularni i tubulointersticijski MRP8 signali, već i krvni tlakovi, bubrežna disfunkcija i razine proteina u mokraći na početku su bili značajni prediktivni čimbenici za pojavu bubrežnih događaja. Međutim, multivarijantnom analizom, njihove su kovarijate međusobno poništene (tablica S3 u datoteci S1), vjerojatno zbog visokih korelacija među tim parametrima.

Konačno, ispitali smo snagu MRP8 kao endogenog liganda za TLR4 koristeći uzgojene makrofage. U makrofagima dobivenim iz koštane srži divljeg tipa miševa, MRP8 protein-inducirana je pojačana regulacija proupalnih citokinskih gena kao što su IL-1b i TNFa i također je pokrenula auto-indukciju MRP8, na način ovisan o dozi između 1{{ 15}}–1000 ng/ml. Ovi učinci MRP8 bili su potisnuti za otprilike dvije trećine u makrofagima dobivenim od TLR4 KO miševa (P, 0,01) (Slika 3).

Slika 1. Imunohistokemijske i mRNA analize za MRP8 ububreguzorci biopsije. Kvantifikacija broja glomerularnih MRP{{0}}pozitivnih stanica (A) i tubulointersticijalnog MRP8-pozitivnog područja (B). Ekspresija mRNA MRP8 u glomerularnim i neglomerularnim frakcijama (C). Otvorene stupce: kontrole bez pretilosti, bez dijabetesa koje su MGA ili MCNS, zatvorene stupce: ORG ili DN (A–C). Reprezentativne slike grupa MGA, MCNS, ORG i DN (D–G). MGA: manja abnormalnost glomerula, MCNS: nefrotski sindrom minimalne promjene, ORG: glomerulopatija povezana s pretilošću, DN: dijabetička nefropatija. *P,0.01.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g001

Rasprava

Ova studija je pokazala da je MRP8 obilno eksprimiran u glomerulima i tubulointersticiju pacijenata s DNK u usporedbi s ORG-om i kontrolom bez pretilosti, bez dijabetesa (MGA i MCNS). Nadalje, u ORG subjekata, razine ekspresije MRP8 bile su više nego kod MGA ili MCNS subjekata. U osnovnom presječnom ispitivanju koje je uključivalo sve subjekte, analizom univarijantne linearne regresije, glomerularni MRP8-pozitivan broj stanica i tubulointersticijski MRP8-pozitivno područje bili su u korelaciji ne samo s različitim poznatim čimbenicima rizika za dijabetička nefropatija (poput sistoličkog krvnog tlaka, proteinurije i kreatinina u serumu), ali i s opsegom glomeruloskleroze i tubulointersticijske fibroze. Multivarijantnom analizom, tubulointersticijska MRP8-pozitivna površina značajno je korelirala s proteinurijom i tubulointersticijalnom fibrozom. Glomerularni MRP8-pozitivni broj stanica bio je u značajnoj korelaciji s tubulointersticijalnom fibrozom u primarnoj analizi i s proteinurijom u podanalizi koja isključuje MCNS skupinu. Imunohistokemija je pokazala da je MRP8 eksprimiran, barem djelomično, u makrofagima i atrofičnim tubulima koji eksprimiraju CD68(plus). Ovi nalazi otvaraju mogućnost dabubregMRP8 signali u glomerulima ili tubulointersticiju mogu poslužiti kao novi markeri dijabetičke nefropatije.

Slika 2. Lokalizacija ekspresije proteina CD68 i MRP8 u serijskim presjecima slučajeva dijabetičke nefropatije. Ekspresija CD68(A, B) i ekspresija MRP8 (C, D) u uparenim bubrežnim uzorcima (A i C, ili B i D). Strelice pokazuju kolokalizaciju CD68 i MRP8 signala.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

U prognostičkoj studiji, multivarijatna analiza otkrila je da su razine proteina u mokraći godinu dana nakon biopsije bubrega bile neovisno povezane s pozitivnim brojem stanica glomerula MRP8-, proteinima u mokraći i sistoličkim krvnim tlakom na početku. Treba napomenuti da je ekspresija glomerularnog MRP8 pokazala najjaču korelaciju s proteinom u urinu godinu dana kasnije (b= 0.87), čak jaču od osnovne vrijednosti proteina u urinu (b=0.78), prema univarijatnoj analizi. Djelomično je to zato što glomerularna ekspresija MRP8 nije u velikoj mjeri povišena u 'benignim' oblicima proteinurije kao što su oni uočeni u pacijenata s MCNS-om, čije su razine proteinurije izrazito visoke pri dijagnozi biopsijom bubrega, ali se obično povuku unutar godinu dana nakon početka imunosupresivne terapije. Ovi nalazi sugeriraju da ekspresija glomerularnog MRP8 može imati jedinstvenu prediktivnu prirodu kao marker bolesti, koji se ne može zamijeniti osnovnom proteinurijom ili rutinskom patološkom analizom koja procjenjuje globalnu glomerulosklerozu i tubulointersticijsku fibrozu. Štoviše, nagađamo da ekspresija glomerularnog MRP8 nije jednostavan marker ili promatrač, već aktivni igrač u ozljedi glomerula kao što je objašnjeno u nastavku.

Koeficijent determinacije (R2) izračunat s eksplanatornim parametrima uključenim u višestruku regresijsku analizu bio je 0.52* odnosno 0.74#. y, godine; BP, krvni tlak; gCr, g kreatinin; T-hol, ukupni kolesterol; HDL-Chol, HDL kolesterol; LDL-chol, LDL kolesterol; GS, glomeruloskleroza; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Tablica 4. Pod-analiza odnosa između osnovnih kliničkih parametara i MRP8 signala, nakon isključenja MCNS skupine.

Tablica 5. Višestruka regresijska analiza za identifikaciju čimbenika koji predviđaju razine proteina u mokraći godinu dana nakon biopsije bubrega

Slika 3. Učinci MRP8 na makrofage koji potječu iz koštane srži. Makrofagi koji potječu iz koštane srži (BMDM) stimulirani su rekombinantnim mišjim MRP8 tijekom 4 sata. Trake pogrešaka pokazuju 95 posto CI i statističke analize su provedene s log-transformiranim vrijednostima. Dvosmjerna ANOVA otkrila je značajne učinke genotipova, koncentracija MRP8 i njihovih interakcija za ekspresiju sva 3 gena (P,0.001 za sve usporedbe). n=4. WT, divlji tip; KO, nokaut; IL-1b, interleukin 1 beta; TNFa, faktor nekroze tumora-alfa. *P,0,01 među različitim koncentracijama, #P,0,01 među genotipovima.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

U drugom pokušaju longitudinalne studije, logistička regresijska analiza nije uspjela otkriti nijedan neovisni prediktor za pojavu bubrežnog događaja unutar godine dana. Nagađamo da je to djelomično zato što su tubulointersticijska ekspresija MRP8 i tubulointersticijska fibroza bili dva snažna prediktora za bubrežni događaj u univarijatnoj analizi, ali su njihove značajnosti međusobno poništene u multivarijatnoj analizi. Ova dva parametra pokazala su jaku korelaciju (R=0.68, P, 0.001) (Slika S8), što sugerira da bi ova dva parametra mogla biti ekvivalentna predviđanju bubrežnih događaja. Uistinu, intersticijska ekspresija MRP8 pokazala je prilično sličan obrazac intersticijske fibroze procijenjene Massonovim trikromnim bojanjem. Količina intersticijalnog MRP8 uvelike ovisi o pozitivnim signalima u atrofičnim tubulima, a ne o onima u makrofagima, čija se značajka razlikuje od one glomerularnog MRP8 u točkastoj raspodjeli. Nadalje, mala veličina uzorka, kratko razdoblje promatranja i mali broj ispitanika kod kojih su se razvili bubrežni poremećaji mogli su smanjiti snagu otkrivanja. Budući da ekspresija MRP8 u tubularnim epitelnim stanicama igra uzročnu ulogu u napredovanju tubulointersticijske upale u mišjem modelu bubrežne fibroze [7], bit će potrebna daljnja analiza kako bi se razjasnila uloga tubulointersticijskog MRP8 u DN.

U skladu s našom prethodnom studijom [6], MRP8 mRNA bila je pojačano regulirana uglavnom u glomerularnoj frakciji ljudskih DN subjekata u usporedbi s kontrolnim subjektima s MGA. S druge strane, ekspresija proteina MRP8 primijećena je ne samo u glomerulu već iu tubulointersticiju. S tim u vezi, treba napomenuti da su postojala dva različita obrasca bojenja MRP8 u tubulointersticiju DN. Jedan je bio intenzivno i žarišno bojenje u jako atrofičnim tubulima. Drugo je bilo blago obojenje raspoređeno duž četkastog ruba proksimalnih tubula, koje je također pronađeno u ORG i MCNS. Potonji signali vjerojatno predstavljaju MRP8 protein izveden iz krvi i ponovno apsorbiran u proksimalnim tubulima, što ne bi trebalo biti popraćeno povećanom ekspresijom MRP8 mRNA. Što se tiče proteina koji nisu MRP8, mi i drugi smo nedavno izvijestili o sličnim fenomenima detekcije imunoreaktivnih proteina u proksimalnim tubulima uzrokovanim reapsorpcijom, ali ne i bubrežnom sintezom [25,26]. S druge strane, budući da je malo bojenja MRP8 ostalo u testu apsorpcije antitijela, posebno u glomerularnim eksudativnim lezijama i fibroznim lezijama s teškim ožiljcima oko atrofičnih tubula, prisutnost nespecifičnih signala ne može se potpuno negirati (Slika S3).

Glomerularni MRP8 signali uglavnom su pokazivali isprekidane uzorke kod ispitanika s DN (Slika 1, Slika S4). Budući da su i CD68 i MRP8 detektirani mišjim monoklonskim antitijelima, lokalizacija ovih molekula procijenjena je serijskim rezovima, a ne dvostrukim imunološkim bojenjem. Obrasci bojenja MRP8 bili su kompatibilni s onima kod drugih upalnih bubrežnih poremećaja, uključujući IgAnefritis [27], membranoproliferativni glomerulonefritis [14] i glomerulonefritis povezan s ANCA [20], u kojima su makrofagi predloženi kao glavni izvor MRP8, kao što smo izvijestili u model glodavaca [6]. Osim toga, neutrofili se mogu smatrati još jednim izvorom MRP8 koji utječe na vaskularne komplikacije [28]. Trenutno istražujemo molekularni mehanizam zašto je MRP8 dominantno pojačan u stanicama mijeloične loze koje infiltriraju glomerule. Studija in vitro otkrila je da MRP8 inducira ekspresiju upalnih citokina i također potencira ekspresiju samog MRP8 u makrofagima na način ovisan o TLR4-. Osim toga, MRP8-pozitivne stanice nisu bile prisutne u nodularnim sklerozirajućim lezijama, što sugerira da bi glomerularni MRP8 mogao odražavati tekuće oštećenje glomerula [20]. Važno je napomenuti da je najveća studija na ljudima objavila da je ekspresija gena MRP8 u mononuklearnim stanicama krvi pacijenata s dijabetesom tipa 1 značajno povišena u ispitanika s komplikacijama dijabetesa, uključujući nefropatiju [29].

Budući da je inhibicija renin-angiotenzinskog sustava (RAS) važna determinanta bubrežnih ishoda, ispitali smo učinke blokade RAS-a nabubregMRP8 izraz. Nismo pronašli značajnu razliku u ekspresiji MRP8 mRNA bubrega između bolesnika s DN-om liječenih sa ili bez blokade RAS-a (Slika S9), vjerojatno zato što su slučajevi liječeni blokadom RAS-a imali tendenciju teže hipertenzije i proteinurije od slučajeva bez blokade RAS-a

U pretilih ljudi i miševa, povećani MRP8/14 kompleks u plazmi može odražavati stupanjpretilosta potječu iz adipocita kao i iz leukocita [8,9]. Naši ORG slučajevi imali su blago obojenje MRP8 u proksimalnim tubulima, što ukazuje na povećane razine MRP8 u plazmi. Nasuprot tome, nije bilo značajne korelacije između ekspresije tubulointersticijalnog MRP8 i indeksa tjelesne mase (slika S6G). Stoga, lokalni MRP8 izraz ububregmože bolje poslužiti kao marker za oštećenje bubrega, a ne zapretilost[8,9].

Cistanche za poboljšanje bubrežne disfunkcije

Naša studija ima nekoliko ograničenja. Broj uzoraka svake ispitivane skupine bio je mali. U mRNA i imunohistokemijske analize uključeni su neidentični subjekti. Budući da smo analizirali samo pacijente koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega, sastav pacijenata koje smo ovdje istraživali možda ne odražava one u općih bolesnika s dijabetesom tipa 2 ili općih kroničnih bolesnikabubregsubjekti bolesti. Iako dob nije zadržana kao neovisni čimbenik povezan s MRP8 signalima u našim podacima (tablica 3), poznato je da je starenje povezano s kroničnom upalom [30]. Učinci starosti ne mogu se potpuno zanemariti. Iako je većina MRP8 signala izgubljena u testu apsorpcije antitijela, ostali su neki pozitivni signali, što bi moglo biti uzrokovano nespecifičnim vezanjem prvog antitijela. Kao što je gore razmotreno, istraživanje bubrežne ekspresije MRP8 biopsijom bubrega pomaže nam razumjeti patofiziologiju i prognozu kroničnih bolesti bubrega, posebno povezanih spretilosti dijabetes, ali ima nedostatak za rutinsku i opetovanu upotrebu u ambulantnim klinikama

Ukratko, ova studija sugerira da ekspresija MRP8 ububregodražava trenutni patološki status i također predviđa bubrežne ishode u bolesnika spretilostilidijabetes tipa 2. Daljnja istraživanja koja proučavaju razine MRP8 u urinu kod pretilih ili dijabetičara u velikim razmjerima mogu biti opravdana

Popratne informacije

Slika S1 Reprezentativne fotografije koje prikazuju presjeke biopsije bubrega pacijenta s DN-om obojene (A) periodnom kiselinom Schiff, (B) periodnom kiselinom metenamin srebra ili (C) Massonovim trikromom. Omjer broja glomerula s globalnom sklerozom (strelice) među ukupnim glomerulima i relativnom površinom tubulointersticijske fibroze bio je 33 posto, odnosno 65 posto, u ovog pacijenta. (TIFF)

Slika S2 Imunohistokemija za MRP8 i CD68 proteine ​​u bolesnika s DN. Fotografije u desnom stupcu prikazuju pokuse negativne kontrole bez prvog protutijela. (TIF)

Slika S3 Test apsorpcije antitijela za MRP8 bojenje. PBS: fiziološka otopina puferirana fosfatom, rhMRP8: rekombinantni humani MRP8. (TIF)

Slika S4 Reprezentativne fotografije ekspresije MRP8 u MGA, MCNS, ORG i DN grupama. (TIF)

Slika S5 Korelacija između glomerularnog MRP8-pozitivnog broja stanica i kliničkih parametara. Korištene su log-transformirane vrijednosti MRP8 signala. Korelacije su analizirane koristeći sve 4 skupine (A–D, G) ili 3 skupine isključujući MCNS skupinu (E, F). Otvoreni krugovi: manja abnormalnost glomerula (MGA), zatvoreni krugovi: nefrotski sindrom minimalne promjene (MCNS), otvoreni trokuti:pretilost-povezana glomerulopatija (ORG), zatvoreni trokuti: dijabetička nefropatija (DN).(TIF)

Slika S6 Korelacija između tubulointersticijalnog MRP8-pozitivnog područja i kliničkih parametara. Korištene su log-transformirane vrijednosti MRP8 signala. Ove su korelacije analizirane korištenjem sve 4 skupine (A–D, G) ili 3 skupine isključujući MCNS skupinu (E, F). (TIF)

Slika S7 Korelacija između glomerularne i tubulointersticijske ekspresije MRP8. Korištene su log-transformirane vrijednosti MRP8 signala. (TIF)

Slika S8 Korelacija između tubulointersticijalnog MRP8-pozitivnog područja i tubulointersticijske fibroze. Korištene su log-transformirane vrijednosti MRP8 signala. (TIF)

Slika S9 Bubrežna mRNA ekspresija MRP8 u DN pacijenata sa ili bez renin-angiotenzin blokade. NS: nije značajno. n=15 (Da), 6 (Ne). Od 22 DN slučaja, informacije o lijekovima nisu bile dostupne kod jednog pacijenta. (TIF)

Datoteka S1 prateće tablice.

Tablica S1, Patološke dijagnoze svih slučajeva koji su bili podvrgnuti biopsiji bubrega na Odjelu za medicinu i kliničke znanosti, Sveučilišna bolnica u Kyotu između 2000. i 2011. Tablica S2, Sekvence primera i sonde za TaqMan RT-PCR u stvarnom vremenu. Tablica S3, Logistička regresijska analiza za pojavu bubrežnog događaja unutar godine dana. (DOC) Zahvale Izražavamo zahvalnost S. Tanaki za statističke savjete, Y. Ogawi, N.Igarashiju i C. Kimuri za tehničku pomoć te A. Yamamotou i SOgino za pomoć tajnici. Doprinosi autora Zamislio i dizajnirao eksperimente: TK KM MK HY MI AN KNMM. Izvodio pokuse: TK HI AI KK TM YK MI AN. Analizirani podaci: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Doprinos reagensa/materijala/alata za analizu: TK KM. Napisao rad: TK KMMM.

Djelovanje cistanche: liječenje bolesti bubrega

Reference

1. Donath MY, Shoelson SE (2011.) Dijabetes tipa 2 kao upalna bolest. Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L, et al. (1987) Dva proteina koji vežu kalcij u infiltrirajućim makrofagima reumatoidnog artritisa. Nature 330: 80–82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C, et al. (2007) Mrp8 i Mrp14 su endogeni aktivatori receptora 4 sličnog Tollu, koji potiču smrtonosni šok izazvan endotoksinom. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M, et al. (2009) Protein povezan s mijeloidom-8/14 kritičan je za biološki odgovor na vaskularnu ozljedu. Circulation 120: 427–436.

5. Gubitnik K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V, et al. (2010.) Ligandi 4 receptora sličnog Tollu Mrp8 i Mrp14 ključni su u razvoju autoreaktivnih CD8 plus T stanica. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2012) Pogoršanje dijabetičke nefropatije hiperlipidemijom posredovano je Toll-ovim receptorom 4 kod miševa. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011.) Epitelne stanice bubrežnih sabirnih kanala reguliraju upalu kod oštećenja tubulointersticija u miševa. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T, et al. (2012) Visoke cirkulirajuće razine kompleksa S100A8/A9 (kalprotektin) u muških Japanaca s abdominalnom adipoznošću i nereguliranom ekspresijom S100A8 i S100A9 u masnom tkivu pretilih miševa. Biochem Biophys Res Commun 419: 782–789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP, et al. (2009) Kalprotektin — novi markerpretilost. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K, et al. (2009) Revidirane jednadžbe za procijenjenu GFR iz serumskog kreatinina u Japanu. Ja sam JBubregDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, et al. (2005) Dijabetička nefropatija: dijagnoza, prevencija i liječenje. Skrb za dijabetes 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001.)Pretilost-povezana glomerulopatija: epidemija u nastajanju.BubregInt 59: 1498–1509.

13. Praga M, Morales E (2006.)Pretilost, proteinurija i progresija zatajenja bubrega.Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M, et al. (2005) Ekspresija proteina 8 povezana s mijeloidom na makrofazima je koristan prognostički marker za bubrežnu disfunkciju u djece s MPGN tipom 1. Am JBubregDis 45: 510–518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M, et al. (2011) Urinarni angiotenzinogen odražava aktivnost intrarenalnog renin-angiotenzinskog sustava u bolesnika s IgA nefropatijom. Nephrol Dial Transplant 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K, et al. (2012) Receptor natriuretičkog peptida gvanilil ciklaza-A štiti podocite od oštećenja glomerula izazvanog aldosteronom. J Am Soc Nephrol 23: 1198-1209.

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T, et al. (2008) Prekomjerna ekspresija faktora rasta vezivnog tkiva u podocitima pogoršava dijabetičku nefropatiju kod miševa.BubregInt. 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, et al. (1999) Vrhunska oštrica: Miševi s nedostatkom Toll-like receptora 4 (TLR4) slabo reagiraju na lipopolisaharid: dokaz za TLR4 kao genski proizvod Lps. J Immunol 162: 3749-3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X, et al. (2007) Uloga puta Toll-like receptora 4/NF-kappaB u upalnim promjenama izazvanim zasićenim masnim kiselinama u interakciji između adipocita i makrofaga. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N, et al. (2013) Ekspresija leukocita i seruma S100A8/S100A9 odražava aktivnost bolesti kod vaskulitisa i glomerulonefritisa povezanih s ANCA.BubregInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) Glavni čimbenici rizika za nefropatiju kod dijabetes melitusa tipa 2 su razine kolesterola u plazmi, srednji krvni tlak i hiperglikemija. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR, et al. (2000) Povezanost sistoličkog krvnog tlaka s makrovaskularnim i mikrovaskularnim komplikacijama dijabetesa tipa 2 (UKPDS 36): prospektivna promatračka studija. BMJ 321: 412–419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Nephropathy of type-2 diabetes mellitus. J Assoc Nephrol 9: 2157-2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Kliničke i histološke korelacije opadanja bubrežne funkcije u dijabetičara s proteinurijom. Dijabetes 43: 1046–1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, et al. (2012) Liverangiotenzinogen je primarni izvor bubrežnog angiotenzina II. J Am Soc Nephrol 23: 1181–1189.

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2009) Razine lipokalina povezane s neutrofilnom želatinazom u urinu odražavaju oštećenje glomerula, proksimalnih tubula i distalnih nefrona.BubregInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Akumulacija makrofaga koji izražavaju protein 8 povezan s mijeloidom povezan s progresijom sklerotičnih promjena u djece s IgA nefropatijom. Tohoku J Exp Med 218: 49–55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Hiperglikemija potiče mijelopoezu i otežava rješavanje ateroskleroze. Cell Metab 17: 695–708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X, et al. (2013.) Ekspresija upalnih gena pojačana je u perifernoj krvi pacijenata s dijabetesom tipa 1. Skrb za dijabetes.

30. Longo VD, Finch CE (2003.) Evolucijska medicina: od patuljastih modela sustava do zdravih stogodišnjaka? Znanost 299: 1342–1346.

Citat: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Prediktivni značajBubregEkspresija proteina 8 povezana s mijeloidom u bolesnika sPretilost- ili bolesti bubrega povezane s dijabetesom tipa 2. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Urednik: Utpal Sen, Sveučilište Louisville, Sjedinjene Američke Države

Primljeno 11. rujna 2013.; Prihvaćeno 14. siječnja 2014.; Objavljeno 18. veljače 2014

Autorska prava: 2014 Kuwabara et al. Ovo je članak s otvorenim pristupom koji se distribuira prema uvjetima Creative Commons Attribution License, koja dopušta neograničenu upotrebu, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da se navede izvorni autor i izvor.

Financiranje: Ovaj rad je djelomično podržan od strane Grant-in-Aid za istraživanje dijabetičke nefropatije i nefroskleroze Ministarstva zdravstva, rada i socijalne skrbi Japana (u KM), istraživačkih grantova japanskog Ministarstva obrazovanja, kulture, sporta, znanosti , i Technology (za TK, KM i MM), od Japanske fondacije za primijenjenu enzimologiju (za TK) i od Fondacije za istraživanje pušenja (za MM). Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u dizajnu studije, prikupljanju podataka i analizi, odluci o objavljivanju ili pripremi rukopisa.

Konkurentski interesi: Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi.

* E-pošta: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp