Dio 2: Molekula ozljede bubrega-1 potencijalni je receptor za SARS-CoV-2

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Kliničke manifestacije koronavirusa

1. Razdoblje inkubacije je dugo, a glavni simptomi su povišena temperatura, umor, grlobolja i kašalj. Vrućica može biti visoka, umjerena ili niska;

2. Dojenčad i starije osobe nisu tipične i često ih prati hripanje i dispneja. U teškim slučajevima može doći do oštećenja više sustava;

3. Suhi kašalj u ranoj fazi je uglavnom paroksizmalan i jak, sličan hripavcu, što utječe na san i aktivnosti; u kasnijoj fazi, kašalj je ispljuvak, ispljuvak je zloban, povremeno sadrži malu količinu krvi, a neki su popraćeni hripanjem;

4. Neki pacijenti imaju blage simptome i možda nemaju temperaturu. Većina pacijenata ima dobru prognozu, a mali broj pacijenata je kritično bolestan ili čak umire;

5. Sindrom akutnog respiratornog distresa, septički šok, refraktorna metabolička acidoza i poremećaj koagulacije.

Kako spriječiti novi koronavirus, jačanje vlastitog imuniteta je najučinkovitije sredstvo za borbu protiv virusa. Cistanche, koja se od davnina koristila kao hranjivo blago, poznata je kao "pustinjaginseng" i kralj je jačanja imuniteta. Cistanche - Kralj jačanja imuniteta

Suvremena medicinska istraživanja dokazala su da osim funkcije hranjenja i jačanja organizma, Cistanche ima značajne ljekovite učinke u prevenciji tumora, usporavanju starenja, aritmiji, inhibiciji apoptoze i jačanju imuniteta. milost.

Theukupni glukozidi Cistanchesu aktivne komponente ginsenga za regulaciju imunološke funkcije, što može poboljšati imunološku funkciju ne samo za normalne ljude, već i za osobe s niskom imunološkom funkcijom.

Klinička promatranja su potvrdila da Cistanche ima određeni ljekoviti učinak na maligne tumore, te ima očiti učinak povećanja leukocita. Uzimanje ginsenga tijekom radioterapije i kemoterapije može smanjiti toksične i nuspojave radioterapije i kemoterapije, ubrzati popravak oštećenog tkiva i spriječiti leukopeniju;

Rasprava

Za borbu protivPandemija COVID-19, duboko razumijevanje kakoSARS-CoV-2napada ljudske stanice je opravdano. Studije su pokazale izravnu infekciju SARS-CoV-2 ububregosim pluća (Braun i sur., 2020; Farkash i sur., 2020). Međutim, ACE2 ostaje jedini dobro poznati receptor koji može posredovati u ovoj invaziji. Nadalje, bubrežni tropizam SARS-CoV-2 i povezaniozljeda bubregačini se neobjašnjivim relativno smanjenom razinom ACE2 nakon virusne invazije (Kuba et al., 2005). Ovdje naša studija sugerira da KIM1, drastično regulirani biomarker za ozljedu bubrega (Yang et al., 2015.), posreduje u invaziji bubrega SARS-CoV-2 kao receptor.

Također smo otkrili da se SARS-CoV-2-RBD veže za KIM1 s većim afinitetom nego SARS-CoV-RBD i MERS-COV-RBD, što je vjerojatno temelj jače zaraze SARS-CoV-2 (Rabaan et al, 2020.); stoga, bubrežnu infekciju i uloge KIM1 u ovim teškim respiratornim bolestima vrijedi ponovno razmotriti. Naime, naši rezultati sugeriraju različita mjesta vezivanja KIM1 i ACE2 na virusnom RBD-u, stoga je vrijedno istražiti posreduju li i kako KIM1 i ACE2 invaziju SARS-CoV-2 u tim organima. Osim toga, budući da se KIM1 endocitozira putem putova ovisnih o klatrinu (Zhao et al., 2016.), također bi bilo zanimljivo dodatno istražiti proces ovisan o KIM1- nakon vezivanja virusa za staničnu membranu.

ACE2 je najbolje proučen receptor za SARS-CoV-2, no ipak nije idealan terapeutski cilj za COVID-19, budući da je široko izražen u više organa i igra ključnu ulogu u regulaciji krvnog tlaka i sprječavanje ozljede srca/bubrega (Imai et al., 2005; Li et al., 2020d). Nasuprot tome, KIM1 ima jaču povezanost s funkcijom bubrega i jako je izražen tek nakonozljeda bubrega(Kondratowicz i sur., 2011.; Yuan i sur., 2015.; Costafreda i Kaplan, 2018.), što ga čini specifičnijim i možda sigurnijim terapijskim ciljem za bolesnike s COVID-19 i bubrežnim bolestima.

Ukratko, naši podaci ukazuju na ključnu ulogu KIM1 u bubrežnom tropizmu SARS-CoV-2 kao potencijalnog receptora za SARS-CoV-2. Ovdje predlažemo model 'začaranog kruga' posredovanog KIM1 i ACE2 (Slika 5G), koji može objasniti bubrežni tropizam SARS-CoV-2 kod pacijenata s COVID-19. Tijekom početne faze invazije SARS-CoV-2, viša fiziološka razina (dodatna slika S1) i afinitet vezanja (dodatna tablica S1) čine ACE2 primarnim ciljem, koji nije specifičan za bubrege. Međutim, nakon pojave virusom induciranog AKl, rezultirajući drastično pojačan KIM1 brzo potiče sekundarnu virusnu infekciju posredovanu KIM1 i ACE2, koja je više specifična za bubrege, i posljedično pogoršava oštećenje bubrega u začaranom krugu (Slika 5G). Pristupi koji mogu prekinuti interakciju između SARS-CoV-2 i KIM1, uključujući anti-KIM1 antitijela, inhibitore malih molekula i peptide antagoniste koji potječu od KIM1-, mogu rasvijetliti COVID-19 liječenje.

Materijali i metode

Materijali

Recombinant SARS-CoV-2-RBD (T80302) was obtained from Genscript. Antagonist peptide 1 (AP1, SCSLFTCQNGIV, purity >95%) and antagonist peptide 2 (AP2, SCSLFTCQNGGGWF, purity >95 posto ) kemijski je sintetizirao Genscript. Anti-mišje-lgG antitijelo (p/n 18-8816-33) i anti-zečje-lgG antitijelo (p/n 18-8817-33) dobiveno je od Rocklanda. IgG sa SureBeads" Protein G magnetne kuglice (J2112LB-02) kupljene su od Bio-Rada. DAPI (D9542) je bio od Sigme. Alex Flour 594 označeni faloidin (C2205S) bio je od Beyotimesa. Antitijela protiv KIM1 (NBP{{ 15}}, Novus Biologicals), Flag (F1804, Sigma), HA (H6908, Sigma) i ACE2 (2115-1-AP, Proteintech).

Stjecanje i analiza profila ekspresije KIM1 i ACE2

Kako bismo dobili sveobuhvatne profile transkriptoma i proteina KIM1 i ACE2 za ljudska tkiva, prikupili smo i analizirali podatke o transkriptomima i profile proteina temeljene na imunohistokemiji iz Atlasa ljudskih proteina (HPA, https://www.proteinatlas.org), koji su pokazali ekspresija i lokalizacija ljudskih proteina u tkivima i organima, na temelju dubokog sekvenciranja RNA (RNA-seq) iz 37 normalnih tkiva i imunohistokemije na tkivnim mikronizovima koji sadrže 44 vrste tkiva (Uhlen et al., 2015.). HPA RNA-seq tkivo gena za kodiranje proteina zabilježeno je kao srednja vrijednost transkripata za kodiranje proteina na milijun (pTPM), što odgovara srednjim vrijednostima uzoraka iz svakog tkiva. Razine ekspresije proteina temeljene na histologiji analizirane su ručno u četiri razine (nije detektirano, niska, srednja i visoka). Na dodatnoj slici S1 navedeno je prvih 10 transkripcijskih razina tkiva i razina ekspresije proteina KIM1 i ACE2 temeljenih na histologiji, a sažeti su profili ekspresije KIM1 i ACE2 koji se preklapaju.

Molekularno spajanje i simulacije dinamike

Spajanja su provedena putem Z-Docka (http://zdock.umassmed.edu/). Kristalne strukture SARS-CoV-RBD (PBD ID 2AJF), ​​SARS-CoV-2-RBD (PDB ID 6MOJ), MERS-COV-RBD (PDB ID 4L3N), ACE2 (PDB ID 1R42) i KIM1 Ig V domena (PDB ID 5DZO) korištena je za traženje potencijalnih modela vezanja. Proteinski kompleksi s najboljim rezultatom odabrani su za sljedeće simulacije molekularne dinamike, koje je proveo Desmondov poslužitelj i analizirao Pymol2.3 i Maestro11.8.012. Dijagram simulacija dinamike od 50 ns primijenjen je za proučavanje dinamičkih parametara proteinskih kompleksa . Slobodnu energiju vezanja MM-GBSA izračunao je HawkDock (Misini lgnjatovic et al., 2016).

Korijen srednje kvadratne devijacije (RMSD) i korijen srednje kvadratne fluktuacije (RMSF)

RMSD je korišten za procjenu prosječne promjene u pomaku odabira atoma za određeni okvir kako je opisano (Li et al., 2011). RMSF je proveden za proučavanje promjena pomaka u proteinskom lancu (Li i sur., 2011) .

AKI modeli miševa i qPCR

I/R ozljeda izvedena je na C57BL/6 miševima kao što smo prethodno opisali (Chen et al, 2015, 2017). Za AKI izazvanu cisplatinom, 30 mg/kg tjelesne težine cisplatina injicirano je intraperitonealno u 8- tjedan dana stare muške miševe, a miševi su žrtvovani 3 dana kasnije. Uzorci krvi i bubrega prikupljeni su za daljnju analizu, s n=4 za svaku pokusnu skupinu životinja. Ukupna RNA izolirana je iz bubrega pomoću RNAiso Plus (TaKaRa) i obrnuto transkribirana u cDNA korištenjem M-MLV sustava sinteze prvog lanca (Invitrogen). Obilje specifičnih genskih transkripata procijenjeno je qPCR-om. Navedeni su primeri korišteni u studiji (dodatna tablica S4).

Konstrukti

Ekspresijski plazmidi sisavaca za ljudski KIM1, KIM1 Ig V (KIM1 ostaci aa 20-127), KIM1 △lg V (skraćeni KIM1 bez ostataka aa 20-127), KIM1-CFP, KIM1 lg V-CFP, ACE2, SARS-CoV-2-RBD(SARS-CoV-2-S ostaci aa 319-541), SARS-CoV-2-S, SARS-CoV{{20 }}RBD-YFP i TIM4-YFP su izgrađeni. Produkti PCR amplifikacije odgovarajućih fragmenata cDNA klonirani su u vektor baziran na pRK promotoru koji sadrži ili HA ili FLAG oznaku. SARS-CoV-2-srodni plazmidi ljubazni su darovi dr. PHWanga sa Sveučilišta Shandong.

Kultura stanica i transfekcija

Tubularna stanična linija ljudskog bubrega HK-2 (dobivena iz Kineskog centra za zbirku tipskih kultura) uzgojena je u mediju DMEM/F12 (Hyclone) koji sadrži 17,5 mM glukoze i 10 posto fetalnog goveđeg seruma. Kako bi se procijenio utjecaj SARS-CoV-2 na stanice, stanice HK-2 transficirane su plazmidima SARS-CoV-2-S i SARS-CoV-2-RBD i zatim sakupljene za daljnje otkrivanje.

Co-IP

Naznačene stanice HK-2/HEK293T (1×10) lizirane su u 1 ml pufera za pretlizu (25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 posto NP-40, 1 mM EDTA, 5 postotak glicerola), koji je formuliran za pulldown i IP testove i kao pufer za pranje kuglica. Za IP, stanični lizat je imunoprecipitiran s navedenim protutijelima ili odgovarajućim gG s SureBeadsTM Protein G magnetskim kuglicama preko noći na 4°C. Nakon ispiranja puferom za pretlizu koji je sadržavao 500 mM NaCl, zrnca su prokuhana u puferu za punjenje i podvrgnuta imunoblotingu (Wan et al., 2017.).

FRET test

Intracelularna interakcija između KIM1 i SARS-CoV-2-RBD otkrivena je standardnim testom temeljenim na FRET-u (Karpova i McNally, 2006.) pomoću KIM1-CFP i SARS-CoV-2-RBD-YFP . Ukratko, ekspresijski plazmidi sisavaca koji eksprimiraju KIM1-CFP ili KIM1 Alg V-CFP kotransficirani su sa SARS-CoV-2-RBD-YFP u-293T stanice. Za detekciju temeljenu na fluorescentnom spektrofotometru, stanice su sakupljene i lizirane 24 sata nakon transfekcije, a lizat je detektiran F-2700 fluorescentnim spektrofotometrom (Hitachi) skeniranjem valne duljine (500-600nm) i vremenskim skeniranjem (435 /527 nm, ekscitacija/emisija). Za konfokalnu detekciju, stanice su snimljene konfokalnim mikroskopom Leica TCS SP8 pod objektivom velike snage (40×) (CFP kanal: 435/485 nm, ekscitacija/emisija; YFP kanal :485/527 nm, ekscitacija/emisija; FRET kanal: 435/527 nm, ekscitacija/emisija) (Li et al, 2020b). Kotransfekcija nekonjugiranog CFP i YFP uključena je kao negativna kontrola kako je opisano (Karpova i McNally, 2006). Interakcija između KIM1 i njegovog liganda TIM4 otkrivena je FRET testom kao pozitivna kontrola (Rong et al, 2011).

CRISPR-Cas9-nokaut KIM1

Protokoli za genomski inženjering temeljeni na CRISPR-Cas9-upotrijebljeni su kako je opisano (Zhang et al., 2017.). Pružene su ciljne sekvence vodeće RNA za KIM1 (dodatna tablica S4).

FITC označavanje i konfokalna mikroskopija

Označavanje FITC-om provedeno je kao što smo prethodno opisali (Li et al, 2020b; Zhang et al, 2020). Ukratko, SARS-CoV-2-RBD je inkubiran s FITC (molarni omjer 1:5) preko noći, a zatim je dodano 5 mM NHCl da se zaustavi reakcija i ugasi neizreagirani FITC. Otopina je dva puta dijalizirana i liofilizirana za daljnju upotrebu.

HEK293T stanice (5×109) ili HK-2 stanice (1×107) inkubirane su sa slobodnim FITC-om ili FITC-SARS-CoV-2-RBD （100ug/ml za 2. Za testove internalizacije temeljene na peptidima, AP1 ili AP2（50 μM）dodan je zajedno s FITC-SARS-CoV-2-RBD （100 ug/m）. Nakon fiksiranja s 4 posto (w/v) formaldehida, stanične membrane su obojene Alex Flour 594 označenim faloidinom （2ug/ml）, a jezgre su obojene DAPI（1ug/m）, a zatim snimljene Leica TCS SP8 konfokalni mikroskop. Za svaku skupinu, u procjenu je uključeno najmanje 100 stanica iz pet polja pod objektivom velike dioptrije (64×). Prikazane su reprezentativne slike. Kvantifikacija slika provedena je ImageJ1.8.0.

Testovi viabilnosti stanica

Stanice su stavljene na 3000-4000 stanica po jažici u 96-ploči s jažicama. Pri 80 posto konfluencije, stanice inkubirane sa SARS-CoV-2-RBD （100 ug/ml） tretirane su sa ili bez AP1 ili AP2（10,50,100 µM）. Nakon toga, svakom je dodano 10 ul MTT （5 mg/ml

jažice 4 h, medij je uklonjen i dodan je DMSO. Apsorpcija izmjerena na 490 nm normalizirana je na odgovarajuću kontrolnu skupinu.

Statistička analiza

Podaci su izraženi kao srednja vrijednost ± SD. Značajne razlike procijenjene su dvostranim Studentovim testom. Dvostrana P-vrijednost<0.05 was="" considered="" statistically="" significant.="" analyses="" were="" performed="" with="" excel="" 2017="" and="" graphpad="" prism="">