Ozljeda podocita kroz interakciju između Tlr8 i njegovog endogenog liganda MiR-21 u opstruiranom i njegovom kolateralnom bubregu

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche erektilna disfunkcija vezano za bubrege

Dok je kronična bubrežna bolest prevladavajuća kod odraslih, opstruktivna nefropatija (ON) zabilježena je i kod mladih i kod starih pacijenata. U ON-u, tubulointersticijske lezije (TIL) su naširoko istražene, ali su glomerularne lezije (GL) uglavnom zanemarene. Ovdje prikazujemo novi mehanizam na kojem se temelji razvoj GL u ON kod mladih i starih miševa. TIL se razvijaju ranije od GL zbog infiltracije upalnih stanica u tubulointersticiju, ali GL se razvijaju nakon aktivacije Toll-sličnog receptora 8 (Tlr8) iako nema upalnih stanica koje se infiltriraju u glomerul. Proteini TLR8 i interleukin 1 beta (IL1b) kolokaliziraju se s redukcijskim markerima funkcije podocita (PFM), što ukazuje na aktivaciju signalizacije TLR8 u ozlijeđenim podocitima. Nadalje, glomerularne i serumske razine miR-21, endogenog liganda za Tlr8, bile su više u ON mišjem modelu nego u lažnoj kontroli. Glomerularna ekspresija Tlr8 pozitivno korelira s miR-21 i nizvodno citokinima Il1b i Il6 i negativno korelira s PFM-ovima (Nphs1 i Synpo). Također pokazujemo kolokalizaciju proteina TLR8 i IL1b s redukcijskim PFM-ovima u opstruiranim izalogombubregamladih i starih miševa. Nadalje, rezultati in vitro studije otkrili su veću ekspresiju Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina u glomerulima iz opstruiranihbubreganakon tretmana miR- 21 mimikom nego u kontrolnoj skupini. U zaključku, prekomjerna ekspresija Tlr8 može poslužiti kao vjerojatan mehanizam u podlozi razvoja GL u ON kroz ozljedu podocita.

Ključne riječi: kronična bubrežna bolest,opstruktivna nefropatija, podocit, TLR8, opstruirani i kolateralni bubreg

UVOD

Kronična bolest bubrega (CKD), veliki javnozdravstveni problem, prevladava u 8 do 13 posto opće populacije (1). Čest je kod starijih osoba zbog starenja društva. Opstruktivna nefropatija (ON) je od velikog interesa za kliničare, budući da je prijavljena u bolesnika iz različitih dobnih skupina. ON je izlječiv i reverzibilan, za razliku od drugih KBB (2, 3). U djece se javlja kod jednog od 1500 mladih pojedinaca, a njegova prevalencija iznosi čak 1 posto – 5 posto u razvijenim zemljama (4, 5). U odraslih, prevalencija ON-a kreće se od 5 na 1000 do 5 na 10 000 pojedinaca. Nadalje, prevalencija kroničnog jednostranog ON-a je približno 0,5 posto, dok je prevalencija akutnog jednostranog i kroničnog obostranog ON-a približno 0,1 posto (4-7).

ON može dovesti do akutne ozljede bubrega ili kronične bubrežne bolesti, što uključuje progresivno smanjenje bubrežne funkcije i promjene u bubrežnim strukturama koje traju dulje od 3 mjeseca (8, 9). Unilateralna ureteralna opstrukcija (UUO) široko je korištena strategija za proučavanje kronične ON. ON u UUO bubrega karakteriziran je hipertrofijom, hidronefrozom, regrutiranjem upalnih stanica u intersticijskom području, smrću tubularnih stanica uslijed hipoksije i taloženjem kolagena u tubulointersticiju, nakon čega slijedi razvoj tubulointersticijske fifibroze (TF) (10).

TF je važna značajka završnog stadija bubrežne bolesti i glavna determinanta progresivnog oštećenja bubrega (11). TF je opsežno istražen u ON modelima, ali podaci koji se odnose na ozljede glomerula, osobito abnormalnosti krvno-urinske barijere (BUB), su rijetki (8, 9, 12). Nadalje, studije su istraživale tubulointersticijske lezije (TIL) u kolateralnom bubregu kod jednostranog ON-a, ali su glomerularne lezije (GL) uglavnom zanemarene (12). Nekoliko je izvješća otkrilo uključenost peritubularnih kapilara u progresiju TIL-a u eksperimentalnoj ON (13, 14). Međutim, glomerul i glomerularna kapilara ulijevaju se u tubularne segmente nefrona, odnosno peritubularne kapilare. Stoga predlažemo da glomerulonefritis također može utjecati na tubulointersticij. Naše prethodne studije istaknule su doprinos ozljede intrinzičnih stanica glomerula, uglavnom podocita, GL-u i kasnijem razvoju TIL-a u mišjem modelu autoimune bolesti zbog prekomjerne ekspresije različitih Toll-like receptora (TLR) (15-18).

Endotel glomerularnih kapilara i podociti važni su čuvari vrata koji čine BUB. Između ova dva epitela, podociti su kontinuirano izloženi signalima opasnosti, uključujući TLR ligande kao što su molekularni obrasci povezani s opasnošću (DAMP) ili molekularni obrasci povezani s patogenom (PAMP), zahvaljujući svojoj jedinstvenoj lokalizaciji u glomerulima (15). Stoga se smatra da interakcija između TLR-ova u podocitima i njihovih endogenih liganada doprinosi ozljedi podocita u neinfektivnim stanjima. U ovoj smo se studiji usredotočili na razvoj GL u opstruiranim i kolateralnim bubrezima mladih i starih miševa, jer se ON često nalazi i kod mladih i kod starijih ljudi. Pojasnili smo da je GL razvijen u ON zbog ozljede podocita prekomjernom ekspresijom Tlr8 u podocitima iz opstruiranih i kolateralnih bubrega mladih i starih miševa.

MATERIJALI I METODE

Etička izjava i smještaj pokusnih životinja Sve pokuse u kojima su se koristile laboratorijske životinje odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Fakulteta veterinarske medicine Sveučilišta Hokkaido (br. odobrenja 16- 0124). Autori su slijedili odobreni vodič za njegu i korištenje laboratorijskih životinja Sveučilišta Hokkaido, Fakulteta veterinarske medicine (odobren od strane Udruge za procjenu i akreditaciju Laboratory Animal Care International). Šest tjedana stari C57BL/6N miševi kupljeni su od Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japan) i držani u specifičnim uvjetima bez patogena u okruženju 1:1 svjetlo-tama. Pokusne su životinje dobivale ad libitum hranu i vodu za piće.

Eksperimentalni dizajn Koristili smo i mlade (9 tjedana) i stare (12 mjeseci) miševe. Miševi iz svake dobne skupine (n=4) bili su podvrgnuti ili lažnoj operaciji (kontrolna skupina) ili UUO (2, 7, 11 i 21 dan) kako bi se uspostavio ON-model bubrega, kao što je opisano u našoj prethodnoj studiji (13).

Priprema uzorka Miševi su duboko anestezirani mješavinom anestetičkih sredstava kao što je prethodno opisano (16) i eutanazirani dislokacijom cerviksa. Uzorci krvi su prikupljeni kroz femoralnu arteriju za analizu serumskih markera. I UUO i kolateralni bubrezi su sakupljeni i izrezani na tanke kriške. Reznice bubrega fiksirane su s 10 posto neutralnog puferskog formalina (NBF), 4 posto paraformaldehida (PFA) i 2,5 posto glutaraldehida (GTA) za histopatološke, imunohistokemijske i elektronske mikroskopske studije.

Imunohistokemija i imunofluorescencija NBF-fiksirani parafinski blokovi izrezani su na 2 mm debljine i obojeni periodnom kiselinom Schiff-hematoksilinom (PAS-H) kako bi se ispitala histopatologija bubrega. Imunodetekcija staničnih markera provedena je kao što je prethodno objavljeno (16) za B stanice (B220), T stanice (CD3), kapilarni endotel (CD31), IL1b, makrofage (Iba1), podocite (podocin i sinaptopodin) i TLR8. Uvjeti bojenja navedeni su u tablici 1.

Histoplanimetrijski PAS-H i imunološki obojeni presjeci bubrega pretvoreni su u virtualna stakalca pomoću Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japan). Pozitivne stanice su izbrojane iz nasumično odabranih 20 glomerula ili 20 žarišta iz tubulointersticija pri povećanju od 400x korištenjem softvera NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Slike 20 glomerula iz presjeka obojenih PAS-H također su snimljene pri 400x od svakog miša korištenjem sveobuhvatnog fluorescentnog mikroskopa BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japan). Glomerularno mezangijsko područje i veličina izmjereni su iz snimljenih slika pomoću BZ-X analizatora (Keyence).

Izolacija glomerula za ekstrakciju RNK i kulturu Glomeruli iz lažno operiranih i UUO bubrega izolirani su kako je prethodno opisano (16). Ukratko, miševi su duboko anestezirani i perfundirani kroz lijevu klijetku s 40 mL Hankove uravnotežene otopine soli (HBSS) koja sadrži Dynabeads (8 × 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD). Bubreg je izrezan

i nasjeckan na sitne komadiće. Stanice su zatim digestirane s kolagenazom A (1 mg/mL; Roche, Basel, Švicarska) i deoksiribonukleazom I (100 U/ml; Life Technologies) u HBSS na 37 stupnjeva tijekom 30 minuta. Suspenzija koja je sadržavala probavljeno tkivo lagano je protisnuta kroz 100- mm cjedilo za stanice (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, SAD) pomoću spljoštenog tučka. Rezultirajuća stanična suspenzija je centrifugirana na 200 x g tijekom 5 minuta, a stanični talog je resuspendiran u 2 ml HBSS. Glomeruli koji sadrže Dynabeads prikupljeni su pomoću koncentratora magnetskih čestica (Life Technologies) i korišteni za izolaciju RNA.

Reverzna transkripcija i PCR u stvarnom vremenuUkupna RNA izolirana je iz glomerula korištenjem RNeasy kompleta (Qiagen, Hilden, Njemačka). cDNA je sintetizirana iz ukupne RNA obrnutom transkripcijom pomoću enzima reverzne transkriptaze ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japan) i slučajnih dT početnica (Promega). cDNA je korištena u PCR-u u stvarnom vremenu s Brilliant III SYBR Green QPCR master mix i Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, SAD). Ekspresija glomerularnog gena normalizirana je na ekspresiju Actb. Korišteni parovi početnica prikazani su u tablici 2.

Obrnuta transkripcija i PCR u stvarnom vremenu temeljen na TaqManuUkupna RNA, uključujući mikroRNA (miRNA) u izoliranim glomerulima, izolirana je pomoću miRNeasy kompleta (Qiagen). Za reverznu transkripciju ukupne RNA prema uputama proizvođača (Applied Biosystems, Foster City, CA, SAD) korišteni su RT početnice specifične za miRNA matičnu petlju, reverzna transkriptaza, pufer za reverznu transkripciju, dNTP i inhibitor RNaze. PCR u stvarnom vremenu proveden je s dobivenom cDNA pomoću miR-21- specifičnih TaqMan početnica i specifičnih sondi (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) i Mx3000P (Agilent Technologies).

In vitro liječenje izoliranih glomerula mimikamaGlomeruli su izolirani iz lažno operiranih i UUObubreganakon 11 dana opstrukcije. Medij Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI-1640) (Fujifilm Wako, Japan) koji je sadržavao 300 glomerula raspoređen je u svaku jažicu 96-ploče s kulturom jažica (TPP, Trasadingen, Švicarska) i tretiran PBS-om, negativnom kontrolom i miR-21 mimikom (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Južna Koreja) na 1 pmol/µL tijekom 4 sata na 37 stupnjeva u 5 posto CO2. Ekspresija Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina mjerena je kao što je opisano u prethodnom odjeljku.

Skenirajuća elektronska mikroskopijaZa rutinsku skenirajuću elektronsku mikroskopiju (SEM), malabubreg kriškesu fiksirani s 2,5 posto GTA tijekom 4 sata i naknadno fiksirani s 1 posto osmij tetroksida tijekom 1 sata, nakon čega je uslijedio tretman s 1 posto taninske kiseline tijekom 1 sata. Uzorci su zatim fiksirani s 1 posto osmij tetroksida tijekom 1 sata i tretirani s 0.5 posto i 1 posto taninske kiseline tijekom 10 minuta, odnosno 1 sat.Bubregkriškesu dehidrirani s rastućim stupnjevima alkohola, prebačeni u 3-metil butil acetat i konačno osušeni s HCP-2 sušionikom kritične točke (Hitachi, Tokio, Japan). Uzorci su podvrgnuti ionskom raspršivanju i zatim ispitani pod S-4100 pretražnim elektronskim mikroskopom pri ubrzanom naponu od 12 kV.

Statistička analizaVrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna pogreška (se). Rezultati su statistički analizirani pomoću neparametrijskog Mann-Whitneyevog U-testa (P < 0.05).="" kruskal-wallisov="" test="" korišten="" je="" za="" usporedbu="" tri="" ili="" više="" populacija,="" a="" višestruke="" usporedbe="" provedene="" su="" korištenjem="" scheffeove="" metode="" nakon="" što="" su="" uočene="" značajne="" razlike="" (p="">< 0.05).="" korelacija="" između="" ova="" dva="" parametra="" analizirana="" je="" spearmanovim="" testom="" koeficijenta="" korelacije="" ranga="" (p=""><>

REZULTATI

TIL i GL u začepljenim bubrezima mladih miševaNajprije smo ispitali TIL i GL u lažno operiranim i UUO bubrezima mladih miševa koji su bili podvrgnuti opstrukciji tijekom različitih vremenskih razdoblja. Dok su lažno operirani bubrezi pokazali normalan tubulointersticij (Slika 1A), začepljeni bubrezi nakon 2 dana UUO pokazali su TIL i bili su karakterizirani dilatacijom tubula; neki tubuli sadržavali su i urinarne odljevke. Takve su se lezije povećavale s napredovanjem opstrukcije (Slika 1A). GL, uglavnom glomeruloskleroza, primijećeni su u kasnoj fazi 21 dan nakon UUO i karakterizirani taloženjem periodične kiseline-Schiff (PAS)-pozitivnih materijala. Struktura glomerula bila je normalna i kod lažnih i kod ranih UUO bubrega (2, 7 i 11 dana) (Slika 1B). Broj glomerularnih stanica imao je tendenciju povećanja do dana -11 nakon opstrukcije i tendenciju smanjenja na dan -21 u UUO bubrezima (Slika 1C). Glomerularno mezangijsko nakupljanje imalo je tendenciju povećanja od 7 dana nakon opstrukcije (Slika 1D).

nije bilo u središtu glomerula UUO bubrega 21 dan nakon opstrukcije (Slika 1F). Lančana reakcija polimerazom otkrila je značajno smanjenje PFM (Nphs1 i Synpo) u UUO bubrezima 21 dan nakon opstrukcije (Slika 1G). Štoviše, SEM analiza otkrila je normalne podocitne nožne procese (PFP) u lažno operiranim bubrezima; međutim, brisanje PFP-a i strukture nalik mikrovilozama zabilježene su u UUO bubrezima 21 dan nakon opstrukcije (Slika 1H). Zajedno, ovi rezultati sugeriraju pojavu ozljede podocita u začepljenom bubregu 21 dan nakon opstrukcije.

U začepljenom bubregu nedostaju infifiltrirajuće imunološke stanice Prethodno smo pokazali da je ozljeda podocita u korelaciji s infifiltrirajućim imunološkim stanicama u glomerulu (13, 16, 18). Stoga smo ispitali infifiltraciju B- i T-stanica, kao i makrofaga u TIL-ovima i GL-ovima lažno operiranih i UUO bubrega (Slika 2). Brojne infifiltrirajuće B-, T-stanice i makrofagi primijećeni su u TIL-ovima UUO bubrega svih dana nakon opstrukcije, ali ih je bilo gotovo odsutno ili ih je bilo malo u glomerulima i lažnih i UUO bubrega (slike 2A-E). Broj B-, T-stanica i makrofaga bio je vrlo mali u glomerulu (podaci nisu prikazani), ali značajno veći u

tubulointersticij 2-, 7-, 11- i 21-dnevnih bubrega u usporedbi s lažnim bubregom (Slika 2F). Stoga, infiltrirane imunološke stanice mogu pridonijeti razvoju TIL-a u začepljenom bubregu. Međutim, drugi čimbenici mogu biti povezani s razvojem GL-a.

Ekspresija različitih članova obitelji TLR i nizvodnih citokina u lažno operiranim i začepljenim bubrezima mladih miševa Prethodne studije su otkrile veću ekspresiju različitih TLR-ova u podocitima bolesnih bubrega (15, 16, 19, 20). Zanimljivo je da su naši podaci otkrili značajno veću ekspresiju Tlr8 i Tlr9 u glomerulima izoliranima iz UUO 21-dnevne skupine nego u glomerulima lažne skupine (Slika 3A). Nadalje, ispitali smo ekspresiju nizvodno citokina članova obitelji TLR u glomerulima iz lažnih i UUO 21-dnevnih skupina i pronašli značajnu regulaciju u ekspresiji gena koji kodiraju i interleukin 1 beta (Il1b) i interleukin 6 (Il6) u UUO skupini u usporedbi s onom u lažnoj skupini (Slika 3B).

TLR8 ko-lokaliziran s PFM-om Kako je ekspresija Tlr8 i Tlr9 bila visoka u glomerulima izoliranim iz začepljenog bubrega, ispitali smo njihovu lokalizaciju imunofluorescentnim bojenjem. Protein TLR8 nije otkriven u lažno operiranim bubrezima (Slika 4A), ali je kolokaliziran s PFM sinaptopodinom u UUO bubregu (Slika 4B). Nadalje, nismo uspjeli detektirati ekspresiju proteina TLR9 u bubregu ni lažno operiranih ni UUO miševa (podaci nisu prikazani).

Proizvodnja IL1b iz podocita u začepljenom bubregu mladih miševa Kao što je prikazano na slici 3B, ekspresija glomerularnog Il1b (nizvodnog citokina iz obitelji TLR) bila je značajno viša u UUO bubregu nakon 21 dana od one u lažnom bubregu. Stoga smo ispitali izvor IL1b u glomerulima UUO bubrega imunofluorescentnim bojenjem. Ekspresija proteina IL1b nije otkrivena u glomerulima lažnih bubrega, ali je uočena u glomerulima UUO bubrega (slike 4C, D). Nadalje, IL1b kolokaliziran s PFM podocinom (Slika 4D).

u UUObubregna 21 dan od onoga u šamububreg.Stoga smo ispitali izvor IL1b u glomerulima UUO bubrega imunofluorescentnim bojenjem. Ekspresija proteina IL1b nije otkrivena u glomerulima lažnihbubregaali je uočen u glomerulima UUObubrega(Slike 4C, D). Nadalje, IL1b kolokaliziran s PFM podocinom (Slika 4D).

Povećana razina navodnog endogenog Tlr8 liganda u ON model miševa Prethodna studija je pokazala da miR-21 služi kao ligand za TLR8 (21). Stoga smo usporedili glomerularne i serumske razine miR-21 između lažnih i UUO 21-dnevnih skupina. Zanimljivo je da je grupa koja je primala UUO 21-dan pokazala značajno više razine glomerularne miR-21 nego ona u lažnoj skupini (P < 0.05),="" međutim,="" tendencija="" povećanja="" serumske="" mir{="" {10}}="" primijećeno="" je="" u="" prvoj="" skupini="" nego="" u="" potonjoj="" (p="0.06)" (slika="">

Korelacija ekspresije Tlr8 s njegovim ligandom miR-21 i PFM-ovima u opstruiranomBubregKao što je prikazano u tablici 3, primijetili smo značajnu pozitivnu korelaciju između glomerularne ekspresije mRNA Tlr8 i njegovog endogenog liganda (miR-21), kao i nizvodnih citokina Il1b i Il6. S druge strane, očita je negativna korelacija između mRNA Tlr8 i PFM-ova Nphs1 i Synpo.

In vitro stimulacija glomerula mimikom miR{{0}} aktivira ekspresiju Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina. Ekspresija Tlr8 imala je tendenciju povećanja (P=0.06), ali njegovi nizvodni citokini (Ifng i Il1b) bili su značajno (P <0,05 i 0,01) povećani u glomerulima lažnih miševa nakon

tretman miR-21 mimikom u usporedbi s onim u glomerulima miševa tretiranih PBS-om i mimikom negativne kontrole (Slika 5A). Međutim, nije uočena značajna korelacija između ekspresije Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina u glomerulima lažnih miševa nakon tretmana mimicima (Tablica 4). Ekspresija Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina bila je značajno veća u glomerulima UUObubrega, nakon tretmana miR-21 oponašaju one u glomerulima UUObubregatretirani PBS-om i mimikom negativne kontrole (Slika 5B). Otkrivena je značajna korelacija između ekspresije Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina u glomerulima UUO bubrega nakon tretmana mimicima, što ukazuje na veću aktivaciju Tlr8-posredovanog puta nuklearnog faktora kapa B (NF-kB) i izlučivanje proinflamatornih citokina u opstruiranom bubregu (Tablica 4).

Lokalizacija TLR8 i ozljeda podocita u kolateralnim bubrezima mladih miševaLažno operirani bubrezi pokazali su normalan glomerul, dok su kolateralni bubrezi imali glomerularnu hipertrofiju, povećan broj glomerularnih stanica i dilataciju glomerularnih kapilara (Slika 6A). Glomeruli iz lažno operiranih bubrega bili su pozitivni na ekspresiju sinaptopodina i nisu imali ekspresiju TLR8 (Slika 6B). S druge strane, kolateralni bubrezi izgubili su ekspresiju sinaptopodina u središtu glomerula, ali su pokazali ekspresiju TLR8 duž glomerularne brzine (Slika 6C). Štoviše, protein TLR8 bio je ko-lokaliziran sa sinaptopodinom (Slika 6C). Lažno operirani bubrezi pokazali su normalnu ekspresiju podocina, ali ne i ekspresiju IL1b u glomerulima (Slika 6D). Međutim, glomeruli unutar kolateralnog bubrega izgubili su ekspresiju podocina u središtu, ali su imali ekspresiju IL1b duž glomerularne brzine (Slika 6E). Nadalje, protein IL1b kolokaliziran je s podocinom (Slika 6E). SEM analiza otkrila je normalne PFP-ove u lažno operiranim bubrezima miševa, ali brisanje PFP-a i mikrovilozne strukture bile su vidljive u kolateralnim bubrezima (Slika 6F).

Lokalizacija TLR8 i ozljeda podocita u začepljenim i kolateralnim bubrezima starih miševaLažno operirani bubrezi pokazali su normalnu ekspresiju sinaptopodina, ali nisu otkrili bojenje za TLR8 protein unutar svojih glomerula (Slika 7A). Zanimljivo je da su i kolateralni i UUO bubrezi pokazali gubitak ekspresije sinaptopodina u središtu glomerula, ali su zadržali ekspresiju TLR8 duž glomerularne rete (slike 7B, C). Protein TLR8 kolokaliziran je sa sinaptopodinom u kolateralnim i UUO bubrezima (slike 7B, C). Lažno operirani bubrezi na sličan su način pokazali normalnu ekspresiju podocina, ali nisu imali ekspresiju IL1b u svojim glomerulima (Slika 7D). S druge strane, i kolateralni i UUO bubrezi izgubili su ekspresiju podocina u središtu glomerula, ali su pokazali ekspresiju IL1b duž glomerularne rete (slike 7E, F). Utvrđeno je da je pozitivno bojenje kolokalizirano s podocinom u glomerulima kolateralnih i UUO bubrega (slike 7E, F). SEM ispitivanje otkrilo je normalne PFP-ove u lažno operiranim bubrezima miševa, brisanje PFP-a i strukture nalik mikrovilama u kolateralnim i UUO bubrezima starih miševa (Slika 7G).

RASPRAVANA

prevalencija je česta u dojenčadi kao i u starijih osoba (4-7). Stoga smo mlade i stare miševe podvrgli UUO kako bismo oponašali ON stanje jedinki različitih dobnih skupina i ispitali TIL i GL. Kod začepljenog bubrega, progresija TIL-a bila je očita u ranijoj fazi opstrukcije (2 dana); međutim, progresija GL-a zajedno s ozljedom podocita primijećena je u kasnijoj fazi. Kolateralni bubreg pokazao je GL i ozljedu podocita u isto vrijeme. Ovo zapažanje ukazuje da se ozljeda podocita događa iu opstruiranim i u kolateralnim bubrezima, iako početni inzult može varirati. Naše prethodne studije istaknule su korelaciju između ozljede podocita i infiltracije imunoloških stanica u glomerulu (13, 16, 18). Međutim, infiltracija imunoloških stanica u glomerule lažnih ili začepljenih bubrega nije uočena u ovoj studiji. Stoga smo razmotrili uključenost drugih čimbenika u ozljedu podocita u začepljenom bubregu. Pretpostavili smo da signali opasnosti (DAMP ili PAMP), bilo cirkulatornog podrijetla ili proizašli iz oštećenog tubularnog epitela, mogu pridonijeti ozljedi podocita u ON, zahvaljujući svom jedinstvenom položaju u glomerulu. Važno je da se pokazalo da interakcija između DAMP-a i TLR-a igra važnu ulogu u patogenezi nezaraznih bolesti (15). Različiti članovi obitelji TLR eksprimiraju se na staničnoj plazma membrani ili unutarstaničnim vezikulama (22) i okarakterizirani su kao urođeni imunološki senzori koji učinkovito prepoznaju DAMP ili PAMP. Nakon aktivacije odgovarajućim DAMP-ovima ili PAMP-ovima, TLR-ovi su pojačali ekspresiju nizvodnih citokina kroz NF-kB put i inducirali obrambeni sustav domaćina (22). Štoviše, DAMP-ovi prenose prisutnost ozljede tkiva na imunološke stanice ili lokalne intrinzične stanice i posljedično pogoršavaju oštećenje tkiva (23-26). Važno je da svi TLR-ovi aktiviraju put NF-kB koji kontrolira ekspresiju niza gena za upalne citokine (27). Osim toga, aktivacija TLR signalizira njihove nizvodne putove za aktivaciju NF-kB, koji je odgovoran za upalu i povezan je s patogenezom oštećenih tkiva (28). Shichita i sur. otkrili su patološke interakcije između endogenih liganada i TLR2 ili TLR4, koje pridonose ishemijskoj ozljedi mozga (25). Prethodne studije također su pokazale sposobnost članova obitelji TLR da induciraju TIL-ove u bubrezima (TLR2, 4, 5, 7 i 11) i GL-ove (TLR1-6, 8 i 9) (17, 29-33 ). U ovoj studiji pronašli smo oštećenje podocita u opstruiranim i kolateralnim bubrezima i razjasnili

uloge različitih članova obitelji TLR koji mogu pridonijeti ozljedi podocita (15, 16, 19, 20). Kao što smo pretpostavili, glomerularna ekspresija Tlr8 i Tlr9 bila je veća u glomerulima izoliranim iz UUO bubrega nego u onima iz lažno operiranih miševa. Štoviše, glomerularna ekspresija upalnih citokina povezanih s NF-kB putem, uključujući Il1b i Il6, bila je viša u UUO bubregu 21 dan nakon opstrukcije. Stoga smo zaključili da put NF-kB posredovan TLR-om igra važnu ulogu u patogenezi GL u opstruktivnom bubregu. Za razliku od ostalih članova obitelji TLR, TLR8 i TLR9 detektiraju se u endosomima stanica. TLR8 prepoznaje jednolančane RNA i kratke dvolančane RNA iz mikroorganizama i aktivira proizvodnju nekoliko citokina posredovanih NF-kB (22). S druge strane, TLR9 prepoznaje dvolančane DNA i aktivira put NF-kB za proizvodnju nizvodnih citokina (16, 34). U ovoj studiji prepoznali smo samo kolokalizaciju proteina TLR8 zajedno sa sinaptopodinom PFM u glomerulima. Naše prethodne studije također su pokazale da se i TLR8 i TLR9 kolokaliziraju s PFM-ovima i aktiviraju proizvodnju upalnih citokina posredovanih NF-kB kako bi izazvali ozljedu podocita (15, 16). Štoviše, druge su studije pokazale patološku korelaciju između putova posredovanih TLR-om i ozljede podocita in vitro (34, 35). Banas i sur. otkrio je interakciju TLR4 u podocitima s imunološkim sustavom tijekom razvoja GL (35). Prema tome, podociti mogu pridonijeti imunološkom nadzoru kroz putove posredovane TLR-om. U ovoj smo studiji pokazali ekspresiju gena TLR8 i lokalizaciju proteina u podocitima začepljenog bubrega, kao i veću ekspresiju nizvodnih citokina u glomerulu. Stoga zaključujemo da putevi posredovani TLR8-pridonose razvoju GL kroz ozljedu podocita u začepljenom bubregu.

Prethodno istraživanje pokazalo je da miR-21, endogeni ligand TLR8, može doseći i vezati se za TLR8 u staničnim endosomima, pri čemu može inducirati TLR8-posredovanu aktivaciju puta NFkB i izlučivanje proupalnih citokina (21). U ovoj studiji pronašli smo značajno više razine glomerularnog miR-21 kao i povišene razine serumskog miR-21 u UUO bubregu od onih u lažnim kontrolama i pokazali njegovu korelaciju s glomerularnom ekspresijom Tlr8 . Zanimljivo je da su glomeruli iz UUO bubrega tretiranih miR-21 mimikom pokazali veću ekspresiju Tlr8 i njegovih nizvodnih citokina u usporedbi s onima u glomerulima lažnih miševa tretiranih miR-21 mimikom, što ukazuje na povećanu dostupnost endogenog miR -21 iz oštećenog tkiva u opstruiranom bubregu i aktivacija prekomjerne ekspresije Tlr8 u UUO bubrezima u usporedbi s onom lažnog. Zajedno zaključujemo da veći volumen miR-21 u opstruiranom bubregu doseže endosome u podocitima i inducira Tlr8-posredovanu aktivaciju puta NF-kB i izlučivanje proupalnih citokina. Ovi citokini, zauzvrat, sudjeluju u razvoju GL kroz ozljedu podocita.

IL1b je jedan od važnih nizvodnih citokina NF-kB-puta, koji uglavnom proizvode podociti u glomerulu u uvjetima bolesti. Prethodne studije pokazale su da IL1b uzrokuje ozljedu podocita smanjenjem PFM (36, 37). U ovoj studiji pokazali smo veću glomerularnu ekspresiju Il1b i njegovu kolokalizaciju s PFM-ovima, koji su pokazali smanjenu ekspresiju. Štoviše, glomerularna ekspresija Il1b korelirala je s Tlr8 i bila je u korelaciji s ekspresijom PFM (Nphs1 i Synpo). Stoga ovi rezultati pokazuju da čimbenici nizvodno od Tlr8, uključujući Il1b i Il6, mogu uzrokovati ozljedu podocita u opstruiranom bubregu smanjenjem ekspresije PFM.

Kolateralni bubrezi mladih miševa također su pokazali GL i gubitak PFM. Ovaj rezultat je potvrđen SEM-om, koji je otkrio oštećenje podocita u kolateralnom bubregu. Također smo pronašli više razine serumskog miR-21 u ON modelu miša. Nadalje, IL1b protein ko-lokaliziran s PFM. Ovi rezultati pokazuju da serumski miR-21 stupa u interakciju s TLR8 u podocitima kolateralnog bubrega i aktivira proizvodnju nizvodnih citokina, što zauzvrat smanjuje funkciju podocita i ozljedu podocita. Oštećenje podocita također je primijećeno u začepljenim i kolateralnim bubrezima starih miševa putem mehanizma sličnog onome koji je opažen kod mladih miševa.

Zaključno (Slika 8), ekspresija glomerularnog miR-21 je povišena nakon jednostrane ureteralne opstrukcije, pri čemu stupa u interakciju s TLR8 u podocitima i inducira proizvodnju nizvodnih citokina (Il1b i Il6) što ukazuje na aktivaciju puta NF-kB. Više razine citokina smanjuju PFM, što rezultira ozljedom podocita i naknadnim razvojem GL. Povišene razine miR-21 u serumu aktiviraju TLR8 u podocitima kolateralnog bubrega i induciraju GL kroz ozljedu podocita. Stoga ova studija jasno pokazuje razvoj GL u opstruiranim i kolateralnim bubrezima kroz ozljedu podocita nakon prekomjerne ekspresije Tlr8.