Membrana ljuske jajeta ublažava hiperurikemiju povećanjem izlučivanja urata kod štakora kojima je ubrizgan kalijev oksonat
Mar 16, 2022
Sažetak:Hiperurikemija je primarni uzrok gihtnog artritisa i drugih metaboličkih poremećaja. Membrana od ljuske jajeta (EM) je učinkovit i siguran dodatak za liječenje boli i ukočenosti povezanih s osteoartritisom. Međutim, učinak EM na hiperurikemiju nije jasan. Ova studija utvrđuje učinke EM-a na hiperurikemiju ubrizganu kalijevim oksonatom. Mjere se mokraćna kiselina, kreatinin, koncentracija dušika ureje u krvi u serumu i aktivnost ksantin oksidaze u jetri. Razina proteina odbubrežni transporter urata 1 (URAT1), transporter organskih aniona 1 (OAT1), transporter glukoze 9 (GLUT9) i kazetni transporter koji veže ATP G2 (ABCG2) ububregodređuju se sabubrežnihistopatologija. Rezultati pokazuju da EM smanjuje razinu mokraćne kiseline u serumu i povećava razinu mokraćne kiseline u mokraći kod hiperurikemijskih štakora. Štoviše, EM smanjuje regulacijububrežniEkspresija proteina URAT1, pojačava OAT1 i ABCG2, ali ne mijenja ekspresiju GLUT9. Dodatno, EM ne mijenja aktivnost ksantin oksidaze u jetri ili serumu. EM također smanjuje unos mokraćne kiseline u jajne stanice koje eksprimiraju hURAT1. Konačno, EM se značajno smanjujebubrežniupale i razine interleukina-1 u serumu. Ovi nalazi sugeriraju da EM pokazuje antihiperurikemijske učinke promicanjem bubrežniizlučivanje urata i reguliranjebubrežnitransporteri urata. Stoga EM može biti koristan u prevenciji i liječenju gihta i hiperurikemije.
Ključne riječi:Bubreg; bubrežni; giht; transporter urata 1; mokraćne kiseline; kalijev oksonat
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREŽNU DIJALIZU
Membrana ljuske jajeta (EM) je film pričvršćen za unutrašnjost ljuske jajeta i jedna je od komponenti jaja, glavne hrane za ljudsko zdravlje. Omogućuje prodor kisika i blokira invaziju mikroorganizama. EM se sastoji od organskog materijala (70 posto), neorganskog materijala (10 posto) i vode (20 posto), a 80 posto organskog materijala čine proteini. Osim toga, sastoji se od 2,3 posto masti i 3,4 posto ugljikohidrata [1,2]. Među sastojcima jaja, žumanjak i bjelanjak koriste se kao sirovine za hranu, a ljuske jaja su sirovina za dodatke kalcija za formiranje i održavanje zuba i kostiju [3]. Međutim, EM se klasificira kao otpad i ne koristi se često. Nedavno su prijavljeni antiartritični učinci EM-a u životinjskom modelu induciranom lipopolisaharidima iu kliničkim studijama na ljudima [4,5]. EM je također poboljšao upalu kod štakora s reumatoidnim artritisom izazvanim kolagenom [6]. Osim toga, EM je pokazao antiartritično djelovanje kod štakora s osteoartritisom izazvanim mononatrijevim jodoacetatom [7]. Mononatrijev jodoacetat je induktor gihtnog artritisa, a nakupljanje kristala mononatrijevog urata u zglobovima može rezultirati upalom, što dovodi do gihtnog artritisa. Hiperurikemija može uzrokovati stvaranje kristala mokraćne kiseline (ili urata), a taloženje tih kristala u zglobovima uzrokuje giht, oblik artritisa koji može biti vrlo bolan. EM je izvor kolagena, kondroitin sulfata, glukozamina, hijaluronske kiseline i kalcija, koji su svi opsežno ispitivani za liječenje osteoartritisa [8]. Rezultati ovih studija pokazuju potencijalnu korisnost EM-a za prevenciju i liječenje gihta i hiperurikemije.
Hiperurikemija je glavni čimbenik rizika za napredovanje inzulinske rezistencije, dijabetesa, pretilosti, hipertenzije, ateroskleroze i kardiovaskularnih bolesti, kao i gihtnog artritisa [9-11]. Odgovarajuća kontrola hiperurikemije doprinosi prevenciji i liječenju ovih bolesti. Hiperurikemija se javlja s povećanim stvaranjem mokraćne kiseline ili poremećenim izlučivanjem mokraćne kiseline [12]. Smanjenjem proizvodnje i povećanjem izlučivanja mokraćne kiseline, liječenje snižavanjem urata može igrati ključnu ulogu u kontroli hiperurikemije i poremećaja povezanih s hiperuricemijom [13]. Često korišteni lijekovi za snižavanje urata poput alopurinola i febuksostata, inhibitora sinteze mokraćne kiseline, naširoko se koriste za liječenje gihta; međutim, ovi inhibitori ksantin oksidaze (XO) mogu imati teške nuspojave, kao što je sindrom preosjetljivosti na alopurinol [14-16]. Benzbromaron je urikozurik koji se posljednjih 30 godina koristi za kontrolu gihta, ali je zbog teških hepatotoksičnih nuspojava povučen s europskog tržišta [17]. Prema tome, postoji potreba za razvojem lijekova dobivenih iz prirodnih proizvoda bez toksičnosti koji su učinkovitiji za prevenciju i dugotrajno liječenje poremećaja povezanih s hiperuricemijom. Stoga ova studija istražuje štiti li EM od hiperurikemije. Ova studija procjenjuje antihiperurikemijsku aktivnost EM-a u štakora s hiperurikemijom izazvanom kalijevim oksonatom (PO). PO je selektivno kompetitivni inhibitor urikaze, koji se široko koristi za inhibiciju učinka jetrene urikaze, što dovodi do hiperurikemije [18,19]. Stoga su štakori tretirani PO praktičan životinjski model ne samo za istraživanje patologije hiperurikemije, već i za procjenu potencijalnih lijekova [20]. Kako bi se ispitala aktivnost i temeljni mehanizmi EM na hiperurikemiju, dvojni mehanizmi EM putem inhibicije proizvodnje mokraćne kiseline i pojačanog izlučivanja mokraćne kiseline ispitani su kod životinja s hiperuricemijom.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
2. Materijali i metode
2.1. ŽivotinjeMuški štakori Sprague Dawley stari sedam tjedana kupljeni su od Orient Bio (Seongnam, Koreja). Prilagođene su u klimatiziranu prostoriju za životinje na 22 ± 1 ◦C s 50 posto ± 10 posto vlage. Štakori su imali pristup standardnoj prehrani i vodi ad libitum. Studije na životinjama odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Korejskog instituta za istočnjačku medicinu, a pokusi su provedeni u skladu sa smjernicama odbora (kod odobrenja. 19-024).
2.2. Indukcija hiperurikemije i EM primjenaEM koji se koristio u ovoj studiji osigurao je JU-HWAN BIO CELL Co., Ltd. (Cheonan, Koreja) kao osušeni prah. Da bi se izazvala hiperurikemija, životinjama je intraperitonealno ubrizgano 150 mg/kg PO (inhibitor urikaze). Korišteni su sljedeći lijekovi pozitivne kontrole: alopurinol (Sigma, St. Louis, MO, SAD) i benzbromaron (TCI, Tokio, Japan). Prije ubrizgavanja, PO je otopljen u 0.5 posto karboksimetil celuloze (CMC, Sigma, SAD) i 0.1 M natrijevog acetata (Sigma, SAD). Kako bi se ispitala antihiperurikemijska aktivnost EM (Eksperiment 1, preliminarna akutna studija), štakori su podijeljeni u pet skupina (5 životinja po skupini): normalna skupina; PO-injektirana skupina hiperurikemije (PO); skupina koja je primala PO plus 10 mg/kg alopurinola; PO plus 100 mg/kg EM-administrirana skupina; i skupina PO plus 200 mg/kg EM-a. U Eksperimentu 1, uzorci su otopljeni u CMC i davani oralno (jednom) štakorima 1 sat nakon PO injekcije tijekom 1 dana. Kako bi se istražile aktivnosti ovisne o dozi i molekularni mehanizmi EM (Eksperiment 2), štakori su podijeljeni u 7 skupina (svaka n=5): normalna skupina (N); PO-injektirana skupina hiperurikemije; skupina koja je primala PO plus 10 mg/kg alopurinola; skupina kojoj se daje PO plus 50 mg/kg benzbromarona; PO plus 50 mg/kg EM-administrirana skupina; PO plus 100 mg/kg EM-administrirana skupina; i skupina PO plus 200 mg/kg EM-a. Uzorci su otopljeni u 0,5 postotnoj otopini CMC-a i davani oralno (svaki dan) štakorima 1 sat nakon PO injekcije tijekom 5 dana.
2.3. Prikupljanje uzoraka krvi, urina i tkivaKrv je sakupljena 2 sata nakon primjene lijeka, a urin je također sakupljen nakon 2 sata, korištenjem metaboličkog kaveza nakon obrade uzorka. Nakon prikupljanja krvi i urina, tkiva(bubregi jetre) uzorci su pažljivo podijeljeni i sačuvani na 80 ◦C za daljnja ispitivanja. Serum je odvojen centrifugiranjem (2000×g, 15 min, 4 ◦C). Uzorci seruma i urina zatim su korišteni za biokemijsku analizu.
2.4. Analiza koncentracije mokraćne kiseline u serumu i urinuKoncentracije mokraćne kiseline u serumu i urinu određene su pomoću komercijalnog kompleta za analizu mokraćne kiseline (Biovision, Milpitas, CA, SAD) prema uputama proizvođača.
2.5. Mjerenje razine proinflamatornih citokina u serumuKoncentracije interleukina (IL)-1 u serumu mjerene su korištenjem kita štakorskog IL-1 enzimskog imunoanalize (ELISA) (R&D Systems, Minneapolis, MN, SAD).
2.6. In vitro aktivnost ksantin oksidaze iz jetre i serumaAktivnost XO u jetrenom tkivu i serumu određena je pomoću kompleta za ispitivanje aktivnosti XO prema protokolima proizvođača (Sigma, SAD). Aktivnost XO mjerena je čitačem mikropločica Spectra Max M3 (Molecular Devices, San Jose, CA, SAD) koristeći prethodno objavljene protokole [21]. Enzimska reakcija je pokrenuta dodatkom 0.5 mM ksantina kao supstrata, a koncentracija mokraćne kiseline je mjerena svake minute tijekom 5 minuta. Kao referenca korišten je XO inhibitor alopurinol. Aktivnost XO jetre normalizirana je ukupnom razinom proteina.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE INFEKCIJE
2.7. Histološki pregled bubregaBubrežna tkiva su uklonjena, odmah fiksirana 1 dan u formalinu, a zatim uklopljena u parafin. Svaki uzorak je izrezan na 6 µm debljine, a rezovi su obojeni hematoksilinom i eozinom reagensom. Obojeni dijelovi su zatim vizualizirani pod mikroskopom.
2.8. Western Blot analizaBubregtkiva su homogenizirana u pro-prep otopini za ekstrakciju (Intron, Seul, Koreja) i zatim centrifugirana (13,000× g, 4 ◦C) 15 minuta. Supernatant je korišten za Western blotting analizu ciljanih proteina. Ukupne razine proteina određene su DC testom proteina s goveđim serumskim albuminom (Bio-Rad, Hercules, CA, SAD). Primarna antitijela uključivala su -aktin (Santa Cruz, Dallas, TX, SAD), transporter glukoze 9 (GLUT9, MyBioSource, San Diego, CA, SAD), transporter urata 1 (URAT1; MyBioSource, San Diego, CA, SAD) i transporter organskih aniona 1 (OAT1; MyBioSource, San Diego, CA, SAD). Trake s membrane vizualizirane su ECL reagensom za detekciju pomoću ImageQuant LAS 4000 (GE Healthcare Life Sciences, Seul, Koreja). Gustoća iz dobivenih slika određena je pomoću softvera Image J1.49 NIH (Bethesda, MD, SAD). Vizualizirane ciljne razine proteina normalizirane su na -aktin. Ekspresije transportera G2 kazete koja veže ATP (ABCG2) dobivene su korištenjem štakorskog ABCG2 ELISA kita (MyBioSource) i normalizirane ukupnim razinama proteina.
2.9. Mjerenje unosa urata pomoću UART1-ekspresije oocitaOociti Xenopusa koji eksprimiraju hURAT{{0}} konstruirani su kako je prethodno opisano [20]. Inhibitor URAT1 benzbromaron (TCI, Tokio, Japan) tretiran je kao referenca. Oociti su inkubirani u reakcijskom puferu s Dulbeccovom fosfatnom puferiranom fiziološkom otopinom (DPBS; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) i otopinom ND (pH 7,4; 5 mM 4-(2- Hidroksietil)) piperazin-1-etan-sulfonska kiselina pufer, 2 mM KCl, 1 mM magnezijev klorid, 1,8 mM kalcijev klorid i 96 mM natrijev klorid), s 1 mM pirazin karboksilne kiseline (Sigma-Aldrich, St. Louis , MO, SAD) na 37 ◦C. Oociti su dalje inkubirani u otopini koja sadrži različite koncentracije EM (1, 10 i 100 µg/mL) s 50 µM [14C] mokraćne kiseline (Moravek Biochemicals, Brea, CA, SAD) na 37 ◦C. Nakon 60 minuta, unos mokraćne kiseline je zaustavljen dodatkom hladnog DPBS-a. Nakon zaustavljanja, oocite su otopljene u otopini 0,1 N natrijevog hidroksida i 10 posto natrijevog dodecil sulfata, a radioaktivnost je izmjerena tekućinskom scintilacijom.
2.10. StatistikaSvi podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± standardna pogreška srednje vrijednosti. Značajne razlike statistički su procijenjene jednosmjernom analizom varijance praćenom Dunnettovim testom za post hoc analizu korištenjem softvera GraphPad Prism 7.05. Razlika se smatrala statistički značajnom kada je p-vrijednost manja od 0,05.
3. Rezultati
3.1. Učinci membrane ljuske jajeta na izlučivanje mokraćne kiseline u serumu,Jedna PO injekcija tijekom 1 dana značajno je povećala razine mokraćne kiseline u serumu kod hiperurikemijskih štakora kojima je ubrizgana PO injekcija u usporedbi s onima kod normalnih štakora (Slika 1). U međuvremenu, EM od 100 i 200 mg/kg i alopurinol (pozitivna kontrola) učinkovito su smanjili serumsku mokraćnu kiselinu u štakora s PO-injektiranom hiperurikemijom. Stoga su provedene sljedeće studije kako bi se identificirale aktivnosti i mehanizmi EM ovisni o dozi.
3.2. Učinci membrane ljuske jajeta na razine mokraćne kiseline u serumu i urinu,Injekcija APO tijekom 5 dana značajno je povisila razine mokraćne kiseline u serumu u PO skupini u usporedbi s onima u normalnoj skupini (Slika 2a). Liječenje EM-om od 100 i 200 mg/kg, kao i alopurinolom i benzbromaronom, značajno je smanjilo razinu mokraćne kiseline u serumu u PO skupini. Osim toga, ocijenitibubrežna funkcijamjerene su koncentracije kreatinina i dušika uree u krvi (BUN). Koncentracije kreatinina u serumu nisu bile različite među skupinama (Slika 2b). Koncentracije BUN u serumu bile su povišene u PO skupini, ali su se te razine smanjile u skupini EM 200 mg/kg i skupini pozitivne kontrole (alopurinol i benzbromaron) (Slika 2c).
Kako bi se procijenio učinak EM na izlučivanje mokraćne kiseline, ispitane su razine mokraćne kiseline u mokraći. Skupina PO imala je značajno smanjene razine mokraćne kiseline u mokraći, koje su se povećale primjenom EM (100 i 200 mg/kg) i benzbromarona (Slika 2d). Ovi podaci pokazuju da EM može povećati ekstrakciju urata iz bubrega kako bi se smanjile razine mokraćne kiseline u serumu kod štakora s hiperurikemijom.
3.3. Učinci membrane ljuske jajeta na upalu bubregaUočena je blaga tubularna dilatacija, vakuolarna degeneracija tubularnih epitelnih stanica, oticanje i infiltracija upalnih stanica.bubreghiperurikemijskih štakora s PO injekcijom (Slika 3a). Međutim, EM ih je učinkovito poboljšaobubrežnihistopatološke promjene kod hiperurikemijskih štakora. Nadalje, štakori s hiperurikemijom pokazali su povećane serumske razine proupalnog citokina IL-1 (Slika 3b). EM u svim koncentracijama značajno je smanjio serumske razine kod hiperurikemijskih štakora. Primjena benzbromarona povećala je razine IL-1 u serumu više od hiperurikemijskih štakora kojima je ubrizgan PO, iako ne značajno, i to je vjerojatno nuspojava ovog lijeka. Ovi rezultati sugeriraju da se EM učinkovito poboljšaobubregupala i funkcija kod hiperurikemijskih štakora.
3.34. Učinci membrane ljuske jajeta na XO aktivnost
XO u jetri potiče proizvodnju mokraćne kiseline. Dakle, da bi se definirao mehanizam inhibitornog učinka EM na hiperurikemiju, procijenjena je aktivnost XO u serumu i jetri, aktivnost XO u jetri bila je značajno povećana u skupini PO (Slika 4a,b). Inhibitor XO, alopurinol, značajno je smanjio aktivnost XO u serumu i jetri. Međutim, EM u svim dozama nije promijenio aktivnost XO. Ovi podaci pokazuju da EM ne inhibira aktivnost XO i ne smanjuje proizvodnju mokraćne kiseline.
3.5. Učinci membrane ljuske jajeta na izlučivanje urataZa procjenu učinka EM na izlučivanje urata, ekspresija nekolikobubrežni transporterije ispitan. EM od 100 i 200 ug/mL i benzbromaron značajno su snizili razine URAT1 proteina ububreg(Slika 5a,b). Međutim, EM nije promijenio razine proteina GLUT9 (Slika 5c). EM od 200 ug/mL povećao je razine proteina OAT1, a primjena EM u svim koncentracijama povećala je razine ABCG2 (Slika 5d,e).
3.6. Učinak EM na in vitro unos URAT1 u oociteOsim toga, potvrđen je učinak EM-a na in vitro sustav unosa urata. Tretman EM-om od 1, 10 i 100 ug/mL pokazao je snažnu inhibiciju unosa mokraćne kiseline in vitro hURAT1-pretjerano izraženim oocitima (Slika 6). Ovi podaci pokazuju da EM regulira ekspresiju transportera urata kako bi se povećalo izlučivanje urata.
Rasprava
Kod ljudi, bubrezi igraju važnu ulogu u homeostazi mokraćne kiseline, jer se više od 70 posto izlučivanja uratabubrežni,dok se preostalih 30 posto izlučuje stolicom iz crijeva [22,23]. Međutim, izlučivanje urata može biti oslabljenobubrežniporemećaja, što dovodi do hiperurikemije. Izlučivanje mokraćne kiseline oslanja se na prijenosne proteine u proksimalnim tubulimabubregza kontrolu izlučivanja mokraćne kiseline u krvi i filtratu [24].Bubrežnatransporteri urata URAT1, smješteni na luminalnoj membrani, i GLUT9/ na apikalnoj membranibubregproksimalne tubule, čine primarni put reapsorpcije urata ububreg[25,26]. OAT1, smješten u bazolateralnoj membrani proksimalnog tubula, i ABCG2, smješten na apikalnoj membrani, uglavnom su odgovorni za izlučivanje urata iz krvi u epitelne stanice [27]. Regulacija ovih prijenosnika urata smatra se glavnim terapeutskim ciljem za hiperurikemiju. U ovoj studiji, EM se učinkovito smanjiobubrežniRazine URAT1 kod hiperuremijskih štakora kojima je ubrizgan PO, iako se ekspresija proteina GLUT9 nije promijenila. Štoviše, ekspresija proteina OAT1 i ABCG2 bila je regulirana prema gore ububregnakon EM tretmana, čime se pokazuje urikozurički učinak. Ova je studija potvrdila inhibitornu aktivnost EM-a na unos urata od strane URAT1 u jajnim stanicama s prekomjernom ekspresijom URAT1-i da je taj učinak bio učinkovit za poništavanje unosa urata potaknutog URATl-om. Ukupno se 90 posto reapsorpcije urata postiže putembubrežniURAT1 [28]. Kontrola ovihbubregprijenosnici urata EM tretmanom mogu pridonijeti promicanjububrežniizlučivanje mokraćne kiseline u štakora s hiperurikemijom. Kreatinin i urea dušik su biomarkeri abnormalnostibubregfunkcija, što ukazuje na sposobnostbubregza izlučivanje proteinskih metabolita [24]. Rezultati su pokazali da PO povećava serumsku koncentraciju mokraćne kiseline i BUNbubrežnidisfunkcija. Međutim, EM od 200 mg/kg preokrenuo je ovo povećanje s poboljšanjembubrežna funkcija. Enzim XO katalizira oksidaciju hipoksantina ili ksantina u mokraćnu kiselinu [28]. Inhibitori XO, kao što je alopurinol, smanjuju koncentraciju mokraćne kiseline u serumu i prekomjernu proizvodnju reaktivnih kisikovih spojeva primarno povezanu s prekomjernom aktivnošću XO, što često uzrokuje oštećenje upalnih stanica na vaskularnom endotelu, pridonoseći razvoju metaboličkog sindroma i kardiovaskularnih poremećaja [29]. ]. Stoga, inhibicija prekomjerne aktivacije XO može biti terapeutski cilj za kontrolu štetnih učinaka viška mokraćne kiseline. Međutim, naša je studija pokazala da EM nije poništio aktivnost XO u serumu i jetri kod štakora s PO-induciranom hiperurikemijom.
Hiperurikemija može biti element rizika zabubregdisfunkcija [23]. U ovoj studiji,bubregdisfunkciju karakteriziraju povećane razine BUN i upalnih citokina IL-1p u serumu ibubrežniupala u hiperurikemijskih štakora. ovebubrežnidisfunkcije su oslabljene EM tretmanom, što ukazuje na poboljšanje bubrežne upale. Međutim, lijek benzbromaron povisio je razine IL-1p u serumu kod štakora s hiperurikemijom, a oštećenje bubrega prijavljeno je kao primarni štetni učinak urikozuričnih lijekova, uključujući benzbromaron i probenecid [30]. EM sadrži prirodni glukozamin, kondroitin sulfat, hijaluronsku kiselinu, kolagen, peptide i druge aminokiseline koje sadrže sumpor [8]. Prethodne studije su izvijestile da su glukozamin i kondroitin pokazali protuupalne i anti-osteoartritične učinke [31,32]. Hijaluronska kiselina pokazala je protuupalne i antihiperurikemijske učinke u životinjskim modelima induciranim kristalima mononatrijevog urata za akutni gihtični artritis i hiperurikemiju [33]. Rezultati ovih studija pokazuju potencijalnu korisnost ovih komponenti za sprječavanje i liječenje hiperurikemije. Međutim, naše istraživanje nije pokazalo koje komponente EM-a pojačavaju izlučivanje mokraćne kiseline. Učinci bioaktivnih komponenata izvedenih iz EM moraju se dalje istraživati. U ovoj smo studiji pokazali da hiperurikemija i inducirana POupala bubregaje inhibiran EM tretmanom. Stoga bi EM mogao biti obećavajući antihiperurikemijski agens. Pretpostavimo da je učinkovita doza EM kod štakora 100 mg/kg (maksimalna doza; 200 mg/kg). Na temelju površine tijela, ekvivalentna doza EM-a za ljude je 16,2 mg/kg (972 mg/dan kod odraslih). Iz ovih in vivo studija, preporučena dnevna doza EM-a u blagim stanjima je 486 mg ili 972 mg dnevno, a maksimalna doza je 1944 mg dnevno za teška stanja. Međutim, doza se može razlikovati ovisno o trajanju liječenja i dobi. Na temelju ovih rezultata, klinička studija EM-a na ljudima nastavit će se u bliskoj budućnosti.
