Pozitivna korelacija između spljoštenja bubrežnih tubula i ozljede bubrežnih tubula/intersticijske fibroze u modelima bolesti mišjih bubrega
Mar 17, 2022
SAŽETAK.Broj bolesnika s kroničnim bolest bubrega(CKD) kontinuirano raste na globalnoj razini. Kako bi se proučavala patogeneza i mehanizmi, razvijeni su mnogi životinjski modeli, uključujući spontane, genetske i inducirane modele. Iako svaki tip CKD pokazuje promjene tkiva specifične za bolest u ranim stadijima, tubularni poremećaj i intersticijska fibroza histološki se javljaju tijekom napredovanja do završnog stadijazatajenje bubrega. Stoga je kvantifikacija tubularnog poremećaja i intersticijske fibroze u istraživanju CKD-a na životinjskim modelima ključna za mjerenje stupnja ozbiljnosti CKD-a, a time i učinkovitosti terapijskih sredstava. Za kvantificiranje intersticijske fibroze korišteno je nekoliko strategija. Među faktorima bodovanja,bubrežnicjevasto spljoštenje može se kvantitativno ocijeniti jednostavno i jeftino. Međutim, dijagnostička vrijednostbubrežniprocjena cjevastog spljoštenja nije prethodno istražena. Stoga smo u ovoj studiji istražili korelaciju izmeđububrežnitubularnog spljoštenja i intersticijske fibroze ilibubrežnimarkeri tubularne ozljede. Uočili smo jaku korelaciju između stupnja tubularne ozljede/intersticijske fibroze ibubrežnicjevasto spljoštenje u tri vrste mišabubrežna bolestmodeli. To je prednost jer se tehnologije koje brzo napreduju kao što su umjetna inteligencija i obrada slike mogu lako primijeniti; stoga bi u budućnosti trebala biti moguća preciznija, objektivnija i kvantitativnija dijagnoza.
Ključne riječi:intersticijska fibroza, bolest bubrega, spljoštenje bubrežnih tubula, oštećenje bubrežnih tubula; zatajenje bubrega
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI
Bolesnici s kroničnimbolest bubrega(CKD) pokazuju simptome proteinurije ili produljeno (više od tri mjeseca) smanjenje brzine glomerularne filtracije [15]. Ova bolest je kategorizirana u rizičnu skupinu bolesnika s terminalnim stadijemzatajenje bubrega.Broj oboljelih od kronične bubrežne bolesti u svijetu kontinuirano raste. Kada CKD napreduje, dolazi do krajnjeg stadijazatajenje bubrega, što zahtijeva dijalitičko liječenje koje košta golem iznos, što dovodi do povećanja medicinskih troškova [14]. Stoga je hitno potreban razvoj novih markera za praćenje početka i napredovanja KBB-a i uspostavljanje novih metoda liječenja. Uobičajeni uzroci CKD-a uključuju dijabetes, visoki krvni tlak, glomerularnu bolest i druge čimbenike rizika za CKD. Iako svaki tip CKD pokazuje promjene tkiva specifične za bolest u ranim stadijima, tubularni poremećaj i intersticijska fibroza histološki se javljaju tijekom napredovanja do završnog stadijazatajenje bubrega. Bubrežnafibroza je promjena tkiva koja je uglavnom povezana s tubularnim poremećajem povezanim s CKD-om i intersticijskom fibrozom i smatra se značajnim ciljem liječenja za sprječavanje napredovanja do krajnjeg stadijazatajenje bubrega[25]. Stoga je kvantifikacija tubularnog poremećaja i intersticijske fibroze u istraživanju CKD-a na životinjskim modelima ključna za mjerenje stupnja ozbiljnosti CKD-a, a time i učinkovitosti terapijskih sredstava. Korišteno je nekoliko strategija za kvantificiranje intersticijske fibroze, uključujući Siriusovo crveno bojenje ili Massonovo trikromno bojenje za kvantificiranje regija fibrilizacije, bodovanje tubularnog poremećaja za morfološku analizububrežnitubulima i raznim markerima ozljeda, kao što su -SMA, lipokalin povezan s neutrofilnom želatinazom (NGAL), L-FABP i Kim-1 [6, 7, 9, 10, 16, 23]. Ocjena tubularnog poremećaja uključuje spljoštenje, širenje, degeneraciju, atrofiju i gubitak četkastog rubabubrežnitubule [27]. Među tim faktorima bodovanja,bubrežnicjevasto spljoštenje (smanjenje visine) može se kvantitativno evaluirati jednostavno i jeftino [1-3, 19, 20]. Međutim, dijagnostička vrijednost procjene spljoštenosti bubrežnih tubula nije prethodno istražena. Stoga smo analizirali korelaciju između stupnja intersticijske fibroze ibubrežnicjevasto spljoštenje ubolest bubrega.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
MATERIJALI I METODE
Etička izjavaSve pokuse na životinjama odobrio je predsjednik Sveučilišta Kitasato, nakon razmatranja Odbora za institucionalnu skrb i korištenje životinja Sveučilišta Kitasato (ID odobrenja: br. 19-153, 19-154, 19-155). Muški FVB/NJcl (FVB) i BALB/cAJcl (BALB/c) miševi dobiveni su od CLEA (Tokyo, Japan). Svi miševi su držani u specifičnim uvjetima bez patogena. Dobili su pristup sterilnoj hrani i vodi ad libitum prije i tijekom pokusa.ŽivotinjeTns2nph model: FVB-Tns2nph mutirani miš (FVB-nph) korišten je kao CKD model kako je opisano u [22]. Ishemijsko-reperfuzijski model (IR): IR model je stvoren kako je prethodno opisano [18]. Osmotjedni miševi (mužjaci FVB) anestezirani su inhalacijom izoflurana i uklonjeni su im lijevi bubrezi, zatim su sloj mišića i facija zatvoreni upijajućim šavom. Nakon deset dana oporavka, miševi su anestezirani intraperitonealnom injekcijom kombinacije lijekova za anesteziju kako je prethodno opisano [11], njihovabubrežniarterije i vene održavane su u ishemijskom stanju arterijskim stezaljkama (TKS-1-40, BEAR Medic, Ibaraki, Japan) 30 odnosno 60 minuta, zatim su mišićni sloj i facija zatvoreni upotrebom upijajućeg konca. Osim toga, kontrolni miševi koji su podvrgnuti lažnoj operaciji podvrgnuti su otvorenoj operaciji bez stezaljki. Nakon toga, svi miševi su eutanazirani inhalacijom prekomjerne doze izoflurana (Escain, Pfizer Japan Inc., Tokyo, Japan) kako bi se izvršilo prikupljanje uzoraka. Thebubregauklonjeni su 24 sata nakon replikacije ishemije. Model nefropatije izazvane adriamicinom (ADR): model nefropatije: BALB/c miševima u dobi od osam tjedana primijenjen je ili ADR (FUJIFILM Wako Pure Chemical Co., Ltd., Osaka, Japan) (10 mg/kg) ili fiziološka otopina (skupina nositelja ) putem repne vene za procjenu njihovogbubrežni poremećajhistološki 14 dana nakon primjene.
HistologijaBubrezi miševa su fiksirani s 4 posto paraformaldehida (PFA) na 4 stupnja preko noći.Bubregblokovi su izrezani na 2 µm (za bojanje periodičnom kiselinom po Schiffu (PAS)) i 4 µm (za bojenje Picro-Sirius Red). Zabubrežnicjevasto mjerenje visine, strane korteksaBubregsekcije su nasumično fotografirane u četiri različita prikaza (×100). Dva neovisna istraživača slijepo su mjerilabubrežnicjevastu visinu u svim prikazima kako biste izračunali srednju visinu svakog subjekta. Za subjekte s neujednačenom visinom tubula odabrana su mjerenja od dva do pet mjesta po tubulu kako bi se dobila srednja vrijednost (slika 1A). Približno 700 mjerenja cjevaste visine dobiveno je po subjektu korištenjem gore spomenutog postupka za izračunavanje srednje vrijednosti za svaki subjekt. Za bojenje Sirius crvenim stakalca su deparafinizirana i bojena 1 sat sa Sirius crvenim u zasićenoj vodenoj otopini pikrinske kiseline i isprana 0,5 postotnom octenom kiselinom. Kako bi se ocijenila područja fibrilizacije koristeći Sirius crveno bojenje, ciljna područja su nasumično fotografirana u osam pogleda (×100), a pozitivna područja su kvantificirana pomoću ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) kako bi se izračunala njihova stopa popunjenosti s obzirom na ukupnu površinu. Glomeruli obojeni Sirius crvenim i krvne žile isključeni su iz izračuna.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE INFEKCIJE
Imunokemijsko bojenjeSekcije bubrega (5 µm) su deparafinizirane i podvrgnute ponovnom pronalasku antigena u citratnom puferu, na 121 stupanj tijekom 15 minuta. nakon ispiranja s Tris-puferiranom fiziološkom otopinom (TBS),Bubregrezovi su zapečaćeni 0.3 posto vodikovim peroksidom/metanolom 20 minuta, a zatim inkubirani preko noći na 4 stupnja s anti-NGAL antitijelima (Abcam, Cambridge, UK). Sekcije su isprane s TBS i zatim inkubirane sa sekundarnim antitijelima (Histofine SimpleStain MAX PO (Zec), Nichirei Biosciences Inc., Tokio, Japan) 30 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s TBS, rezovi su inkubirani s 3,3'-diaminobenzidinom (DAB) (Wako Pure Chemical Industries Ltd., Osaka, Japan) i hematoksilinom na sobnoj temperaturi. Za ocjenjivanje tubularnog poremećaja putem imunokemijskog bojenja korištenjem anti-NGAL antitijela, uzorci tkiva su nasumično fotografirani u osam pogleda (×100), a područja DAB bojenja su kvantificirana korištenjem ImageJ kako bi se izračunala njihova stopa popunjenosti u odnosu na ukupnu površinu.
StatistikaPodaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija. Studentov t-test korišten je za testiranje značajnih razlika između dviju skupina, a Bonferronijev multigrupni test korišten je za testiranje više skupina. P-vrijednost<0.05 was="" statistically="" significant.="" bonferroni's="" multigroup="" test="" was="" carried="" out="" using="" graphpad="" prism="" 5="" software="" (mdf,="" tokyo,="">
REZULTATI Kao što je gore spomenuto, kvantifikacija intersticijskih fibroznih područja korištenjem Sirius crvenog bojenja trebala bi biti standardna metoda procjene za tubularne poremećaje u bolesnika sbolest bubregaili ubolest bubregamodeli. Stoga smo za kvantifikaciju tubularnog poremećaja i intersticijske fibroze korištenjem mišjeg modela CKD-a upotrijebili FVB-Tns2nph mutant miša (FVB-nph), koji je životinjski model CKD-a koji pokazuje mnoge simptome humane CKD-a koji postupno napreduje tijekom duljeg razdoblja , uključujući genetski početak glomeruloskleroze od rođenja, fibrilizaciju tubulointersticija,bubrežnianemija, izatajenje bubrega[17, 21, 22]. FVB-nph miš reproducira tipične simptome uočene kod napredovanja CKD kod ljudi. U ovoj smo studiji uveli mutaciju nph u FVB linije osjetljive na nefropatiju. Skupina FVB-nph pokazala je više tubularnog spljoštenja nego skupina WT, na temelju pogoršanja fibrilizacije intersticija ububrežnitubule (slika 1B–D). Linearna regresijska analiza pokazala je značajnu suprotnu korelaciju između visine tubula i stupnja intersticijske fibroze (R2=0.7086: P=0.0023) (Slika 1E).
Slika 1. (A) Mjerenje visine tubularnih epitelnih stanica. Crvene trake označavaju visinu tubula. (B) Reprezentativne slike bojenja periodičnom kiselinom po Schiffu (PAS) i slike obojene Sirius crvenom 10-tjednom starom FVB-Tns2WT (FVB-WT) (lijeva ploča) i FVB-Tns2nph mutantnog miša (FVB- nph) (desna ploča) dijelovi bubrega. Gornja ploča predstavlja slike obojene PAS-om, a donja ploča predstavlja slike obojene Sirius crvenom bojom. Mjerne trake: 50 µm. (C) Grafikon koji uspoređuje tubularne visine FVB-WT i FVB-nph. (D) Grafikon koji uspoređuje površinu fibroze u odnosu na ukupnu površinu. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija; P-vrijednosti su izračunate Studentovim t-testom. (E) Dijagrami raspršenosti s linearnom regresijom pokazuju analizu korelacije između visine tubula i stupnja ocjene fibroze. Linija linearne regresije pokazala je inverznu korelaciju između visine tubula i površine fibroze. Prikazane su vrijednosti koeficijenata korelacije R i P. Crni krugovi označavaju FVB-WT (n=5) skupinu, a crni kvadrati označavaju FVB-nph (n=5) skupinu. **str<0.01,><>
Ozljede bubrežnih tubula i visine tubula mjereni su pomoću akutnogozljeda bubrega(AKI) model, odnosno IR model [5, 12, 18]. Iako se intersticijska fibroza ne bi trebala promatrati u većini slučajeva AKI, uključujućibubrežniishemijski poremećaj, povećana ekspresija NGAL u stanicama bubrežnih tubula [7]. Osim toga, poznato je da je NGAL uključen u progresiju AKI u CKD i predložen je kao vitalni čimbenik u oba. Stoga smo pokazali da ekspresija NGAL korelira sbubrežnicjevasta visina pomoću IR modela. Zabilježeno je da je vrijeme ishemije često postavljeno na 20 do 60 minuta i da se ozljeda tubula pogoršava s povećanjem vremena ishemije [4, 5, 12, 18]. U ovoj studiji miševi su bili podvrgnuti ishemiji 30 minuta kao slaba tubularna ozljeda i 60 minuta kao jaka tubularna ozljeda. Povećana ekspresija NGAL i spljoštenje tubula primijećeni su u skupinama od 30 i 60 minuta. Povećanje ekspresije NGAL-a i izravnavanje tubula bilo je izraženije u skupini koja je primala 60 minuta jer je pretrpjela veću ozljedu (Slika 2A-C). Smanjenje visine tubula i povećanje ekspresije NGAL dokazano je na temelju povećanja trajanja ishemijskog stanja (Slika 2A–C). Linearna regresijska analiza rezultata također je pokazala negativnu korelaciju izmeđububrežnitubularna visina i ekspresija NGAL (R2=0.6266, P=0.011) (Sl. 2D).
Model ADR nefropatije često se koristi ubolest bubregaistraživanja jer uzrokuje ozljede glomerula i manje tubularne poremećaje s visokom razinom ponovljivosti korištenjem jedne doze ADR-a [13]. Mišji model ADR nefropatije korišten je u ovoj studiji za procjenububrežnitubularne ozljede i visine. Model glodavaca nefropatije izazvane nuspojavama često se koristi za objašnjenje mehanizama fokalne glomeruloskleroze (FSGS) i CKD. Jedna doza ADR-a može uzrokovati gubitak podocita, perzistentnu proteinuriju i FSGS. Među različitim sojevima miševa, BALB/c je osjetljiv na neželjene reakcije, dok je C57BL/6 (B6) otporan. Stoga smo koristili BALB/c u ovom ADR eksperimentu. Kod ADR nefropatije,bubrežniintersticijska fibroza, koja je tipičan nalaz KBB-a
Slika 2. (A) Reprezentativne slike bojenja Periodnom kiselinom po Schiffu (PAS) i imunokemijski obojene slike s anti-neutrofilnim želatinaza-povezanim lipokalinom (NGAL) protutijelima lažnog (lijeva ploča), 30 min (srednja ploča) i 60 min (desna ploča) bubrežni dijelovi. Gornja ploča predstavlja sliku obojenu PAS-om, a donja slika predstavlja imunokemijski obojenu sliku s anti-NGAL protutijelima. Mjerne trake: 50 µm. (B) Grafikon koji uspoređuje cjevaste visine lažnog uzorka, 30 min i 60 min. (C) Grafikon koji uspoređuje NGAL-pozitivno područje u odnosu na ukupnu površinu lažnog uzorka, 30 min i 60 min. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija; P-vrijednosti izračunate su Bonferronijevim multigrupnim testom. (D) Dijagrami raspršenosti s linearnom regresijom pokazuju analizu korelacije između visine tubula i NGAL-pozitivnog područja. Linija linearne regresije pokazuje inverznu korelaciju između visine tubula i NGAL-pozitivnih područja. Prikazane su vrijednosti koeficijenata korelacije R i P. Crni krugovi označavaju lažnu skupinu (n=3), crni kvadrati označavaju 30-minutnu skupinu (n=3), a crni trokuti označavaju 60-minutnu skupinu (n=3). *P<0.05,><>
izraženo 4 tjedna nakon primjene nuspojava, dok se srednje stanje između AKI i kronične bubrežne bolesti opaža nakon manje od 4 tjedna [24]. U ovoj studiji procijenili smo tubularno spljoštenje kod miševa 2 tjedna nakon liječenja neželjenim reakcijama, što je srednje stanje. Razinabubrežniozljeda tubula procijenjena je mjerenjem ekspresije NGAL, koja se povećava u stanicama oštećenih bubrežnih tubula [6]. Izmjerene su visine bubrežnih tubula i provedeno je imunokemijsko bojenje pomoću anti-NGAL protutijela na bubrežnim tkivima skupina s ADR-om i nosačem. Nije otkrivena pozitivna slika Sirius crvenog bojenja (podaci nisu prikazani). Spljoštenje tubula pojačano je primjenom ADR-a i dokazano je evidentno povećanje ekspresije NGAL (Slika 3A–C). Osim toga, linearna regresijska analiza visina tubula i razina ekspresije NGAL pokazala je suprotnu korelaciju (R2=0.522, P=0.043) (Slika 3D).
RASPRAVA
Snažne korelacije između spljoštenja bubrežnih tubula i intersticijske fibroze u teškim modelima CKD-a i između tubularnog spljoštenja i tubularnog poremećaja u ADR i IR modelima prikazane su u ovoj studiji. Postoje različiti mehanizmi kojima se glomerularne lezije šire u intersticijsku fibrozu kroz tubularne poremećaje. Studija je objavila dabubrežnioštećenje tubula (spljoštenje) izaziva intersticijsku fibrozu, proizvodnju izvanstaničnog matriksa (ECM) i upalnu staničnu infiltraciju. Jaka korelacija izmeđububrežnispljoštenost tubula i intersticijska fibrilizacija bubrežnih tubula uočena u ovoj studiji vjerojatno odgovara prethodno navedenoj uzročnoj povezanosti; tj.bubrežnitubularna oštećenja uzrokuju fibrozu, proizvodnju ECM-a i infiltraciju stanica. Drugo istraživanje također je pokazalo korelaciju između pojačane ekspresije NGAL i atrofije bubrežnih tubula (još jedna stavka ocjene oštećenja bubrežnog poremećaja), s rezultatima sličnim rezultatu spljoštenja bubrežnih tubula dobivenom u ovoj studiji [26]. U ovoj studiji samo muški
Slika 3. (A) Reprezentativne slike bojanja periodičnom kiselinom po Schiffu (PAS) i imunokemijski obojene slike s anti-neutrofilnom želatinazom povezanom lipokalinom (NGAL) protutijelom nosača (lijeva ploča) i adriamicina (ADR) (desna ploča) bubrežni dijelovi. Gornja ploča predstavlja sliku obojenu PAS-om, a donja slika predstavlja imunokemijski obojenu sliku s anti-NGAL protutijelima. Mjerne trake: 50 µm. (B) Grafikon usporedbe cjevastih visina vozila i ADR-a. (C) Grafikon koji uspoređuje NGAL-pozitivnu površinu u odnosu na ukupnu površinu. Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna devijacija; P-vrijednosti izračunate su Bonferronijevim multigrupnim testom. (D) Dijagrami raspršenosti s linearnom regresijom pokazuju analizu korelacije između visine tubula i NGAL-pozitivnog područja. Linija linearne regresije pokazuje inverznu korelaciju između visine tubula i NGAL-pozitivnih područja. Prikazane su vrijednosti koeficijenata korelacije R i P. Crni krugovi označavaju skupinu vozila (n=3), a crni kvadrati označavaju ADR skupinu (n=5). *P<0.05,><>
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA
korišteni su miševi, ali se spljoštenje tubula kod nefropatije može uočiti u oba spola. Međutim, zabilježeno je da su ženke miševa otporne na IR i druge modele nefropatije, pa bi trebalo razmotriti korištenje mužjaka ili ženki miševa ovisno o korištenom modelu nefropatije [8]. Također je bilo teško procijeniti tubularno spljoštenje u meduli, jer tubuli u meduli u vrijeme neozljeđivanja imaju tanke tubularne stanice, iako je procijenjena visina tubula u korteksu. Stoga bi se u budućnosti trebala razviti jednostavna metoda za procjenu tubularne ozljede u meduli (podaci nisu prikazani). Stručnjaci poput patologa ili kliničara općenito provode procjenu razine atrofije, ekspanzije ili mutacije bubrežnih tubula kako bi ocijenili histologiju bubrežnih tubula; međutim, mjerenje visine bubrežnih tubula radi ocjene razine spljoštenosti može se izvesti mnogo lakše u usporedbi s drugim metodama. To je također korisno jer se tehnologije koje brzo napreduju, kao što su umjetna inteligencija i obrada slike, mogu lako primijeniti; stoga bi u budućnosti trebala biti moguća preciznija, objektivnija i kvantitativnija dijagnoza. Kako bi se potvrdilo može li spljoštenost bubrežnih tubula biti fenomen koji se univerzalno promatra kao indeks zloćudnosti CKD-a kod različitih vrsta, potrebno je provesti daljnja istraživanja koristeći modele CKD-a drugih glodavaca, kućnih ljubimaca kao što su psi i mačke ili uzoraka prikupljenih od ljudi.