Dio 2: Nedostatak DHHC21 smanjuje bubrežnu disfunkciju tijekom septičke ozljede

Kontakttina.xiang@wecistanche.com

Rasprava

U ovom radu izvješćujemo o DHHC21 kao novom regulatoru perfuzije i funkcije bubrega tijekom septičke ozljede. Naša nova otkrića pokazuju: (1) Zdhhc21devde? miševi pokazuju bolju bubrežnu funkciju i manje oštećenje bubrega nakon septičke ozljede u usporedbi s WT miševima; (2) DHHC21 funkcionalni nedostatak čuva perfuziju bubrežnog tkiva, zasićenost kisikom i RBF kod septičke ozljede; (3) DHHC21-katalizirana alAR palmitoilacija je potreban za aktivaciju alAR signalnog puta i alAR-induciranu konstrikciju bubrežnih arterija. Ova studija pruža novi mehanički uvid u regulaciju perfuzije i funkcije bubrega tijekom septičke ozljede. Predlažemo da funkcionalni nedostatak DHHC21 daje zaštitne učinke narad bubregakod septičke ozljede i da inhibicija DHHC21 može poslužiti kao terapijska strategija za borbu protivbubrežna disfunkcijatijekom septičke ozljede.

Kliknite ovdje da saznate prednosti ekstrakta cistanche tubulosa

Hipoperfuzija/hipoksija bubrežnog tkiva jedan je od vodećih uzroka bubrežne disfunkcije tijekom septičke ozljede3-5. Otkrili smo bubrežnu hipoperfuziju u miševa nakon CLP-a što je dokazano oslabljenim intenzitetom MSOT signala ukupnog hemoglobina, smanjenom zasićenošću kisikom u bubrežnom tkivu i smanjenim RBF-om nakon septičke ozljede. U skladu s našim nalazima, smanjenje RBF-a primijećeno je u bolesnika s sepsom s ozljedom bubrega, kao i u modelima septičke ozljede na velikim životinjama7,10l1. Vrijedno je napomenuti da nekoliko studija izvješćuje da se bubrežna disfunkcija može razviti u životinja s sepsom s nepromijenjenim ili čak povećan RBF334. Ovi nepodudarni nalazi mogu se pripisati različitim životinjskim modelima i metodama koje se koriste za mjerenje protoka krvi. Na primjer, dok se CLP-inducirana polimikrobna septička ozljeda često koristi, neke studije koriste intravenoznu injekciju Escherichie coli35.

Nedavno je objavljeno da je palmitoilacija proteina novi regulator funkcije proteina, uključen u patogenezu i napredovanje mnogih bolesti. Schmidt et al.3637 prvi su ga identificirali kao novu vrstu posttranslacijske modifikacije. Otkriće obitelji DHHC od tada je potaknulo brzo širenje ovog polja38,39. Uloge palmitoilacije i PAT-a prijavljene su u brojnim fiziološkim i patološkim stanjima, uključujući metabolizam lipida,Rak, kardiovaskularne bolesti, i neurološki poremećaji23,0,4. Iako je ranije prijavljeno da je uključenost palmitoilacije u policističnu bolest bubrega i rak bubrega23, bilo je vrlo ograničenih studija koje su ispitivale funkcionalnu ulogu PAT-a ubolesti bubrega, posebno kod bubrežne disfunkcije tijekom septičke ozljede. Koliko nam je poznato, mi smo prvi koji su istražili ulogu DHHC2l u bubrežnoj disfunkciji kod septičke ozljede. Naša otkrića pokazuju da inhibicija DHHC21 uvelike spašava funkciju bubrega i čuva strukturu bubrega kod septičke ozljede.

Naša studija koristi Zdhhc21dp/d4? miševa pokazuju da se korisni učinci funkcionalnog nedostatka DHHC21 na funkciju bubrega pripisuju njegovoj sposobnosti da poboljša perfuziju bubrežnog tkiva tijekom septičke ozljede. U bazalnim uvjetima, Zdhhc21ewaeP miševi ne pokazuju znakove neravnoteže sol/voda ili strukturno/funkcionalno oštećenje bubrega5. Ipak, gubitak funkcije DHHC21 potiskuje smanjenje RBF-a izazvano septičkom ozljedom, bubrežnu perfuziju i zasićenost bubrega kisikom. Povećani bubrežni vaskularni otpor uzrokovan pretjeranom bubrežnom vazokonstrikcijom smatra se glavnim razlogom za poremećenu perfuziju bubrežnog tkiva kod septičke ozljede6.9. Naši rezultati ukazuju na uključenost alAR-a u posredovanju hipoperfuzije bubrežnog tkiva izazvane septičkom ozljedom, što je dokazano povećanjem palmitoilacije alAR-a i aktivacijom alAR signalnog puta kod septičke ozljede. Međutim, funkcionalni nedostatak DHHC21 inhibira palmitoilaciju alAR-a i rezultira smanjenom sposobnošću alAR-a da aktivira svoj nizvodni efektor i posreduje u vazokonstrikciji izazvanoj fenilefrinom u bubrežnim arterijama.

"Molekularni mehanizam na kojem se temelji regulacija funkcije alAR pomoću DHHC21 još uvijek treba u potpunosti razjasniti. Defekt u funkciji alAR uzrokovan gubitkom funkcije DHHC21 može se pripisati konformacijskoj promjeni alAR-a. Mnogi GPCR-ovi oslanjaju se na palmitoilaciju za svoje odgovarajuće intracelularna konformacija, pričvršćeni palmitat u C-terminalnim repovima GPCR-a umeće se u plazma membranu kako bi se stvorila četvrta unutarstanična petlja, koja je neophodna za interakciju GPCR-a s njihovim partnerskim proteinima i širenje GPCR signala17,4. Prethodna studija je ukazao da se palmitoilacija Albara također događa u njegovoj C-terminalnoj regiji44. Prema tome, nedostatak palmitoilacije lAR posredovane DHHC21- može promijeniti unutarstaničnu konformaciju alAR-a, blokirajući tako širenje lAR signala. To se može poduprijeti našim rezultatima koji pokazuju da je aktivacija ERK, nizvodnog signalnog događaja aktivacije alAR, inhibirana u Zdhhc21devider miševa podvrgnutih sept. ic ozljeda. Međutim, DHHC21-regulirana topologija alAR karboksilnog terminala mora se dodatno potvrditi kristalografijom X-zraka.

Drugi novi aspekt naše studije je korištenje MSOT-a za procjenu perfuzije i funkcije bubrega tijekom septičke ozljede. MSOT je prijavljen kao metoda bez oznake za mjerenje perfuzije različitih organa i pouzdana tehnika snimanja za određivanje funkcije bubrega2832,45. U usporedbi s Dopplerovim mjeračem protoka koji ne dopušta vizualizaciju mikrovaskulature45, MSOT generira slike visoke prostorne razlučivosti pri 150 um, dok pruža kvantitativnu procjenu statusa perfuzije u mikrovaskulaturi bubrega. IRDye800CW topiv u vodi siguran je tragač za mjerenje bubrežnog klirensa i ne izaziva toksičnost pri dozi visokoj od 20 mg/kg. Dvofazno kretanje IRDye800CW koje smo uočili u skladu je s prethodno objavljenim studijama. Naši MSOT zapisi ukazuju na veće Tmax-kašnjenje u septičnim bubrezima, što ukazuje na oslabljen bubrežni klirens. Studija o nefropatiji pokazuje da je oštećena bubrežna funkcija otkrivena MSOT-om značajno povezana s glomerularnim histološkim oštećenjem30. Naši podaci, u skladu s prethodnim publikacijama, sugeriraju da je MSOT minimalno invazivna i pouzdana tehnika za praćenje perfuzije i funkcije bubrega.

Trenutačno nema dostupnih inhibitora specifičnih za DHHC21-. Najčešće korišteni inhibitor PAT-a je 2-BP koji ima širok učinak na višestruke DHHC-ove i također ometa metabolizam masnih kiselina47. Stoga bi razvoj inhibitora male molekule koji specifično ciljaju DHHC21 bio smjer koji obećava. Također je vrijedno istaknuti da alAR nije jedini supstrat DHHC21. Nedavno je identificirano nekoliko drugih supstrata DHHC21, uključujući adhezijsku molekulu trombocitnih endotelnih stanica (PFCA M-1), estrogenski receptor kaveolin-1, endotelnu dušikov oksid sintazu (eNOS), Fyn, superoksid dismutazu (SOD{{ 8}}) i PLCB122,41,4s,49, Iako je izvan opsega ove studije, ne možemo isključiti mogućnost da ovi supstrati također mogu utjecati na funkciju bubrega tijekom septičke ozljede.

Zaključno, ova studija po prvi put pokazuje da DHHC21 igra ključnu ulogu u regulaciji bubrežne perfuzije tijekom septičke ozljede putem mehanizama koji uključuju palmitoilaciju alAR-a i vazokonstrikciju posredovanu alAR-om. Nadalje, inhibicija DHHC21 ima zaštitni učinak na funkciju bubrega tijekom septičke ozljede.

Materijali i metode

Reagensi. Svi reagensi navedeni su u Dodatnoj tablici S1.

Životinje. Zdhhc21depher miševi i njihovi kontrolni miševi divljeg tipa (B6C3Fe) kupljeni su od Jackson Laboratoryja. Genotip Zdhhc21dephe? miševa potvrđeni su sekvenciranjem (Genewiz, Inc., NJ, SAD). Primeri korišteni za sekvenciranje bili su: AGCTGACTGAAGGGCACC (naprijed) i AAAACCTGTAACGCATTTCCA (obrnuto)23. Životinje su držane u ciklusu svjetlo/tama od 12/12- h sa slobodnim pristupom hrani i vodi. U ovoj studiji korišteni su miševi (16-20 tjedana) oba spola. Sve pokuse na životinjama odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Sveučilišta Južne Floride te su u skladu s NIH Vodičem za brigu i korištenje laboratorija

Podvezivanje i punkcija cekuma, miševi su anestezirani izofluranom (3 posto indukcije i 1 posto održavanja). Napravljen je središnji rez u obrijanoj abdominalnoj regiji, a cekum je eksterijeriziran, čvrsto podvezan na 5 mm ispod ileocekalne valvule i dvaput perforiran 20-mjernom iglom distalno od točke podvezivanja. Iz svake ubodne rupe istisnut je jedan mm fecesa. Cecum je zatim repozicioniran, a abdomen je zatvoren u dva sloja. 37 C Ringerova laktatna otopina primijenjena je lokalno kako bi se spriječilo sušenje cekuma. Miševima je zatim supkutano davana fiziološka otopina od 37 stupnjeva 0.9 posto za reanimaciju tekućine. Preoperativna 0.5-1.5 mg/kg doza buprenorfina s produljenim oslobađanjem dana je za analgeziju. Lažni miševi bili su podvrgnuti istom kirurškom zahvatu, ali bez podvezivanja cekuma i punkcije50,51.

Multispektralna optoakustička tomografija. Procjena bubrežnog izlučivanja IRDye800CW. Miševi su anestezirani izofluranom i depilirani su oko regije torza. Miševi su snimljeni korištenjem Altera Medical MSOT Imaging System (München, Njemačka) na više valnih duljina: 700,730,760,775,785, 800,850 nm pri brzini od 10 okvira/s. Miševi su stavljeni u ležeći položaj u držač i pomicani duž vodoravne linearne pozornice kako bi se bubrezi postavili na vrh fiksno postavljene konkavne sonde. Nakon snimanja osnovne linije, 60 nmol RDve800CW otopljenog u 100 ul 0,9 posto fiziološke otopine ubrizgano je intravenozno tijekom razdoblja od 10 s. Slike su rekonstruirane pomoću formule povratne projekcije i obrađene multispektralnom analizom. Regije od interesa (ROI) nacrtane su oko korteksa bubrega i regije medule/zdjelice, a prikazane su vremenske promjene MSOT signala u ROI.

Measurement of renal perfusion. Mice were prepared for MSOT imaging utilizing the same procedures mentioned above. Mouse respiration was closely monitored throughout the entire procedure. Images were reconstructed and spectral unmixing was performed. ROIs were drawn around the entire right kidney region. Mean pixel intensities of oxygenated hemoglobin (HbO,) and deoxygenated hemoglobin (Hb) were acquired. Total hemoglobin (HbT=HbO,+ Hb) and oxygen saturation (So=HbO, /HbT) were then calculated>2.

Histopatologija bubrega. Bubrezi su fiksirani, izrezani duž sagitalne ravnine i obrađeni za ugradnju u parafin. Sekcije（5 µm） su deparafinizirane, rehidrirane i oksidirane periodnom kiselinom 8 minuta na sobnoj temperaturi (RT), nakon čega je uslijedila inkubacija sa Schiffovom otopinom 25 minuta. Sekcije su zatim obojene hematoksilinom. Slike su snimljene pomoću Keyence BZ-X710 (Itasca, IL, SAD). Strukturno oštećenje bubrega procijenjeno je na temelju sljedećih značajki: abnormalnost glomerula, gubitak četkastog ruba proksimalnog tubula, vakuolizacija, dilatacija epitela tubula, odvajanje/nekroza tubularnih stanica i infiltracija neutrofila. Svaka značajka ocijenjena je na ljestvici 0-5 na temelju ozbiljnosti.

Mjerenje kreatinina i dušika ureje u krvi. Mišja krv je sakupljena punkcijom srca 24 sata nakon septičke ozljede. Plazma je nastala centrifugiranjem krvi na 2500 g tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Mjerenje kreatinina: plazma je deproteinizirana korištenjem 10-kDa spin kolone; razine kreatinina u filtratu su zatim izmjerene korištenjem Creatinine Assay Kita. Razina dušika uree u krvi (BUN) određena je pomoću pribora za kolorimetrijsko otkrivanje dušika uree prema uputama proizvođača.

Mjerenje RBF i MAP. Miševi su anestezirani izofluranom. Pretvornik krvnog tlaka kaniliran je u karotidnu arteriju. Napravljen je središnji rez u abdominalnom području, nakon čega je uslijedio lijevi poprečni rez kako bi se otkrila bubrežna arterija. RBF je mjeren korištenjem ultrazvučnog mjerača protoka prolaznog vremena (TS-420; Transonic Systems Inc., Ithaca, NY, SAD). Nakon postavljanja sonde protoka oko izložene bubrežne arterije, miševi su ostavljeni da se stabiliziraju najmanje 30 minuta. RBF i MAP snimljeni su istovremeno pomoću PowerLaba (AD Instruments, Colorado Springs, CO, SAD). Podaci su analizirani pomoću softvera LabChart Pro verzija 74,55

Hvatanje potpomognuto smolom. Bubrežne arterije su sakupljene i lizirane u puferu za lizu (100 mM HEPES.25 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 μM palmostatin B, inhibitori proteaze, pH 7,4）22, 56. Tkivni lizati su inkubirani s puferom za blokiranje (100 mM HEPES.1 mM EDTA, 2,5 posto SDS, 6 ul/ml MMTS, pH 7,4) na 50 stupnjeva C tijekom 30 minuta uz stalno vrtloženje. Nakon taloženja hladnim acetonom, proteini su razdvojeni peletirani centrifugiranjem na 5000 g tijekom 30 min i isprani pet puta sa 70 posto hladnim acetonom. Proteinske pelete su resuspendirane u puferu za vezanje (100 mM HEPES, 1.0 posto SDS, 1 mM EDTA, pH 7.4). Koncentracija proteina je određena i normalizirana među skupinama Svaki uzorak proteina podijeljen je u dva jednaka dijela, svaki je dobio istu količinu zrnaca izopropil sefaroze 6B, hidroksvlamina (0,2 M, pH 7,4) i NaCl (0,2 M) dodanih u svaki dio. Nakon 4 h inkubacije na sobnoj temperaturi uz konstantnu rotaciju, palmitoilirani proteini su eluirani s 50 mM DTT u 1 x puferu za uzorke i sakupljeni za SDS-PAGE.

Western blotting. Mjerenje palmitoiliranog lAR. Uzorci prikupljeni iz RAC-a stavljeni su na 4-20 postotni tris-glicinski gel i prebačeni na nitroceluloznu membranu nakon elektroforeze. Nakon blokiranja od 1 h na sobnoj temperaturi, alAR je ispitivan zečjim anti-lAR primarnim antitijelima (1:500) preko noći na 4 stupnja. Nakon tri puta ispiranja s TBST, membrana je inkubirana s IRDye800CW magarećim anti-zečjim sekundarnim protutijelom (1:20, 000) 45 minuta na sobnoj temperaturi.

Mjerenje fosforilacije ERK. Bubrežne arterije su lizirane u 1 x RIPA koja sadrži inhibitore proteaze i fosfataze. Membrana je ispitivana zečjim anti-ERK (1:1000) i mišjim anti-fosforiliranim ERK (1:1000) protutijelima. IRDye800CW magareća anti-mišja i IRDye680RD magareća anti-zečja antitijela korištena su za sekundarnu inkubaciju (1:20,000). Membrane su snimljene i analizirane pomoću Li-COR Odyssey CLx.

Procjena vazoreaktivnosti putem žičane miografije. Mišje bubrežne arterije. Bubrežne arterije（{{0}} μm u promjeru) izolirane su iz WT i Zdhhc21dp/de miševa i uronjene u ledeno hladnu oksigeniziranu (95 posto O,/5 posto CO.) fiziološku otopinu soli (PSS,13{ {47}} mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,18 mM KH, PO, 1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukoze, 0,026 mM EDTA i 1,6 mM CaCl, pH 7,4). Segmenti žila (~ 2 mm duge) montirane su na žičanu miografsku komoru (Living Systems Instrumentation, VT, SAD) između dvije volframove žice (promjera 30 um). Izometrijska napetost zabilježena je pomoću uređaja za podešavanje signala Living Systems (MYO-SC-1) u kombinaciji sa softverom LabScribe v4 iWorks. Nakon uspostavljanja ravnoteže tijekom 30 minuta na 37 stupnjeva Cin PSS, postupak normalizacije je proveden kako bi se odredio optimalni unutarnji opseg L,=0.9×L(Lo=unutarnji opseg koji odgovara transmuralnom tlaku od 100 mmHg) . Zatim je testirana vitalnost žile sa 60 mMKPSS (74,7 mM NaCl, 60 mM KCl, 1,18 mM KH, PO.1,17 mM MgSO.7H, O, 14,9 mM NaHCO, 5,5 mM glukoze, 0,026 mM EDTA, 1,6 mM CaCl, pH 7.4). Arterije koje nisu reagirale na KPSS su odbačene. Arterije su tretirane rastućim koncentracijama fenilefrina（10 nM-30 μM）. Endotelni integritet je zatim procijenjen pomoću acetilkolina（10 µM）. Konstruirane su krivulje koncentracija-odgovor.

Male arterije iz ljudskih bubrega. Male arterije (~1000 um u promjeru) su secirane iz intaktnih živih ljudskih bubrega koji su odbijeni za operaciju transplantacije. Segmenti krvnih žila (~2 mm dugi) montirani su na I-šipke (250 um u promjeru) komore žičane miografije. Slični postupci ekvilibracije i normalizacije provedeni su na ljudskim arterijama. Zatim su arterije inkubirane s vehikulum kontrolom (0,02 posto DMSO u PSS) tijekom 1 sata. Žile su zatim testirane na održivost sa 60 mM KPSS i tretirane rastućim koncentracijama fenilefrina (10 nM-30 uM). Nakon ispiranja, posude su inkubirane s 2-BP (100 uM) 1 h; vitalnost krvnih žila je tada ponovo testirana sa 60 mM KPSS sa 100 uM 2-BP. Male arterije bez ili sa smanjenim odgovorom na KPSS su odbačene. Arterije su zatim izazvane istim koncentracijama fenilefrina, a zatim acetilkolina (10 uM). Konstruirane su i uspoređene krivulje koncentracija-odgovor arterija tretiranih s nosačem ili 2-BP-om.

Imunofluorescencija. Ljudske bubrežne arterije fiksirane su u 10 postotnom formalinu tijekom 48 sati, umetnute u parafin i izrezane. Slajdovi su zatim deparafinizirani, rehidrirani i permeabilizirani PBS-om koji je sadržavao 0,05 posto Triton X-1002. Nakon blokiranja, stakalca su obilježena zečjim anti-DHHC21 i kozjim anti-lAR antitijelima (1:100) preko noći na 4 stupnja C. Nakon ispiranja, sekundarna inkubacija antitijela je učinjena s magarećim anti-zečjim Alexa Fluor 488 i magarećim anti-kozjim Alexa Fluor 568 (1:500). Nakon montaže s ProLong Diamond medijem za montažu s DAPI, stakalca su snimljena Leica SP8 spektralnim invertnim laserskim skenirajućim konfokalnim mikroskopom.

Statistička analiza. Detaljne informacije (npr. naziv testa, post-hoc test, n vrijednost, alfa razina, p-vrijednost) za svaki statistički test navedene su u Dodatnoj tablici S2. Svi podaci zadovoljavaju pretpostavku normalne distribucije. Test normalnosti proveden je pomoću Shapiro-Wilkovog testa s alfa razinom postavljenom na 0.05. Usporedbe između dviju skupina analizirane su pomoću Studentovog t-testa (dvosmjerni), a tri ili više skupina uspoređene su putem jednosmjerne ANOVA-e s Tukeyevom post-hoc analizom. Usporedba za krivulje žičane miografije izvedena je pomoću dvosmjerne ANOVA.p<0.05 was="" used="" for="" statistical="" significance.="" all="" statistical="" analyses="" were="" performed="" using="" graphpad="" prism="" 7.0d="" (san="" diego,="" ca,="" usa).="" the="" actual="" values="" for="" all="" quantification="" results="" are="" listed="" in="" supplementary="" table="">