Dio Ⅰ Kelator željeza, PBT434, modulira transcelularni promet željezom u mikrovaskularnim endotelnim stanicama mozga

Sažetak

Željezo i drugi prijelazni metali, kao što su bakar i mangan, neophodni su za podržavanje funkcije mozga, no prekomjerno nakupljanje je citotoksično. Ovo prekomjerno nakupljanje metala, osobito željeza, zajedničko je za nekoliko neuroloških poremećaja; to uključuje Alzheimerovu bolest, Parkinsonovu bolest, Friedrichovu ataksiju i druge poremećaje koji se manifestiraju neurodegeneracijom i povezanim nakupljanjem željeza u mozgu. Upravljanje protokom željeza pomoću krvno-moždane barijere pruža prvu liniju obrane protiv prekomjernog nakupljanja željeza u normalnoj fiziologiji i ovim patološkim stanjima. U ovoj smo studiji utvrdili da kelator željeza PBT434, koji se trenutno razvija za liječenje Parkinsonove bolesti i atrofije višestrukih sustava, modulira unos željeza mikrovaskularnim endotelnim stanicama ljudskog mozga (hBMVEC) kelacijom izvanstaničnog Fe^{2 plus}. Liječenje hBMVEC s PBT434 rezultira povećanjem količine transkripata za transferin receptor (TfR) i ceruloplazmin (Cp). Western blot i ELISA analize otkrivaju i odgovarajuće povećanje proteina. Unutar stanice, PBT434 povećava mjerljivu razinu dobrotvornog, labilnog Fe^{2 plus}; podaci pokazuju da je ovaj Fe^{2 plus}se oslobađa iz feritina. Osim toga, PBT434 potencira efluks željeza vjerojatno zbog povećanja citosolnog dvostrukog željeza, supstrata za izvoznika željeza, feroportina. PBT434 uspostavlja ravnotežu brzo i dvosmjerno preko hBMVEC krvno-moždane barijere. Ovi rezultati pokazuju da PBT434-kompleks željeza nije supstrat za unos hBMVEC i stoga podržavaju model u kojem bi PBT434 kelirao intersticijsko željezo i inhibirao ponovni unos željeza endotelnim stanicama krvno-moždane barijere, kao kao i inhibirati njegov unos od strane drugih stanica neurovaskularne jedinice. Sve u svemu, ovo predstavlja nov i obećavajući mehanizam za terapeutsku kelaciju željeza.

Kliknite ovdje za preuzimanjekoje su prednosti Cistanche

Uvod

Terapija keliranjem metala (MCT) dugo se koristi kao tretman za trovanje prijelaznim metalima i za genetske poremećaje u metabolizmu esencijalnog metalnog iona koji dovodi do prekomjerne akumulacije metala [1-3]. Dva primjera potonjeg su hiper-akumulacija bakra u Wilsonovoj bolesti [4] i željeza u nasljednoj hemokromatozi [5]. I bakar i željezo su katalizatori oksidativnog stresa i stoga su citotoksični u koncentracijama koje premašuju sposobnost stanice i organizma da 'prati' ove redoks-aktivne prijelazne metale [6, 7]. Konkretno, nakupljanje željeza je široko idiopatsko; doista, povećanje željeza znak je starenja mozga [8-10]. Patološki, ovo nakupljanje željeza u mozgu značajka je mutacija u genima koji nisu povezani s metabolizmom željeza [11-15] kao i niza drugih neurodegenerativnih bolesti, od kojih nekima nedostaje specifična genetska poveznica kao što je starenje [16], Alzheimerova bolest 17], Friedreichova ataksija [18] i Parkinsonova bolest [19]. Kao skupina, takvi se poremećaji mogu smatrati neurodegeneracijom s nakupljanjem željeza u mozgu (NBIA), iako je ova kratica obično ograničena na one za koje je identificirana genetska veza [11, 13, 14].

U slučaju preopterećenja željezom, cilj je 'očistiti' tijelo od viška željeza zbog kvara u staničnom unosu ili efluksu željeza. Ovdje je cilj nadmašiti fiziološke kelatore željeza s lijekom; spoj koji ima dobru farmakokinetiku i visok afinitet prema dvostrukom željezu ciljni je lijek. Budući da je tijelo prepuno esencijalnog metala, malo je zabrinutosti zbog izazivanja nedostatka tijekom liječenja. Liječenje cerebralne bolesti terapijom keliranjem željeza zahtijeva drugačiju strategiju. Ovo nije problem sistemskog preopterećenja željezom, već nakupljanja željeza u područjima patologije sa štetnim posljedicama nizvodno. Akumulacija željeza povezana sa starenjem kod Parkinsonove bolesti (PB), na primjer, potencijalno pridonosi staničnom oštećenju povezanom s oksidativnim stresom [20]. Pretjerano labilno željezo potiče pogrešno savijanje -sinukleina u neuronima substancije crne. Korištenje kelatora visokog afiniteta može dovesti do određenog smanjenja opterećenja mozga željezom, ali će sasvim sigurno izazvati nedostatak željeza koji je barem u starijoj populaciji kontraindiciran s obzirom na sustavni nedostatak željeza koji je uobičajen za tu dobnu skupinu [21] . Kelator s optimalnim afinitetom ima potencijal smanjiti nakupljanje željeza kao i popratni oksidativni stres zbog viška labilnog željeza i temeljnih bolesti.

Cistanche tubulosaiCistancheovi učinci

Jedan kelator odobren za upotrebu u liječenju preopterećenja željezom izazvanog transfuzijom kod pacijenata s talasemijom je deferipron (DFP, robna marka Ferriprox) [5, 22]. DFP se također koristi u liječenju Friedreichove ataksije [23] i Parkinsonove bolesti [24, 25]. U meta-analizi se pokazalo da DFP osigurava značajno smanjenje sadržaja željeza u miokardu, kao i veću zaštitu srca kod pacijenata s talasemijom od deferoksamina, klasičnog sredstva za keliranje željeza [5]. S druge strane, DFP se brzo metabolizira u jetri [26], a noviji radovi su pokazali da kelira Fe2 plus na aktivnom mjestu histonskih lizin demetilaza ovisnih o željezu, aktivnost koja je u korelaciji s prethodno neprepoznatom citotoksičnošću [27]. Ovo otkriće naglašava ključno ograničenje u korištenju kelacijske terapije željeza, naime natjecanje lijeka za fiziološki esencijalno željezo, bilo u zalihama željeza ili proteinu koji sadrži protetičku vrstu željeza. Unatoč tome, DFP je, na primjer, pokazao učinkovitost u Fazi 2 ispitivanja Parkinsonove bolesti, što pokazuju i analitički (smanjeno opterećenje mozga željezom prema T2- ponderiranom MRI) i bihevioralni indeksi (kognitivna i motorička funkcija neurona) [ 24, 25].

Međutim, afinitet DFP-a za Fe3 plus ostaje problem. Stabilna vrsta DFP-željeza je tris-kompleks [Fe(DFP)3] 0 [28]. Dok je neutralnost ovog kompleksa idealna za mobilizaciju željeza iz stanice, konstanta stabilnosti za njega, ~1037, čini DFP pravim čistačem željeza; u ovom kontekstu, njegova inhibicija enzima željeza poput lizin demetilaze je predvidljiva [27]. Ova zabrinutost odražava potrebu za razvojem kelatora željeza koji imaju propusnost membrane kao DFP, ali znatno slabiji afinitet za Fe2 plus i Fe3 plus. Ova potonja značajka ograničava uklanjanje lijeka s protetskog metala i termodinamički potencijal kelirajućeg agensa da katalizira autooksidaciju dvostrukog željeza koja rezultira proizvodnjom reaktivnih vrsta kisika. U biti, jaki kelatori feri-željeza kataliziraju prooksidativna svojstva Fe2 plus [29]. U ovoj studiji izvješćujemo o tome kako takav kelator željeza s umjerenim afinitetima prema feri i fero željezu modulira protok željeza u mikrovaskularnim endotelnim stanicama mozga koje tvore krvno-moždanu barijeru (BBB).

Cistanche pilule

Ovaj lijek, PBT434 [5,7-dikloro-2-((metilamino)metil)-8-hidroksi-3-metilkinazolin-4 (3H)-on, slika 1A] , tvori bis-željezni kompleks s logaritamskim konstantama stabilnosti od ~11 i ~15 za Fe^{2 plus}i Fe^{3 plus}, odnosno [30]. PBT434 spriječio je gubitak neurona substantia nigra pars compacta (SNpc), smanjio akumulaciju nigralnog sinukleina, smanjio sadržaj željeza u srednjem mozgu povezan s modelom PD bolesti i spasio motoričke performanse u dva mišja modela Parkinsonove bolesti bez ikakvog očitog iscrpljivanja sistemskih zaliha željeza [30]. PBT434 je također učinkovit u mišjim modelima višestruke sistemske atrofije (MSA) [30, 31], motoričkog poremećaja koji je u prezentaciji sličan Parkinsonovoj bolesti, ali koji je karakteriziran pogrešnim savijanjem -sinukleina i kasnijom akumulacijom koja uzrokuje stvaranje glijalnih citoplazmatskih inkluzija koje su zaštitni znak patologija bolesti [32]. Značajno je da je PBT434 smanjio markere oksidativnog stresa u mišjim PD modelima [30] što ukazuje da 1) PBT434 cilja na zalihe željeza koje su inače bile pripremljene da funkcioniraju kao prooksidansi i 2) PBT434 nije potencirao ovu nastalu citotoksičnost temeljenu na oksidaciji. PBT434 je na zadovoljavajući način završio studiju 1. faze [33].

Ovdje predstavljeni rad osmišljen je kako bi ispitao utjecaj PBT434 na trgovinu željezom u stanicama moždane barijere, mikrovaskularnim endotelnim stanicama koje zajedno s glijom koja se nalazi ispod njih tvore krvno-moždanu barijeru. Ove studije su koristile dobro validiranu besmrtnu endotelnu staničnu liniju u jednoslojnom i transwell formatu kulture [34-37]. Primarni cilj ovih studija bio je utvrditi kinetiku unosa i istjecanja željeza iz tih stanica i njihovu modulaciju PBT434. Transwell BBB model također je korišten za demonstraciju dvosmjernog transcelularnog toka PBT434 kroz barijeru endotelnih stanica. Model je u molekularnom smislu pokazao da PBT434 inhibira unos željeza keliranjem dok stimulira istjecanje željeza. Studije oslikavanja stanica pokazuju da PBT434 pristupa istom labilnom bazenu željeza ispitanom klasičnim Fe^{2 plus}kelirajući agens, 2,2'-bipiridin ili bipiridil, i fluorescentna sonda za dvovaljezno željezo. Rezultati upućuju na mogući mehanizam djelovanja za PBT434 koji uključuje inhibiciju unosa sistemskog željeza u BBB i naknadnu sekvestraciju moždanog željeza u intersticijalnom prostoru.

Rezultati

1. PBT434 nema citotoksične učinke na mikrovaskularne endotelne stanice mozga

Kako bismo odredili odgovarajući raspon radnih koncentracija za PBT434 u našoj in vitro kulturi stanica, upotrijebili smo MTT test za praćenje mitohondrijske funkcije hBMVEC kao odgovor na PBT434. Na temelju prethodnih izvješća [30], tretirani su rasponom koncentracija PBT434 do 100 μM tijekom 24 sata. Nismo primijetili značajne promjene u održivosti hBMVEC-a s bilo kojom testiranom koncentracijom (Slika 2).

2. PBT434 se brzo apsorbira i prenosi preko hBMVEC barijere

PBT434 je oralno bioraspoloživ lijek koji može lako prodrijeti u BBB, kao što se vidi u studijama provedenim na miševima i ljudima [30, 38, 39]. Pratili smo nakupljanje PBT434 u hBMVEC-u uzgojenom u jednoslojnim slojevima koristeći PBT434 obilježen 14C kao radiotracer. Podaci pokazuju da je u prvoj fazi 14C-PBT434 brzo uspostavio ravnotežu između medija za unos i stanice. Nakon ovog početnog unosa uslijedilo je dodatno sporo nakupljanje tijekom 3 sata koje je pokazalo brzinu od 30,1 ± 9,8 pmol/mg/h (Slika 3A). U protokolu unosa, unos se zaustavlja i stanice se isperu na 4˚C prije obrade za nakupljanje 14C-PBT434 (metode). U zasebnom eksperimentu ispitali smo istjecanje 14C-PBT434 iz hBMVEC nakon 30 minuta punjenja. U protokolu efluksa, stanice se ispiraju na 25˚C. Podaci na slici 3B pokazuju da je u ispiranju na 25˚C izgubljeno približno 92 posto stanično akumuliranog 14C-PBT434 (usp. 550 pmol 14C-PBT434/mg proteina u 3A na 30 min do 43 pmol 14C-PBT434/mg protein na t=0 u 3B). Došlo je do daljnjeg sporog gubitka preostalog 14C-PBT434 (Slika 3B). Podaci sugeriraju dva aspekta akumulacije i istjecanja PBT434 putem hBMVEC-a. Protok kroz plazma membranu brzo dostiže ono što se čini kao ravnoteža bilo tijekom unosa ili istjecanja. Međutim, u oba procesa pojavljuje se još jedan sporiji proces. Ovo sugerira da je unutar stanice neki dio stanice PBT434 na mjestu/stanju koje je u kinetičkom ravnotežnom odnosu s frakcijom u ravnoteži s izvanstaničnim miljeom. Kinetička analiza navedena na slici 3B procjenjuje da je ovaj skup PBT434 predstavljen sa 27±4 pmol/mg proteina u staničnom lizatu kada su stanice tretirane s 20 µM reagensa.

Kako bismo ispitali transcelularni tok PBT434, upotrijebili smo dobro validirani in vitro BBB model koristeći uzgoj na apikalnoj strani transwell membrane [35, 36, 40, 41]. Svojstva barijere ovih kultura u jažici potvrđena su kvantifikacijom njihovog transendotelnog električnog otpora (TEER) i nepropusnosti za dekstran obilježen FITC-om (Sl. S1). Usporedili smo unos 14C-PBT434 na luminalnoj (ili apikalnoj, krvnoj strani) (Slika 4A) s unosom na abluminalnoj (ili bazolateralnoj, moždanoj strani) (Slika 4C) membrani. U istom eksperimentu, odgovarajući efluks (transcelularni fluks) kvantificiran je pojavom 14C-PBT434 u efluksnoj komori (Slika 4 ploče B i D). Brzine ovih procesa dane su u tablici 1. Podaci o masi ilustrirani na slici 4 (ploče B i D) pokazuju da je neto protok PBT434 kroz ovaj model krvno-moždane barijere bio isti u oba smjera. Bilo je 976±185 pmol 14C-PBT434 akumulirano u bazalnoj komori (Slika 4B) i 1033±210 pmol kvantificirano u bazalnoj komori (Slika 4D). Ova skoro ekvivalencija također se odrazila na vrlo slične stope efluksa PBT434 na dvjema barijernim membranama (Tablica 1). Međutim, postojao je značajno veći unos PBT434 na bazolateralnoj membrani u ovom modelu barijere, kao što je ilustrirano ~50 posto većim gubitkom spoja iz bazalne komore (Slika 4C) što je odgovaralo ~40 posto većoj stopi prividnog unosa stanica (Stol 1). Predviđa se da će snažniji unos rezultirati većom akumulacijom. Analiza stanica nakon 3 sata pokazala je da su zadržale ~6 μM PBT434 bez obzira na smjer toka. Vrijednosti su bile 8,1±1,3 μM (apikalno do bazalno) i 4,7±1,2 μM (bazalno do apikalno). Kao što je gore navedeno, ova analiza slijedi nakon ispiranja stanica prije lize i kvantifikacije ukupnog staničnog proteina i 14C-PBT434. Uz to, medij u apikalnoj komori sadržavao je RPMI plus 10 posto FBS-a i 10 posto NuSeruma, dok je bazalna, 'moždana' komora sadržavala samo RPMI (metode). Razuman zaključak bio je da veći 'uptake' na bazalnoj membrani odražava adsorpciju PBT434 na površini stanice koja je u apikalnoj komori bila ograničena prisutnošću proteinskih komponenti u serumu. Nakon ispiranja stanica radi nakupljanja PBT434, ovaj adsorbirani materijal (koji je registriran kao 'uptake') je uklonjen. Ponavljanje ovog eksperimenta fluksa, ali sa serumom u bazalnoj komori, pokazalo je da je serum doista potisnuo ovu vjerojatnu adsorpciju PBT434 na staničnoj površini (S2 Slika).

3. PBT434, za razliku od bipiridila, ne ograničava intracelularnu dostupnost labilnog željeza

Budući da PBT434 ima umjereniji afinitet prema željezu u usporedbi s klasičnim kelatorima željeza kao što su deferipron ili bipiridil, ispitali smo kako se ta razlika odražava na učinak PBT434 na staničnu labilnu zalihu željeza (LIP) hBMVEC-a. Da bismo to učinili, iskoristili smo prednost propusnog, Fe^{2 plus}-specifična fluorescentna boja FerroOrange, koja reagira s dobrotvornim citoplazmatskim željezom. Vidjeli smo značajnu ablaciju fluorescencije u stanicama kada su tretirane bipiridilom, što je u skladu s keliranjem LIP-a pomoću ovog kelatora željeza i željeza visokog afiniteta i tako blokira djelovanje indikatora fluorescentnog željeza (Slika 5A). Nasuprot tome, PBT434 nije se natjecao s FerroOrangeom za Fe^{2 plus}, ponašanje u skladu s njegovim umjerenijim afinitetom [30]. Rezultati su pokazali da je PBT434, ali ne i PBT434-met neaktivni derivat, inducirao povećanje od 34 ± 9 posto u FerroOrange dostupnom Fe^{2 plus}sugerirajući da ovaj kelatni agens mobilizira željezo unutar stanice bez istodobne toksičnosti. Podaci prikazani u nastavku sugeriraju da je ovo željezo potjecalo iz feritina.

Prethodno je pokazano da PBT434 obnavlja iscrpljenu ekspresiju proteina feroportina u miševa tretiranih MPTP-om na razinu sličnu onoj kod miševa bez ozljeda [30]. Ovaj rezultat, zajedno s povećanjem intracelularnog obojenja željezom kao odgovor na PBT434, sugerirao je potencijalni učinak na stanični sustav odgovora na željezo i funkciju nizvodnih proteina povezanih sa željezom. Kako bismo to procijenili, prvo smo proveli kvantitativnu PCR (qPCR) analizu učinka PBT434 na obilje transkripata za nekoliko proteina koji rukuju željezom (Slika 6). Dok su transkripti za protein efluksa željeza, feroportin (Fpn) i dva citoplazmatska željezna šaperona, PCBP1 i 2, ostali nepromijenjeni, obilje mRNA za transferinski receptor (TfR) i feroksidazu, ceruloplazmin (Cp), učinilo je promijeniti. Transkripti TfR i Cp povećali su se za 2,8 odnosno 3{13}}puta. Ekspresija receptora transferina (TfR) povezana je sa sustavom elementa koji reagira na željezo (IRE)/regulacijskih proteina željeza (IRP) [42-44]. Povećanje TfR mRNA sugerira da se PBT434 natječe s isporukom željeza ovisnom o PCBP1-za sastavljanje Fe,S klastera koji pretvara regulatorni IREBP iz proteina koji veže RNA u citosolnu akonitazu [45]. Dakle, PBT434 pomiče ovu regulatornu modulaciju prema vezanju RNA i odgovarajućoj inhibiciji degradacije TfR mRNA. U staničnom nedostatku željeza, ekspresiju Cp djelomično regulira HIF-1 [46]. Povećanje funkcije HIF-1 slijedi iz smanjenja njegove hidroksilacije aktivnošću prolil hidroksilaze u reakciji ovisnoj o željezu [47]. Kao i u slučaju IREBP-a, čini se da PBT434 smanjuje količinu željeza koje služi kao kofaktor u hidroksilaciji i razgradnji HIF-1. U ovom modelu, povećanje razine stabilnog stanja ovog aktivatora transkripcije povećava Cp transkripciju.

Koristeći kombinaciju ELISA analize i Western blottinga, ispitali smo ekspresiju proteina koji rukuju željezom u hBMVEC-u tretiranom s PBT434 ili PBT434-met; primjeri WB analiza dani su na slici 7A. Podaci su pokazali da je obilje TfR monomera i dimera značajno poraslo za 24 sata kao i Cp (Slika 7B i 7C). Oba povećanja bila su usporedna s povećanjem ovisno o PBT434-u odgovarajućim transkriptima (Slika 6). Nasuprot tome, ekspresija proteina efluksa željeza, Fpn, bila je neosjetljiva na tretman PBT434 (Slika 7D).

Koristili smo ELISA kao dodatnu metodu za kvantificiranje promjena nabora na koje ukazuju podaci Western blota. Stoga su hBMVEC tretirani s PBT434 24 sata, a stanični lizati su ispitani ELISA testom za TfR (Slika 8A). Višestruko povećanje TfR kao odgovor na tretman PBT434 kvantificirano ELISA-om bilo je ekvivalentno onom dobivenom analizom Western blotova (Slika 7B). ELISA je korištena i za procjenu količine izlučenog i GPI-povezanog Cp proteina, koristeći HepG2 stanice kao pozitivnu kontrolu. Što se tiče Cp izlučenog u medij za rast, ovaj je pristup bio ograničen time što je obilje sCp-a u HepG2 i hBMVEC kondicioniranom mediju bilo na ili ispod donje granice osjetljivosti ovog testa (S3 Slika). Međutim, omogućio je procjenu GPI-Cp obilja. U ovoj metodi, stanice su tretirane fosfatidilinozitol-specifičnom fosfolipazom C (PI-PLC), koja cijepa GPI sidro; tako kondicionirani medij je koncentriran i analiziran pomoću Cp-ELISA. Iako je ovaj pristup pokazao da je PBT434 povećao količinu GPI-Cp u HepG2 stanicama, ponovno nije uspio detektirati Cp koji je otpustio PI-PLC (Slika 8B). ELISA je također omogućila izravnu metodu za kvantificiranje feritina. Da bi se to postiglo, hBMVEC su napunjeni s 1 uM Fe-citrata tijekom 24 sata, nakon čega je uslijedio tretman u odsutnosti ili prisutnosti PBT434 tijekom dodatnih 1 sat. Dobiveni stanični lizati podvrgnuti su ELISA analizi na feritin (Slika 8C). Za razliku od povećanja TfR, tretman s PBT434 srušio je protein feritin (Ft) za ~18 posto. Doista, ovaj gubitak Ft proteina bio je očit nakon samo 1 sata tretmana s reagensom. Vremenska priroda ovog rezultata može se povezati s gore navedenim povećanjem dobrotvornog Fe2 plus nakon 30 minuta tretmana s PBT434. Kao što je kasnije objašnjeno, obaranje feritina je dokazano nakon tretmana s drugim Fe2 koji propušta stanice plus kelatnim agensima [48].

4. ⁵⁵Fe^{2 plus}preuzimanje je inhibirano kompleksiranjem s PBT434

S obzirom na brzo uspostavljanje ravnoteže PBT434 u hBMVEC unutar 30 minuta, u usporedbi sa sporim, dvofaznim unosom i uspostavljanjem ravnoteže Fe2 plus tijekom 24 sata [49], pretpostavili smo da PBT434 i Fe2 plus nemaju isti mehanizam unosa. Da bi se ovo testiralo, monoslojevi su inkubirani s radioaktivno obilježenim 55Fe2 plus u odsutnosti ili prisutnosti PBT434 ili PBT434-met, a unos 55Fe2 plus praćen je tijekom 3 sata (Slika 9A). PBT434 značajno je smanjio stopu unosa 55Fe2 plus, kao i smanjio ukupnu akumulaciju 55Fe2 plus u staničnim lizatima (Slika 9C). Ovaj učinak nije primijećen s PBT434-met. Usporedba stopa unosa PBT434 i 55Fe pokazuje da se PBT434 i Fe2 plus preuzimaju različitim transportnim putovima. Nadalje, inhibicija unosa 55Fe u prisutnosti PBT434, ali ne i PBT434-meta, sugerira da ekstracelularni kompleks PBT{31}}željeza nije ligand za prijenosnike željeza (fero) u hBMVEC-u, naime ZIP8, i ZIP14.

Cistanche suplementi

Kako bismo dodatno ispitali ulogu PBT434 u nakupljanju željeza, testirali smo učinak njegovog prethodnog izlaganja na unos 55Fe2 plus. Stanice prethodno tretirane s PBT434 koje su, nakon ispiranja, bile izložene 55Fe2 plus pokazale su povećanje stope unosa i nakupljanja 55Fe2 plus nakon 3 sata (Slika 9, ploče B i D). Ovo povećano nakupljanje održavalo se najmanje 24 sata. Ovi podaci sugeriraju da prethodno izlaganje stanica PBT434 prolazno potencira unos željeza. Neočekivano, prethodna obrada PBT434-met također je pokazala povećanje i unosa i akumulacije (Slika 9B), ali taj učinak nije bio tako značajan ili postojan kao onaj prikazan PBT434.

Pokazali smo da je preuzimanje željeza iz 59Fe-transferina podržano feri-redukcijom i fero-permeacijom na plazma membrani [50, 51]. Jedan eksperimentalni ishod u prilog ovom TBI modelu unosa željeza bio je obaranje ovog unosa inhibicijom aktivnosti ekstracitoplazmatske ferireduktaze; drugi rezultat bila je 60-postotna inhibicija unosa željeza u TBI pomoću ferozina, snažnog kelirajućeg sredstva za željezo [50]. Ova zadnja strategija korištena je da se pokaže da PBT434, ali ne i PBT434-met, također inhibira unos željeza u TBI (Slika 10).

5. PBT434 stimulira 55Fe2 plus efluks ovisan o Fpn

PBT434 ima približno 20 posto sposobnosti deferiprona da proizvede prividnu stimulaciju Fe2 plus efluks iz neuronskih stanica [30]. Procijenili smo efluks 55Fe2 plus iz hBMVEC u odsutnosti ili prisutnosti PBT434 u kontrolnim stanicama ili stanicama tretiranim mini-hepcidinom, PR73. Hepcidin je peptidni hormon koji se nalazi i sistemski i u intersticiju mozga koji se veže na Fpn i cilja transporter za razgradnju. Učinci hepcidina na funkciju izvoza željeza Fpn-a opsežno su proučavani [52-54]. Prethodno smo pokazali da je efluks Fe2 plus iz hBMVEC ovisan o Fpn [35, 49]. PR73 ima EC50 od ~4 nM za degradaciju Fpn u GFP reporter testu [55]. hBMVEC u monoslojevima su napunjeni s 55Fe2 plus 24 sata u odsutnosti ili prisutnosti PR73. Efluks 55Fe je zatim kvantificiran tijekom razdoblja od 5 sati u kontinuiranoj odsutnosti ili prisutnosti PR73 u kombinaciji s odsutnošću i prisutnošću PBT434 (Slika 11). Dok je PR73 smanjio efluks 55Fe iz kontrolne i PBT434-tretirane kulture, PBT434 je djelomično potisnuo inhibiciju zbog mini-hepcidina. U nedostatku PBT434, efluks željeza iz kultura tretiranih PR73-bio je smanjen za ~75 posto dok je pad u kulturama tretiranim PBT434-bio samo ~50 posto (Slika 11 i Tablica 2). Iz ovih rezultata mogu se izvući dva zaključka. Prvo, obaranje Fpn pomoću PR73 smanjuje efluks 55Fe u prisutnosti, kao iu odsutnosti PBT434. Drugo, pod oba uvjeta, PBT434 podržava značajnu, iako malu stimulaciju efluksa željeza.

Reference

1. Hatcher HC, Singh RN, Torti FM, Torti SV. Sintetski i prirodni kelatori željeza: terapijski potencijal i klinička uporaba. Future Med Chem. 2009.; 1(9):1643–70.

2 . Nuñez MT, Chana-Cuevas P. Nove perspektive u terapiji kelacijom željeza za liječenje neurodegenerativnih bolesti. Pharmaceuticals (Basel). 2018.; 11(4):109.

3. Tosato M, Di Marco V. Terapija helacijom metala i Parkinsonova bolest: kritički osvrt na termodinamiku formiranja kompleksa između relevantnih metalnih iona i obećavajućih ili etabliranih lijekova. Biomolekule. 2019.; 9(7).

4. Hedera P. Ažuriranje kliničkog liječenja Wilsonove bolesti. Appl Clin Genet. 2017.; 10:9-19.

5. Xia S, Zhang W, Huang L, Jiang H. Komparativna učinkovitost i sigurnost deferoksamina, deferiprona i deferasiroksa na tešku talasemiju: meta-analiza 16 randomiziranih kontroliranih ispitivanja. PLoS jedan. 2013.; 8(12):e82662.

6. Buettner GR, Jurkiewicz BA. Katalitički metali, askorbat i slobodni radikali: kombinacije koje treba izbjegavati. Radiat Res. 1996.; 145(5):532–41. PMID: 8619018

7. Singh A, Kukreti R, Saso L, Kukreti S. Oksidativni stres: ključni modulator u neurodegenerativnim bolestima. Molekule. 2019.; 24(8).

8. Ashraf A, Clark M, So PW. Starenje Iron Mana. Front Aging Neurosci. 2018.; 10:65.

9. Ghadery C, Pirpamer L, Hofer E, Langkammer C, Petrović K, Loitfelder M, et al. R2* mapiranje za željezo u mozgu: povezanost s kognicijom u normalnom starenju. Neurobiolsko starenje. 2015.; 36 (2): 925–32.

10. Zecca L, Youdim MBH, Riederer P, Connor JR, Crichton RR. Željezo, starenje mozga i neurodegenerativni poremećaji. Nat Rev Neurosci. 2004.; 5(11):863–73.

11. Di Meo I, Tiranti V. Klasifikacija i molekularna patogeneza NBIA sindroma. Eur J Paediatr Neurol. 2018.; 22(2):272–84.

12. Levi S, Finazzi D. Neurodegeneracija s nakupljanjem željeza u mozgu: novosti o patogenim mehanizmima. Front Pharmacol. 2014.; 5:99–.

13. Levi S, Tiranti V. Neurodegeneracija s poremećajima nakupljanja željeza u mozgu: vrijedni modeli usmjereni na razumijevanje patogeneze taloženja željeza. Pharmaceuticals (Basel). 2019.; 12(1).

14. Meyer E, Kurian MA, Hayflick SJ. Neurodegeneracija s nakupljanjem željeza u mozgu: Genetska raznolikost i patofiziološki mehanizmi. Annu Rev Genomics Hum Genet. 2015.; 16: 257–79.

15. Tonekaboni SH, Mollamohammadi M. Neurodegeneracija s nakupljanjem željeza u mozgu: pregled. Iran J Dječji neurol. 2014.; 8(4):1–8. PMID: 25657764

16. Cozzi A, Orellana DI, Santambrogio P, Rubio A, Cancellieri C, Giannelli S, et al. Modeliranje neuroferitinopatije matičnim stanicama otkriva željezo kao determinantu starenja i feroptoze tijekom starenja neurona. Izvješća o matičnim stanicama. 2019.; 13(5):832–46.

17. Liu JL, Fan YG, Yang ZS, Wang ZY, Guo C. Željezo i Alzheimerova bolest: od patogeneze do terapijskih implikacija. Front Neurosci. 2018.; 12:632.

18. Llorens JV, Soriano S, Calap-Quintana P, Gonzalez-Cabo P, Molto MD. Uloga željeza u Friedreichovoj ataksiji: Uvidi iz studija ljudskih tkiva te staničnih i životinjskih modela. Front Neurosci. 2019.; 13:75.

19. Puschmann A. Novi geni koji uzrokuju nasljednu Parkinsonovu bolest ili parkinsonizam. Curr Neurol Neurosci Rep. 2017.; 17(9):66.

20. Crielaard BJ, Lammers T, Rivella S. Ciljanje metabolizma željeza u otkrivanju i isporuci lijekova. Nat Rev Drug Discov. 2017.; 16(6):400–23.

21. Guralnik JM, Eisenstaedt RS, Ferrucci L, Klein HG, Woodman RC. Prevalencija anemije u osoba od 65 godina i starijih u Sjedinjenim Državama: dokazi za visoku stopu neobjašnjive anemije. Krv. 2004.; 104 (8): 2263–8.

22. Pepe A, Meloni A, Capra M, Cianciulli P, Prossomariti L, Malaventura C, et al. Liječenje deferasiroksom, deferipronom i desferioksaminom u bolesnika s velikom talasemijom: usporedba srčanog željeza i funkcije određena kvantitativnom magnetskom rezonancijom. Haematologica. 2011.; 96(1):41–7.

23. Pandolfo M, Arpa J, Delatycki MB, Le Quan Sang KH, Mariotti C, Munnich A, et al. Deferipron kod Friedreichove ataksije: 6--mjesečno randomizirano kontrolirano ispitivanje. Ann Neurol. 2014.; 76 (4): 509–21.

24. Martin-Bastida A, Ward RJ, Newbould R, Piccini P, Sharp D, Kabba C, et al. Kelacija željeza u mozgu deferipronom u fazi 2 randomiziranog dvostruko slijepog placebom kontroliranog kliničkog ispitivanja Parkinsonove bolesti. Sci Rep. 2017.; 7(1):1398.

25. Devos D, Moreau C, Devedjian JC, Kluza J, Petrault M, Laloux C, et al. Ciljanje kelatnog željeza kao terapeutskog modaliteta kod Parkinsonove bolesti. Antioksid-redoks signal. 2014.; 21 (2): 195–210. https://doi. org/10.1089/ars.2013.5593 PMID: 24251381

26. Singh S, Epemolu RO, Dobbin PS, Tilbrook GS, Ellis BL, Damani LA, et al. Urinarni metabolički profili 1,2-dimetil- i 1,2-dietil-supstituiranih 3-hidroksipiridin-4-ona kod ljudi i štakora. Metabolizam i dispozicija lijekova. 1992.; 20(2):256. PMID: 1352218

27. Khodaverdian V, Tapadar S, MacDonald IA, Xu Y, Ho PY, Bridges A, et al. Deferipron: Panselektivna inhibicijska aktivnost histon lizin demetilaze i studija odnosa aktivnosti strukture. Sci Rep. 2019; 9(1):4802.

28. Hider R. Nedavni razvoj usredotočen na oralno aktivne kelatore željeza. Izvješća o talasemiji. 2014.; 4 (2).

29. Kosman DJ. Metabolizam željeza u aerobima: upravljanje hidrolizom feri željeza i autooksidacijom feri željeza. Coord Chem Rev. 2013; 257(1):210–7.

30. Finkelstein DI, Billings JL, Adlard PA, Ayton S, Sedjahtera A, Masters CL, et al. Novi spoj PBT434 sprječava neurodegeneraciju posredovanu željezom i toksičnost alfa-sinukleina u više modela Parkinsonove bolesti. Acta Neuropathol Commun. 2017.; 5(1):53.

31. Heras-Garvin A, Refolo V, Schmidt C, Bradbury M, Stamler D, Stefanova N, urednici. PBT434 čuva dopaminergičke neurone, smanjuje oligomerizaciju alfa-sinukleina i poboljšava motoričku funkciju u modelu atrofije višestrukih sustava transgenih miševa. Annals of Neurology; 2020.: Wiley 111 River St, Hoboken 07030–5774, NJ SAD.

32. Heras-Garvin A, Stefanova N. MSA: Od osnovnih mehanizama do eksperimentalne terapije. Parkinsonizam vezan poremećaj. 2020.; 73:94-104.

33. Dawson VL, Dawson TM. Obećavajuće terapije za Parkinsonovu bolest koje modificiraju bolest. Znanost translacijska medicina. 2019.; 11(520):eaba1659.

34. Eigenmann DE, Xue G, Kim KS, Moses AV, Hamburger M, Oufir M. Komparativna studija četiri besmrtne linije kapilarnih endotelnih stanica ljudskog mozga, hCMEC/D3, hBMEC, TY10 i BB19, i optimizacija uvjeta kulture, za in vitro model krvno-moždane barijere za studije propusnosti lijekova. Tekućine i barijere CNS-a. 2013.; 10(1):33.

35. McCarthy RC, Kosman DJ. Ceruloplazmin i hepcidin glija stanica različito reguliraju efluks željeza iz mikrovaskularnih endotelnih stanica mozga. PLoS jedan. 2014.; 9(2):e89003.

36. Steimle BL, Smith FM, Kosman DJ. Nosači otopljene tvari ZIP8 i ZIP14 reguliraju nakupljanje mangana u mikrovaskularnim endotelnim stanicama mozga i kontroliraju razine mangana u mozgu. J Biol Chem. 2019.; 294(50):19197–208.

37. Stins MF, Badger J, Sik Kim K. Bakterijska invazija i transcitoza u transficiranim mikrovaskularnim endotelnim stanicama ljudskog mozga. Mikrobni patogen. 2001.; 30(1):19–28.

38. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Prva studija PBT434 na ljudima, novog inhibitora male molekule agregacije -sinukleina (S4.001). Neurologija. 2019.; 92(15 Dodatak):S4.001.

39. Stamler D, Bradbury M, Wong C, Offman E. Faza 1 studije PBT434, novog inhibitora male molekule agregacije -sinukleina, kod odraslih i starijih odraslih dobrovoljaca (4871). Neurologija. 2020.; 94(15 Dodatak):4871.

40. McCarthy RC, Kosman DJ. Aktivacija ekspresije ceruloplazmina stanica glioblastoma C6 susjednim interleukinima izvedenim iz endotela ljudskog mozga u in vitro sustavu modela krvno-moždane barijere. Stanična komunikacija i signalizacija: CCS. 2014.; 12:65.

41. McCarthy RC, Park YH, Kosman DJ. sAPP modulira efluks željeza iz mikrovaskularnih endotelnih stanica mozga stabilizirajući feroportin, izvoznik željeza. EMBO izvješća. 2014.; 15(7):809–15. https://doi. org/10.15252/embr.201338064 PMID: 24867889

42. Hentze MW, Muckenthaler MU, Galy B, Camaschella C. Two to Tango: Regulacija metabolizma željeza kod sisavaca. Ćelija. 2010.; 142(1):24–38. https://doi.org/10.1016/j.cell.2010.06.028 PMID: 20603012

43. Zhou ZD, Tan EK. Signalni put regulatornog proteina željeza (IRP) - element koji reagira na željezo (IRE) u neurodegenerativnim bolestima ljudi. Molekularna neurodegeneracija. 2017.; 12(1):75. https://doi.org/10. 1186/s13024-017-0218-4 PMID: 29061112

44. Crichton RR, Dexter DT, Ward RJ. Metabolizam željeza u mozgu i njegov poremećaj u neurološkim bolestima. J Neural Transm. 2011.; 118(3):301–14. https://doi.org/10.1007/s00702-010-0470-z PMID: 20809066

45. Patel SJ, Frey AG, Palenchar DJ, Achar S, Bullough KZ, Vashisht A, et al. Kompleks šaperona PCBP1-BolA2 isporučuje željezo za sklapanje citosolnih [2Fe-2S] klastera. Nat Chem Biol. 2019.; 15(9):872–81. https://doi.org/10.1038/s41589-019-0330-6 PMID: 31406370

46. ​​Mukhopadhyay CK, Mazumder B, Fox PL. Uloga čimbenika induciranog hipoksijom-1 u transkripcijskoj aktivaciji ceruloplazmina zbog nedostatka željeza. J Biol Chem. 2000; 275(28):21048–54.

47. Strowitzki MJ, Cummins EP, Taylor CT. Hidroksilacija proteina hidroksilazama čimbenika induciranog hipoksijom (HIF): Jedinstvena ili sveprisutna? Stanice. 2019.; 8(5).

48. De Domenico I, Vaughn MB, Li L, Bagley D, Musci G, Ward DM, et al. Feroportinom posredovana mobilizacija feritinskog željeza prethodi razgradnji feritina putem proteasoma. Embo j. 2006.; 25(22):5396–404.

49. McCarthy RC, Kosman DJ. Aktivnost feroportina i egzocitoplazmatske feroksidaze potrebni su za izljev željeza iz mikrovaskularnih endotelnih stanica mozga. Časopis biološke kemije. 2013.; 288(24):17932–40.

50. McCarthy RC, Kosman DJ. Mehanička analiza nakupljanja željeza u endotelnim stanicama BBB. Biometali. 2012.; 25(4):665–75.

51. Kosman DJ. Telo metalo-redukcije i metalo-oksidacije u eukariotskoj trgovini željezom i bakrom. Metalomika. 2018.; 10(3):370–7. https://doi.org/10.1039/c8mt00015h PMID: 29484341

52. Aschemeyer S, Qiao B, Stefanova D, Valore EV, Sek AC, Ruwe TA, et al. Analiza strukture i funkcije feroportina definira mjesto vezivanja i alternativni mehanizam djelovanja hepcidina. Krv. 2018.; 131(8):899–910.

53. Ganz T, Nemeth E. Hepcidin i homeostaza željeza. Biochim Biophys Acta. 2012.; 1823(9):1434–43.

54. Qiao B, Sugianto P, Fung E, Del-Castillo-Rueda A, Moran-Jimenez MJ, Ganz T, et al. Hepcidinom izazvana endocitoza feroportina ovisi o ubikvitinaciji feroportina. Cell Metab. 2012.; 15(6):918–24.

55. Fung E, Chua K, Ganz T, Nemeth E, Ruchala P. Tiol-derivatizirani minihepcidini zadržavaju biološku aktivnost. Bioorg Med Chem Lett. 2015.; 25(4):763–6.

Danielle K. BaileyID, Whitney Clark, Daniel J. Kosman

Odjel za biokemiju, Jacobs School of Medicine and Biomedical Sciences, State University of New York u Buffalu, Buffalo, NY, Sjedinjene Američke Države