Dio 1: Učinci izorhamnetina na dijabetes i s njime povezane komplikacije: Pregled in vitro i in vivo studija i post hoc analiza transkriptoma uključenog molekularnog puta

Za više informacija. kontakttina.xiang@wecistanche.com

Sažetak: Dijabetesmelitus, posebno tipa 2 (T2DM), veliki je javnozdravstveni problem na globalnoj razini. DM karakteriziraju visoke razine glikemije i inzulinemije zbog poremećenog lučenja inzulina i osjetljivosti stanica na inzulin, poznate kao inzulinska rezistencija. T2DM uzrokuje višestruke i teške komplikacije kao što su nefropatija, neuropatija i retinopatija uzrokujući oksidativno oštećenje stanica u različitim unutarnjim tkivima, posebice gušterači, srcu, masnom tkivu, jetri i bubrezima. Ekstrakti biljaka i njihove bioaktivne fitokemikalije sve su zanimljiviji kao nove terapijske i preventivne alternative za T2DM i s njim povezane komplikacije. U tom smislu, izorhamnetin, biljkaflavonoid, dugo su proučavani njegovi potencijalni učinci protiv dijabetesa. Ovaj pregled opisuje njegov utjecaj na smanjenje poremećaja povezanih s dijabetesom smanjenjem razine glukoze, poboljšanjem oksidativnog statusa, ublažavanjem upale i moduliranjem metabolizma lipida i diferencijacije adipocita reguliranjem uključenih signalnih putova prijavljenih u studijama in vitro i in vivo. Dodatno, uključujemo post hoc analizu transkriptoma cijelog genoma bioloških aktivnosti izorhamnetina pomoću alata temeljenog na matičnim stanicama.

Ključne riječiizorhamnetin; kvercetin; biološke aktivnosti; dijabetes; molekularni putovi; mikromreža

Kliknite ovdje da saznate više kontakata

1. Uvod

Biljke se od davnina koriste kao tradicionalni lijekovi na gotovo svim kontinentima svijeta. Znanstveno istraživanje razloga njihove medicinske upotrebe dovelo je do istraživanja bioaktivnih molekula. Ekstremofilne biljke koje rastu u ekstremnim okolišnim uvjetima smatraju se dobrim potencijalnim izvorom zanimljivih bioaktivnih molekula. Zapravo, ova ograničenja okoliša uzrok su disfunkcionalnog metabolizma kisika, što dovodi do oksidativnog stresa povećanjem reaktivnih vrsta kisika (ROS)[1,2]. Neke biljke, kao što su halofiti, imaju snažanantioksidanssustav za uklanjanje ovih štetnih spojeva. Među bioaktivnim molekulama od interesa su fenolni spojevi. Nekoliko je studija vrednovalo biljke bogate polifenolima sa ili bez restriktivnih uvjeta u laboratoriju [3-10]. Nekoliko bioloških učinaka pripisuje se ekstraktima bogatim polifenolima, poput protuupalnih i antikancerogenih aktivnosti [11-13]. Druge studije pokazale su antioksidativne, antimikrobne [8,14-16] kao i učinke izorhamnetina protiv pretilosti, dijabetike i hepatičke steatoze [17-19]. Među ovim polifenolima,flavonoidirazlikuju se. Ova skupina uključuje nekoliko podskupina, kao što su flavonoli. Izorhamnetin je jedan od glavnih spojeva flavonola. Izorhamnetin je monometoksi flavon ili O-metilirani flavonol iz klase flavonoida. to jekvercetinu kojem metoksi skupina zamjenjuje hidroksi skupinu na položaju 3'. Neki derivati ​​izorhamnetina prisutni su u prirodi, kao što je izorhamnetin 3-O- -d-glukopiranozid, izorhamnetin 3-O-neohesperidozid i izorhamnetin 3-O-rutinozid iz Calendula officinalis L [20]. Izorhamnetin ima značajna biološka svojstva kao što su antioksidativno [21], antikancerogeno [22], antimikrobno [23], antivirusno [24], protuupalno i antidijabetičko djelovanje [21,25-33].

U ovom pregledu, prvi fokus je na podrijetlu, kemijskoj strukturi, metodama izolacije i ekstrakcije, kao i fitokemijskom aspektu izorhamnetina. Zatim, u drugom dijelu, fokusiramo se na opisivanje potencijalnih antidijabetičkih učinaka ovog flavonola kroz smanjenje poremećaja povezanih s dijabetesom smanjenjem razine glukoze, poboljšanjem oksidativnog statusa, ublažavanjem upale i modulacijom metabolizma lipida i diferencijacije adipocita. Konačno, izvršili smo sekundarnu analizu naših prethodno objavljenih podataka o mikronizu cijelog genoma kako bismo istražili bioaktivnosti izorhamnetina povezane s dijabetesom u alatu temeljenom na matičnim stanicama. Također nam je cilj istaknuti učinak ove molekule na regulaciju uključenih signalnih putova izvještavanjem o in vitro i in vivo studijama koje se koriste u ovom polju istraživanja. U ovom pregledu izložili smo karakteristike antidijabetičkog djelovanja izorhamnetina u usporedbi skvercetinkoji se smatra metabolitom izorhamnetina i važnom referencom u prirodnom liječenju dijabetesa.

2. Opći pregled bioaktivnih molekula u posebnim polifenolima i flavonoidima

2.1. Oksidativni stres kao izvor bioaktivnih molekula u biljkama

Nekoliko biljaka može biti izloženo različitim uvjetima okoliša (slanost, suša, UV zrake, teški metali, ekstremne temperature, nedostatak hranjivih tvari, onečišćenje zraka i napadi patogena). Ova su ograničenja izvor disfunkcija metabolizma kisika, koji stvaraju oksidativni stres povećanjem reaktivnih vrsta kisika (ROS). Molekula kisika (O2) igra važnu ulogu u fotosintetskim organizmima. Izvorno, u višim biljkama i algama, izmjena plinova koja uključuje elektrone događa se u kloroplastima hvatanjem ugljičnog dioksida tijekom dana i proizvodnjom kisika. Ova izmjena plinova uključuje elektrone. Doista, u slučaju ozbiljnih ograničenja okoliša, velik dio kisika se ne reducira i stoga može generirati ROS u nekim organelama iz biljnih stanica [1,2] zbog neravnoteže u pravilnom funkcioniranju kloroplasta i prijenosu elektrona [ 1]. Štoviše, pod gore navedenim ograničenjima okoliša, proizvode se mnogi ROS-ovi, kao što su hidroksilni radikal (OH), superoksidni anionski radikal (O,-), alkoksilni i peroksilni radikali (RO: odnosno RO2), vodikov peroksid (H2O2, ), hipokloritni radikal (-OCl), singletni kisik (O2), radikal dušikovog oksida (NO) i drugi lipidni peroksidi (kao što su malondialdehid i 4-hidroksinonenal)[2,34,35]. Ponekad, ROS može imati ulogu u staničnoj signalizaciji u fiziološkom ponašanju biljaka, na primjer u procesu rasta i razvoja sjemena, razvoju tkiva i prijelazu od stanične proliferacije do stanične elongacije tijekom ranijih faza diferencijacije [36] . Na visokoj razini, te molekule uzrokuju molekularno oštećenje kao što je lipidna peroksidacija membrana, promjena proteina i DNA te stanična smrt [1,35,37]. Neke biljke, kao što su halofiti, imaju sposobnost dobrog prilagođavanja tim uvjetima putem snažnog antioksidativnog sustava. Poznato je da su halofiti izvor sekundarnih metabolita kao što su polifenoli [3-10]. Ovi autori pokazuju da se u teškim uvjetima sintetiziraju polifenoli koji igraju važnu ulogu u zaštiti od oksidativnog oštećenja izazvanog stresom. Biosinteza, sadržaj i aktivnosti ovih fenolnih spojeva funkcija su nekoliko vanjskih (svjetlost, temperatura, salinitet i suhoća) i unutarnjih (genotip, organ i stupanj razvoja) parametara koji utječu na njihov sadržaj i distribuciju u biljkama [ 8,38,39]. Na primjer, kod Pyracantha coccinea neki flavonoidi poput flavanona, flavona i flavonola prisutni su u izdancima tijekom vegetativne faze, au korijenu isključivo tijekom reproduktivne 40]. S druge strane, nekoliko je autora pokazalo da ti fenolni spojevi imaju druga biološka svojstva kao što su protuupalna i antikancerogena [11-13]. Druge studije pokazale su antioksidativne, antimikrobne [8,14-16] kao i antidijabetičke [18,41,42] učinke fenolnih ekstrakata.

2.2. Klasifikacija prirodnih antioksidansa

Antioksidativni sustav može se klasificirati prema prirodi ovih komponenti u enzimske i neenzimske spojeve. Prvi uključuju superoksid dismutazu (SOD), katalazu (CAT), askorbat peroksidazu i glutation reduktazu [1,3542-44]. Geni koji se odnose na te enzime otkrili su njihovu važnost tijekom fiziološkog pogoršanja skladišnog korijena nakon žetve i kao odgovor na osmotski stres i apscizinsku kiselinu, kao i infekciju bakterijom Xanthomonas axonopodis [44]. Druga skupina sadrži uglavnom fenolne spojeve, karotenoide, vitamine i osmolite [1]. Fenolne spojeve karakterizira prisutnost jednog ili više benzenskih prstenova i razlikuju se po složenosti bazne molekule, broju i položaju hidroksila te stupnju polimerizacije. Ovi spojevi su sekundarni metaboliti koji spadaju u tri široke skupine: fenolne kiseline (derivati ​​benzojeve i cimetne kiseline), flavonoidi (flavonoli, flavonoli, flavanoni, flavoni, antocijanini) i tanini (hidrolizabilni tanini i proantocijanidini). Osim ovih molekula, razlikuju se i stilbeni, lignani i kumarini [45].

2.3. Podrijetlo i biokemijska struktura flavonoida, posebno izorhamnetina

Fenolni spojevi su sekundarni metaboliti koji prevladavaju u biljkama. Ovi spojevi imaju aromatski prsten s jednom ili više hidroksilnih skupina (OH) i sadrže molekule u rasponu od jednostavnih fenolnih kiselina do polimeriziranih spojeva kao što su tanini. Sinteza fenolnih spojeva je složen proces koji prolazi kroz nekoliko faza. Fenolni spojevi su bioaktivne molekule s dva puta nastanka: s jedne strane shikiminska kiselina, a s druge strane molekule fenilpropanoida. Biosinteza flavonoida kao što je izorhamnetin temelji se na tim putevima. Zapravo, s jedne strane, shikimat daje osnovni kostur polifenola koji imaju jedan ili više benzenskih prstenova (C6) koji nose jednu ili više hidroksilnih funkcija. S druge strane, postoji sinteza C6-C3 baze koja nastaje kondenzacijom fenilalanina u cimetnu kiselinu (Slika 1)[46].

Točnije, šikiminska kiselina je u osnovi nekoliko reakcija, predstavlja kostur aromatskih aminokiselina, koje su inicijatori fenolnih spojeva. Prvi korak sastoji se od kombinacije dviju molekula: fosfoenolpiruvata i eritroza 4-fosfata, koje nakon četiri reakcije dovode do stvaranja prvog kostura fenola: šikimata ili šikiminske kiseline (CHoOs). Ovo kasnije predstavlja prvi prsten, koji karakterizira fenole s dvije hidroksilne skupine. Šikimat prolazi kroz šest reakcija koje završavaju u prvoj aminokiselini: fenilalaninu. Zahvaljujući dvama ključnim enzimima, fenilalanin amonijak-liazi (PAL) i cinamat-4-hidroksilazi (C4H), fenilalanin sukcesivno tvori cinamat i p-kumarat. U ovom koraku razina aktivnosti PAL-a mogla bi kvantitativno regulirati nakupljanje fenolni spojevi. Molekula p-kumarata je izvor derivata kumarina. Put za sintezu molekula fenilpropanoida karakterizira prisutnost ključnog enzima koji se zove 4-kumarat CoA ligaza (4CL), koji katalizira u prisutnosti tiolne funkcije koenzima A(CoA) p-kumaričnu kiselinu kiseline u 4-kumaroil CoA(C30Ha2N-O18P, S). Aromatični A-prsten flavonoida nastaje kondenzacijom triju molekula malonil-CoA (-C6).

Potom je 4-kumaroil CoA proizveo naringenin kalkon, objašnjavajući vezu između aromatskog B-prstena i 3C prstena kalkona (C6-C3-). Halkon je ključni element u ovoj temi jer je preteča svih flavonoida koji se temelje na skeletu od petnaest ugljika koji se sastoji od dva benzenska prstena. Nakon toga, kalkon se pretvara u naringenin (koji se također naziva flavanon ili trihidroksi flavon) djelovanjem kalkon izomeraze (CHI). S jedne strane, flavoni kao što su apigenin, akacetin, krizin ili luteolin sintetiziraju se iz naringenina u prisutnosti flavona sintaza (FNS). S druge strane, različiti flavonoli i spojevi jantarne kiseline proizvode se iz naringenina u prisutnosti dvaju enzima; flavanon 3-dioksigenaza (F3D) i flavonol sintaza (FS). Osim derivata flavonola, proizvode se i drugi spojevi, kao što su kemferol, miricetin i kvercetin. Prijenosom metilne skupine sa S-adenozil-L-metionina, izorhamnetin se proizvodi u prisutnosti flavon 3'-O-metiltransferaze (FMT)[47,48]. Zatim, izorhamnetin je monometoksi flavon ili O-metilirani flavonol iz klase flavonoida. To je kvercetin (prekursor) u kojem je hidroksi skupina na položaju 3' zamijenjena metoksi skupinom. Neki derivati ​​izorhamnetina prisutni su u prirodi, kao što je izorhamnetin 3-O- -d-glukopiranozid, izorhamnetin 3-O-neohesperidozid i izorhamnetin 3-O-rutinozid iz Calendula officinalis L .[20].

Zapravo, flavonoidi se smatraju jednom od najvažnijih skupina iz obitelji polifenola. Imaju strukturu koja se temelji na difenil propanskom tipu s dva benzenska prstena (prsten A i B, vidi sliku 2) povezana lancem od tri ugljika koji tvori zatvoreni piranski prsten (C prsten). Stoga se njihova struktura naziva C6-C3-C6. Pozicije O-glikozilacije su C7 u flavonima, izoflavonima, flavanonima i flavonolima, te C3 u flavonolima i antocijanidinima. Pozicije C-glikozilacije su C6 i C8 u flavonima [49]. Osim toga, važnost antioksidativne uloge fenolnih spojeva povezana je sa stupnjem hidroksilacije molekule. Flavonoidi uključuju izoflavone, flavone, flavanone i njihove glikozide i flavonole kao što je izorhamnetin, koji se također naziva 3'-metoksi kvercetin i 3-metil kvercetin [50]. U biljkama je enzim, UDP-ovisne glikoziltransferaze, odgovoran za glikozidni oblik izoramnetina (izorhamnetin 3-O-glukozid). Ovaj enzim koristi nukleotidne difosfatne šećere, obično uridin difosfatne (UDP) šećere, za prijenos metilne skupine u ciklus i povezivanje glikozidne funkcije s izorhamnetinom [51].

2.4. Izolacija i analiza ilsorhamnetina podrijetlom iz ljekovitog bilja

Rasprostranjenost izorhamnetina u ljekovitom bilju vrlo je široka, a metode ekstrakcije i analize su raznolike. Posebno su traženi derivati ​​izorhamnetina. Hidroksilne i metilne skupine pomažu u njihovoj karakterizaciji. Neke se metode koriste za ekstrakciju izorhamnetina, među njima se temelje na frakcioniranju, korištenjem kemometrijskih pristupa, enzima i ekstrakcije superkritične tekućine (SFE-CO2). Prvo, frakcioniranje se može koristiti za pojednostavljenje ekstrakcije uklanjanjem svih ulja i lipofilnih pigmenata iz uzoraka koji sadrže lipide. Odmašćeni uzorak također se sonicira prije maceracije u mješavini metanola i vode. Kromatografija se zatim može koristiti za analizu fenolnih spojeva, posebno flavonoida [49]. Za ove posljednje spojeve koristi se LC-MS i često se primjenjuju elektrosprejna ionizacija (ESI) i kemijska ionizacija pod atmosferskim tlakom, a najbolja osjetljivost za flavonoide općenito se postiže u načinu rada s negativnim ionima [49]. Na primjer, procijenjena je fitokemija biljnih frakcija Calligonum Azel Maire, prikupljenih iz pustinje Tunisa, a tekućinska kromatografija ultravisoke učinkovitosti povezana s četverostrukom masenom spektrometrijom vremena leta UHPLC-ESI-QTOF korištena je za identifikaciju fenola među njima i flavona. i flavanoli, koji su bili najzastupljeniji identificirani fenolni spojevi [52]. Točnije, prisutnost izorhamnetin glukozida i izorhamnetin glukozil-ramnozida potvrđena je kao glavnih spojeva u lišću jestivog halofita Mesembryanthemum edule pomoću LC/ESI-MS/MS tehnologije [3]. Ovaj rad su slijedili drugi koji su koristili LC-ESI-TOF-MS za karakterizaciju mnogih polifenola; među njima, flavonoidi su identificirani iz nadzemnih dijelova faze punog cvjetanja halofita kao što su Arthrocnemum indicum [5], Tamarix gallica [16], Glaucium flavum [13] i Salsola kali [8]. Slično prethodnim radovima, LC-ESI-TOF-MS i GC-MS profiliranje Artemisia herbal provedeno je kako bi se identificirali fenoli, kao što su flavoni, flavonoli i flavonoidni alkaloidi[7]. Drugi rad je proveden na Pancratium maritimum i analiza pomoću HPLC-DAD-ESI/MS otkrila je prisutnost flavonoida uključujući flavonol kao izorhamnetin s njihovim pentoksidnim i heksozidnim konjugatima kao što je izorhamnetin di-heksozid [53].

Kao nemasni spoj, flavonoli se mogu izolirati heksanom. Zatim se može koristiti polarno otapalo kao što je etanol. Studija na Limoniastrum guyonianum pomoću HPLC-a pokazala je prisutnost mnogih fenola, među njima izorhamnetin-3-O-rutinozida [54].

Daleko od fenolnih ekstrakata, fenolni spojevi se također nalaze u uljima kao što je maslinovo ulje [55]. Ovi spojevi imaju sposobnost zaštite ulja od oksidacije i poboljšavaju hranjivu vrijednost ulja. Izorhamnetin, kao fenolni spoj, također je otkriven u uljnom ekstraktu sjemenki tuniskog crnog kima (Nigella sativa L.) dobivenog sa zelenim otapalom kao što je 2-metil tetrahidrofuran (MeTHF) kao alternativa petroleju ili heksanu otapalo na bazi ulja za ekstrakciju fenolnih spojeva obogaćenih uljem [10]. Prisutnost izorhamnetina potvrđena je HPLC analizom. Analize pomoću tekućinske kromatografije s detektorom s nizom dioda (LC-DAD) otkrile su visoku količinu izorhamnetina u rasponu između 6,3 i 6,6（ug/g ulja） nakon ekstrakcije ulja iz crnog kima pomoću MeTHF-a i heksana. Osim toga, koristeći H nuklearnu magnetsku rezonanciju (HNMR) i C nuklearnu magnetsku rezonanciju (CNMR), neki flavonolni glikozidi kao što su kemferol-3-O-rutinozid (nikotiflorin) i izorhamnetin-3-O-rutinozid (narcisizam) karakterizirani su iz nadzemnih dijelova Peucedanum aucheri Boiss prikupljenih u gradu Marivan, pokrajina Kurdistan, Iran [56]. NMR metoda otkriva svojstvo da određene atomske jezgre spoja djeluju u interakciji s magnetskim poljem. Ovo svojstvo, a to je stvaranje magnetske rezonancije na određenoj frekvenciji, daje informacije o strukturi molekule. Drugo, odabrani su matematički modeli za procjenu učinkovitosti ekstrakcije flavonola, posebno za razumijevanje najboljeg načina dobivanja izorhamnetin-3-O-rutinozida [20]. Provedena je multivarijatna faktorska analiza korištenjem cvjetova Calendula officinalis. Analizirani su linearni, kvadratni, puni kubni i specijalni kubni modeli. Konačni puni kubik bio je najprikladniji, omogućavajući veću učinkovitost u ekstrakciji izorhamnetin-3-O-rutinozida za 60 posto. Za ovu studiju, enzimi, Rapides Maxi Fruit i Viscozyme korišteni su pod nekim važnim čimbenicima koji utječu na aktivnost enzima pod superkritičnim CO2 uvjetima kao što su tlak, temperatura, pH, vrijeme i vodena otopina etanola. Konačno, metoda ekstrakcije superkritične tekućine korištena je za ekstrakciju fenolnih spojeva kao što su flavonoli. Prije mnogo godina prvi je put korišten postupak ekstrakcije superkritične tekućine na kori Eucalyptus globulus, koristeći čisti i modificirani CO2 s vodom, etil acetatom i etanolom [57]. Autori su pokazali da superkritični CO2 u kombinaciji s etanolom može ekstrahirati značajne količine fenolnih spojeva, uključujući izorhamnetin. HPLC-MS kvantifikacija odredila je neke flavonole, kao što je izorhamnetin-heksozid (0,26 gg-I ekstrakta) i jednostavni izorhamnetin (14,29 mg:gI ekstrakta). Etanol je korišten kao kootapalo. Kvantifikacija je provedena visokotlačnom tekućinskom kromatografijom opremljenom fotodiodnim detektorom. Izorhamnetin 3-O-glukozil-ramnozil-ramnozid, izorhamnetin 3-O-glukozil-ramnozil-pentoksid, izorhamnetin 3-O-glukozil-ramnozid i izorhamnetin 3-O-glukozil -pentoksid bili su najzastupljeniji flavonoli ekstrahirani iz superkritičnih ekstrakata O. ficus-indica. Kao što je prije spomenuto, visokotlačna tekućinska kromatografija ili HPLC je često korištena metoda za analizu fenolnih spojeva. U soku od jabuke i soku od kruške otkriven je izorhamnetin 3-O-glukozid. Zapravo, odvajanje flavonolnih glikozida u ekstraktu jabuke "Brettacher" pomoću HPLC-a i masene spektrometrije otkrilo je prisutnost dva oblika glikozida kao što su izorhamnetin 3-O-glukoza i izorhamnetin 3-O-galaktozid [ 58].