Dio Ⅱ: Pretjerana ekspresija PKD1 uzrokuje policističnu bubrežnu bolest

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Caroline Thivierge, Almira Kurbegović, Martin Couillard, Richard Guillaume, Olivier Coté i Marie Trudel

Patogenetski mehanizmi u osnoviautosomno dominantan policistična bolest bubrega(ADPKD) tek treba razjasniti. Iako postoje dokazi da PKD1 (policistična bolest bubrega 1) haploinsuficijencija gena i gubitak heterozigotnosti mogu uzrokovati stvaranje ciste kod miševa, paradoksalno visoke razine PKD1 (policistična bolest bubrega 1) otkrivena je ekspresija u bubrezima pacijenata s ADPKD (autosomno dominantnom policističnom bolešću bubrega). Kako bi se utvrdilo je li PKD1 (policistična bolest bubrega 1) povećanje funkcije može biti patogenetski proces, PKD1 (policistična bolest bubrega 1) bakterijski umjetni kromosom PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-BAC) je modificiran homolognom rekombinacijom kako bi ciljao isključivo na održivi PKD1 (policistična bolest bubrega 1) ekspresije preferirano u odnosu na odrasli bubreg. Generirano je nekoliko transgenih linija koje su specifično prekomjerno eksprimirale PKD1 (policistična bolest bubrega 1) transgen u bubrezima 2- do 15-savija preko PKD1 (policistična bolest bubrega1) endogene razine. Svi transgeni miševi reproducibilno su razvili tubularne i glomerularne ciste i bubrežnu insuficijenciju i umrli od bubrežne insuficijencije. Ovaj model pokazuje da prekomjerna ekspresija divljeg tipa PKD1 (policistična bolest bubrega 1) sam po sebi dovoljan je za pokretanje cistogeneze koja nalikuje ljudskom ADPKD (autosomno dominantanpolicistična bolest bubrega). Naši rezultati također su otkrili izrazito povećanu bubrežnu ekspresiju c-Myc u miševa iz svih transgenih linija, što ukazuje da je c-Myc kritični in vivo nizvodni efektor PKD1 (policistična bolest bubrega 1) molekularni put. Ova studija ne samo da je proizvela neprocjenjiv i prvi PKD（policistična bolest bubrega）model za procjenu molekularne patogeneze i terapija, ali također pruža dokaze da bi povećanje funkcije moglo biti patogenetski mehanizam kod ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega).

Cistanche liječi bolest bubrega

KLIKNITE OVDJE ZA DIO Ⅰ

REZULTATI

Proizvodnja PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-Ac-BAC homolognom rekombinacijom. Kako bi se utvrdilo je li PKD1 (policistična bolest bubrega 1) sam dobitak funkcije dovoljan je za proizvodnju fenotipa ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega), prvo smo izolirali genomski klon koji sadrži cijeli PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen u biblioteci BAC vektora 129/Sv. Ova je biblioteka pretražena PCR-om s dva seta početnica za PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen koji je obuhvaćao egzon 1 na 5' kraju i egzone 39 do 40 prema 3' kraju (Slika 1). Pozitivan BAC klon za PKD1 (policistična bolest bubrega 1) identificiran je gen koji uključuje cijelo susjedno tijelo gena Tsc2. Umetak PKD1 (policistična bolest bubrega 1) detaljno je okarakteriziran kako bi se osiguralo da genomska struktura odgovara onom endogenog PKD1 (policistična bolest bubrega1) gen soja miša 129/Sv iz kojeg je izveden umetak i iz inbred soja C57BL/6J. Genomske karte PKD1 (policistična bolest bubrega 1) lokus u BAC i u ovim samooplodnim sojevima pomoću Southern blot analize, s četiri probave restrikcijskim enzimima i sedam sondi koje pokrivaju cijeli PKD1 (policistična bolest bubrega 1)gena, izgledalo je identično bez dokaza o preraspodjeli (slika 1). Ovaj BAC je sadržavao -121-kb umetak uključujući ~37 kb uzvodnog i -39 kb nizvodnog slijeda PKD1 (policistična bolest bubrega1) gen utvrđen elektroforezom i sekvenciranjem.

SLIKA 2.Proizvodnja SBPkdlrAc konstrukata i transgenih miševa. (a) Uzastopni događaji homologne rekombinacije provedeni su na mišjem Pkdl-BAC kako bi se uvele dvije modifikacije: SB regulatorni elementi umetnuti neposredno uzvodno od inicijacijskog kodona Pkdl i tiha točkasta mutacija EcoRI (RI*) uvedena u egzon(ex) 10. BAC rekombinacijski vektor sadrži R6Ky ishodište replikacije, gen otporan na ampicilin, SacB gen, RecA gen i jedinstveno mjesto za kloniranje Smal u kojem su klonirani regulatorni elementi "SB" (ili mutacija tihe točke egzona 10). s bočnim krakovima gena Pkd1. BAC rekombinacijski vektor je elektroporiran u E, coli (DH10B) stanice koje sadrže Pkdl-BAC divlji tip, a nakon selekcije dogodio se prvi događaj homologne rekombinacije preko jednog od dva Pkd1 kraka da bi se proizveli BAC kointegrati. Rekombinacijski vektor i duplicirana Pkdl područja BAC kointegrata eliminirani su u drugom koraku selekcije. Riješeni Pkdl-BAC-ovi mogu se vratiti na divlji tip ili uključiti namjeravanu modifikaciju. Zatim se može uvesti naknadna homologna rekombinacija u novo modificirani BAC. (b) (ienomc DNA iz SBPkd l-etransgene mxce je anakZed pomoću Sou thern blot.AVicToiD1ecLon lineariziranih fragmenata uzrokovao je umetanje transgena u head-to-head. head -to-rep, i/ili tail-to-rep orijentacija. 5'kraj je analiziran digestijom genomske DNA s HindIII i hibridiziran sa specifičnom transgenskom SB sondom (lijeva ploča). Sve tri transgene linije miševa generirale su očekivanih 10 .9-kb vrpca za umetanje od glave do repa; dodatna vrpca uočena u liniji 39 najvjerojatnije predstavlja spojni fragment između SB i mišjeg genoma. Unutarnji integritet transgena praćen je s nekoliko digestija restrikcijskim enzimima, i prikazana je jedna reprezentativna mrlja genomske DNA digestirane s EcoRI i hibridizirane s Pkdl sondom (egzon 7-15) (srednja ploča).

Ovaj SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1)-BAC klon je modificiran s dva uzastopna događaja homologne rekombinacije u E. coli. Gen PKD1 (policistična bolest bubrega 1) označen je u eksonu 10 zamjenom nukleotida (G u A) kako bi se stvorilo novo EcoRI mjesto na poziciji 2355 na cDNA mapi. Ova tiha točkasta mutacija proizvedena je za razlikovanje PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen i transkript BAC-a iz onog endogenog porijekla. Osim toga, zamijenili smo 5' regulatorne elemente PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-BAC gena iskorištavanjem prethodno identificiranih "SB" elemenata specifičnih za bubrežni epitel iz SBM (povezanog s c-Myc) ili SBF povezanog s c-fos) konstrukt-trans-gena za ograničavanje ekspresije na bubrege (36, 38) (Slika 2a).

Ovaj novi SBPkdlrAG-BAC probavljen je s NotL, jedinstvenim mjestom koje se nalazi odmah uzvodno od SB elemenata, i ClaI unutar tijela gena Tsc2, skraćujući regulatorne elemente Tsc2 i 5'polovicu tijela gena kako bi se osigurao nedostatak T'sc2 egzogenu ekspresiju u svim tkivima i za uklanjanje prokariotskih BAC vektorskih sekvenci (Slika 1 i 2). Ovaj 70-kb NotI-ClaI linearizirani fragment je izoliran, pročišćen. i kvantificirana za mikroinjekciju oocita (36).

CISTANCHE BENEFIT: LIJEČENJE BUBREŽNIH BOLESTI

Proizvodnja i analiza SBPkdl-ac transgenih miševa. Četiri transgena osnivača koji nose nekoliko kopija transgena SBPkdlrAc dosljedno su razvijali PKD. Od četiri SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1) RAC miševi osnivači određeni Southern analizom, tri SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1)TAG transgene linije uspostavljene su s dvije do devet kopija transgena (slika 2b). Karakterizacija integriteta transgena u ovim linijama praćena je s 5', internim i 3' probama kao što je prikazano reprezentativnim primjerima na slici 2b. Transgene linije otkrile su s 5'"SB" sondom pojas na 10,9 kb koji je u skladu sa SBPkdlrAc trans-gen se integrira u orijentaciji od glave do repa i otkriva pomoću 3' sonde pojas od 71-kb (Slika 2b). Osim toga, unutarnja sonda detektirala je traku od 9.4-kb endogenog PKD1 (policistična bolest bubrega 1), kao i trake od 69-kb i 2.5-kb transgena zbog mjesta umetanja EcoRI u egzonu 10 (Slika 2b). Ovi miševi sadržavali su potpune kopije transgena na temelju analize genomske preklapajuće strukture.

PKD1 (policistična bolest bubrega 1) dobitak funkcije u odraslih SBPkdl-Ac transgenih miševa. Ekspresija SBPkdl-AG. transgen i PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen je istraživan u različitim organima. Kvantifikacija razina transkripta iz transgenskog i/ili endogenog gena provedena je Northern blot analizom (Slika 3a). Kao što se očekivalo, transgeni i endogeni genski transkripti bili su slične duljine (14,2 kb). Na temelju kontrolne ekspresije GAPDH, bubrezi svih SBPkd 1 A mišjih linija imali su dosljedno povećanu ekspresiju transkripta u usporedbi s normalnim PKD1 (policistična bolest bubrega 1) razine u bubrezima odraslih (n=3) slične dobi. Bubrežna transgena i endogena ekspresija za različite transgene linije pokazala je raspon od 2- do 15- puta iznad kontrolne bubrežne endogene PKD1(policistična bolest bubrega 1)razine (Slika 3a). Konkretno, transgena linija 39(n=4) pokazala je viši PKD1 (policistična bolest bubrega 1) razine od redaka 3 (n=3) i 41(n=4). Nadalje, PKD1 (policistična bolest bubrega 1) razine ekspresije izmjerene Northern blot analizom u korelaciji s onima dobivenim PCR-om u stvarnom vremenu korištenjem početnica u egzonima 1 i 2 (Slika 3b).

SL.3.Analiza bubrežne ekspresije SBPkdlrA miševa. (a) Analiza ekspresije Pkd1 endogenih (endo) i SBPkdlrA transgenskih (Tg) transkripata u bubrezima iz tri transgene linije Northern blotingom. Dva uzorka iz svake transgene linije, 3, 39 i 41 uspoređena su s endogenim bubrežnim Pkdl transkriptom normalnih kontrolnih miševa iste genetske pozadine (C5BI 6I ×CBA/DE, uzorci RNA bubrega dobiveni su iz transgenih miševa prije završni stadij bubrežne bolesti. Transkripti iz endo i Tg dugi su -14.2 kb. Sustavna prekomjerna ekspresija transkripata primijećena je u bubrezima svih transgenih miševa u odnosu na netransgene kontrole. GAPDH je korišten kao interna kontrola Kvantifikacija bubrežne ekspresije u ovih transgenih miševa kretala se od 2- do 15-puta u odnosu na Pkd1endogene razine iz kontrolnih miševa proizvoljno postavljene na 1. (b) Shematski prikaz SBPkdl-. transgena i početnice su korišten za pojačanje ukupnog Pkdl uključujući endogeni i transgen (egzon 1 i egzon 2) i samo Pkd1 transgen (B. egzon 2) PCR-om u stvarnom vremenu i semikvantitativnom RT-PCR, RT-PCR analiza ekspresije transgena SBPkdlAc kvantificirana je u bubrežnoj i ekstra bubrežna tkiva. Prikazana je reprezentativna semikvantitativna procjena transgena SBPkdl.Ac (Tg) koja uključuje uzorak bubrežnog tkiva (K) jednog miša iz sve tri transgene linije (3. 39 i 41) i izvanbubrežnih tkiva. H, srce; Lu, pluća; B. mozak; Li, jetra; i S. slezena iz miša linije 39. Ekspresija transgena se lako detektira u bubrezima svih transgenih miševa, dok je niska do nedetektabilna u ekstrarenalnim tkivima. Ekspresija iz transgena SBPkd1rAc proizvela je specifični 307-bp amplikon, dok je unutarnja kontrola S16 generirala 102-bp amplikon. M,100-bp oznaka; H, O, negativna kontrola za PCR pojačanje. (c) PCR analiza ekspresije SBPkdlr u stvarnom vremenu. Transgen je određen iz nekoliko neovisnih miševa. Transgen SBPkdl.Ac iz tri transgene mišje linije 3 (n=5), 39(n =7) i 41 (n=5) pokazao je da su linije 39 i 41 imale najveći razine bubrežne ekspresije. Ekspresija transgena SBPkdlrAc u ekstrarenalnim tkivima miševa (n=3) od tri transgene linije procijenjena je PCR-om u stvarnom vremenu. U usporedbi s bubrezima svake transgene linije (100 posto), analiza izvanbubrežnih tkiva pokazala je da su razine ekspresije transgena dosljedno niže za 10- do 1,000-put u mozgu, srcu, jetri, gušterači , slezene i pluća. (d) Ekspresija endogenog c-mc gena u SBPkdl.Ac bubrezima semikvantitativnom RT-PCR. Shematska ilustracija prikazuje početnice korištene za pojačavanje c-Myc. Kao što se očekivalo, ekspresija c-Myc je minimalna u odraslim netransgenim bubrezima (kontrole). Nasuprot tome, povećana ekspresija c-Mye otkrivena je u svim odraslim SBPkdlrAc bubrezima triju linija, kao što je primijećeno u odraslim transgenim SBM bubrezima korištenim kao pozitivna kontrola. Amplikon c-Myc bio je 250 bp; umnožak S16, interne kontrole, bio je 102 bp.M,100-bp marker.

Konkretno, kvantifikacija razina ekspresije transgena provedena je PCR-om u stvarnom vremenu i semikvantitativnom RT-PCR-om u tri transgene linije u odrasloj dobi korištenjem početnica u 5'netranslatiranoj regiji (B, -globin promotor) i u eksonu 2 PKD1 (policistična bolest bubrega 1)(Sl.3b). SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1) Ekspresija RAC u transgenim miševima uspoređena je s genskim proizvodom S16 ribosomalnog proteina kao internim standardom. Uvjeti korišteni za semikvantitativno RT-PCR pojačanje bili su unutar linearnog raspona. Ekspresija transgena PCR-om u stvarnom vremenu i semikvantitativnom RT-PCR-om dosljedno je i specifično pokazala najveću ekspresiju u bubregu od svih transgenih linija u odnosu na druge organe (Slika 3b i c). Razine bubrežne ekspresije za pojedinačni uzorak bile su ponovljive bilo kojom od korištenih tehnika detekcije. Najviše razine PKD1 (policistična bolest bubrega 1) transgena bubrežna ekspresija je mjerena za linije 39 i 41. Kako bi se pratilo je li povećana ekspresija PKD1 (policistična bolest bubrega 1) rezultat transgena ili endogenog gena, ista skupina miševa iz tri transgene linije uspoređena je za bubrežni PKD1 ( policistična bolest bubrega 1) ekspresija transgena i za renalnu PKD1 (policistična bolest bubrega 1) ukupna (transgena i endogena) ekspresija PCR-om u stvarnom vremenu. Zanimljivo. linije 39 i 41 u odnosu na liniju 3 pokazuju da je povećani PKD1 (policistična bolest bubrega 1)transgenska bubrežna ekspresija bila je slična ili veća od ukupne bubrežne ekspresije PKD1 (policistična bolest bubrega 1), što ukazuje na transgen kao specifično odgovoran za ovu induciranu ekspresiju. U raznim organima (uključujući srce, pluća, mozak, jetru, gušteraču i slezenu), SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1) RAC; transgen je pokazao vrlo slabu ekspresiju povremeno otkrivenu u slezeni i plućima, s malom do nemjerljivom ekspresijom u drugim organima (slika 3b). Kvantifikacija pomoću PCR-a u stvarnom vremenu pokazala je 10-do 1,000-puta nižu razinu ekspresije transgena u ekstrarenalnim tkivima u odnosu na ekspresiju bubrega (Slika 3c). "SB" regulacijski elementi SBPkdlrAc transgena dodijelili su preferencijalnu bubrežnu ekspresiju; ova posebna raspodjela organa također je određena kada se koristi u transgenima povezanim s c-Myc (SBM) i c-fos(SBF) (36, 38). c-Mye, nizvodni efektor PKD1 (policistična bolest bubrega 1) signalni putovi u SBPkdlrAc: miševi. Kako bismo stekli uvid u intracelularni patogenetski mehanizam SBPkdlrAc transgenih miševa, zatim smo nastojali pratiti razinu bubrežne ekspresije c-Myc na temelju našeg prethodnog opažanja deregulacije c-Myc u ljudskim ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega) bubrezima (22). Analiza bubrega provedena je iz sve tri transgene linije 3(n=4).39(n=7), i 41 (n =4), kao i kontrole (n {{9 }}). Kao što je prikazano na slici 3d, postoji značajna ekspresija endogenog c-Mye induciranog u SBPkdlrAa miševa u odnosu na kontrolne miševe slične dobi. Zanimljivo je da je razina ekspresije c-Myc u nekim bubrezima SBPkdlrAG, posebno u liniji 39, dosegla razine usporedive s onom opaženom u PKD SBM transgenom mišjem modelu proizvedenom bubrežnom ekspresijom c-Myc.

Bubrežne anomalije u SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1) ARC mice similar to PKD. To characterize the phenotype caused by the transgene expression, gross and histologic examinations were undertaken on transgenic kidneys. Adult kidneys from all transgenic lines were affected bilaterally. Kidneys contained numerous cortical cysts that varied from microscopic to macroscopic in size (Fig.4a and b). SBPkdlrAc. kidneys were pale, a typical finding in PKD. On histologic examination, all transgenic founder mice and progenies (n = 25;n>6 za svaku liniju) razvijene višestruke tubularne (T) i glomerularne ciste (G) (Sl. 4d, f i g). Ciste su uočene u tubulima iz kortikalne i medularne regije, kao i sabirnim tubulima iz papile (Slika 4d i e). Transgeni miševi pokazali su tubularnu epitelnu hiperplaziju (vrh strelice) koja uključuje i cistične i ne-cistične tubule i čestu hipertrofiju (Slika 4g i h). ali ozbiljnost je varirala između pojedinih miševa. Intersticijska fibroza (F). Perivaskularni limfoidni infiltrati i proteinski odljevci (P) često su uočeni (Slika 4d i e)

Slika 4

Za preciznije definiranje mjesta lokalizacije povećane PKD1 (policistična bolest bubrega 1)ekspresiju u bubrezima, proveli smo in situ hibridizaciju koristeći eksonsku 36-45 sondu koja je prethodno korištena (16). Hibridizacijski signal je specifično lokaliziran na epitelne stanice koje oblažu ciste i hiperplastične tubule, kao i glomerularne ciste. Osim toga, određeni signal je viđen preko epitela necističnih ili blago dilatiranih tubula, vjerojatno identificirajući tubule predodređene za buduće cistične promjene (Slika 4i i j). Histološka analiza bubrega također je provedena na transgenim miševima pri rođenju (n=8), postnatalni dan 10(P10)(n=3),P20(n=5),P35(n{ {10}}) i P45(n= 3) u usporedbi s negativnim leglima iste dobne skupine (n =2 do 4). Zanimljivo je da su svi novorođeni transgeni miševi pokazali tubularnu i glomerularnu dilataciju u odnosu na kontrolne negativne legla (sl. 4k i 1), što ukazuje da su bubrežne anomalije nastale u maternici, kao što je uočeno u SBM miševa i ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega) pacijenata. Tubularna i glomerularna dilatacija povećavala se u veličini i broju s progresivnom starošću. Do P35, transgeni miševi su pokazali težu hiperplaziju i dokaze glomeruloskleroze. Promijenjene bubrežne fiziološke funkcije u SBPkdlrsc miševa. Bubrežne fiziološke funkcije svih transgenih miševa pokazale su značajke slične PKD-u, dok se kod netransgenih legla nikad nije razvila bolest. Nekoliko mjeseci nakon rođenja oboljele životinje razvile su kroničnu bubrežnu insuficijenciju. Kod ovih su životinja praćeni funkcionalni parametri bubrega mjerenjem razina u serumu i urinu. dušik ureje u krvi (BUN) i kreatinin, osmolalnost urina, proteini u urinu i izlučivanje iona (Tablica 1). Svi miševi iz tri linije u usporedbi s kontrolama pokazali su nedostatke koncentracije, što je čest nalaz kod ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega). i posljedično pokazalo smanjeno uriniranje BUN. koncentracije kreatinina, proteina i željeza. Transgeni SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1)rAc.utemeljitelji i potomci (n=6) iz svake linije kvalitativno su praćeni na proteinuriju na uzorcima urina pomoću SDS-PAGE (Slika 5). Miševi stariji od 2 mjeseca pokazali su neselektivnu proteinuriju koja je napredovala s godinama. Uz to, razine serumskog BUN-a i serumskog kreatinina bile su povećane, otkrivajući bubrežnu insuficijenciju (Tablica 2). Budući da kronična bubrežna insuficijencija obično dovodi do promjena u hematološkim parametrima, oni su ispitani na SBPkdlAc transgenim miševima u dobi od 3 do 14 mjeseci (Tablica 2). Ovi transgenični miševi bili su anemični što je dokazano značajno smanjenim brojem crvenih krvnih zrnaca, s hemoglobinom i hematokritom koji su dosegli polovicu normalnih razina. Ostali parametri crvenih krvnih zrnaca, poput postotka retikulocita, nisu bili promijenjeni, kao što se očekivalo kada su inducirani bubrežnim defektom. Ove su životinje dosljedno umirale od zatajenja bubrega u dobi od -5.9± 2,8 mjeseci (n {{12} }) za transgensku liniju 39 i u kasnijoj dobi,-14.6± 3,1 mjeseci (n= 20) i-11.7 ±6,5 mjeseci (n=7) , za linije 3 i 41, respektivno.

DJELOVANJE CISTANCHE: LIJEČENJE BUBREŽNIH BOLESTI

RASPRAVA

Ovdje izvještavamo o izolaciji i karakterizaciji mišjeg PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-BAC. Ovaj PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen je označen i regulacijski elementi su zamijenjeni da usmjere ekspresiju specifično na bubrege pomoću dva uzastopna događaja homologne rekombinacije. Transgeni miševi proizvedeni s ovim novim genom SBPkdlrAG pokazali su 2-do 15-struko povećanje ekspresije PKD1 (policistična bubrežna bolest 1) i reproducibilno razvijene rane morfološke promjene bubrega tipične za PKD. Insuficijencija bubrega očita je u srednjim godinama, a miševi prerano umiru od zatajenja bubrega. Naši rezultati također pokazuju da je mehanizam prekomjerne ekspresije PKD1 (policistična bolest bubrega 1) odgovoran za ovaj fenotip posredovan signaliziranjem aktivacije c-Myc in vivo. Ova studija pokazuje da je povećanje funkcije bubrega kod mišjeg PKD1 (policistična bolest bubrega 1) dovoljno za stvaranje PKD bubrežnog fenotipa.

Budući da je mišji PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen nije dupliciran kao što je to slučaj kod ljudi (27), izravno smo identificirali i izolirali BAC klon koji je sadržavao cijeli PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen. Potpuna karakterizacija 129/Sv mišjeg PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-BAC. neizravna usporedba s dva druga inbred soja miša potvrdila je cjelovitost lokusa PKD1 (policistična bolest bubrega 1). PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-BACinsert je sadržavao -37 do 39 kb uzvodnih i nizvodnih sekvenci iz gena PKD1 (policistična bubrežna bolest 1). Naša analiza je pokazala da PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen u ovom BAC-u bio je vjerodostojan lokus mišjeg divljeg tipa koji bi mogao poslužiti za daljnja istraživanja.

Iako postoje čvrsti dokazi da stvaranje ciste kod ADPKB (autosomno dominantna policistična bolest bubrega) može biti rezultat gubitka heterozigotnosti nakon somatske inaktivacije normalnog PKD1 (policistična bolest bubrega 1) alela (3.21.32), također postoje sugestivni dokazi za stalnu ili čak povećanu ekspresiju policistina-1 u cističnom tubularnom epitelu (22.29). Potonje opažanje postavlja pitanje je li prekomjerna ekspresija PKD1 (policistična bubrežna bolest 1) per se dovoljan proksimativni uzrok cistogeneze. Kod transgenih miševa koji nose ljudski PKD1 (policistična bolest bubrega 1), TSC2. RAB26. NTHL1 i SLC9A3R2 gena, samo je manjina miševa razvila ciste i niti jedan nije imao mjerljivu ekspresiju transgena u odrasloj dobi unatoč 30 kopija transgena (31). Kod tih transgenih miševa. bilo je teško utvrditi jasnu ulogu prekomjerne ekspresije PKD1 (policistične bolesti bubrega 1) u cistogenezi. Naš model se razlikuje, budući da su dvije do devet kopija divljeg tipa PKD1 (policistične bolesti bubrega 1), bez susjednih gena, integrirane u transgene miševe. Budući da gen PKD1 (policistična bolest bubrega 1) ima bitne funkcije u različitim organima ili tkivima, kao što je opisano za brojne miševe s ablacijom gena PKD1 (policistična bolest bubrega 1), sustavna prekomjerna ekspresija PKD1 (policistična bolest bubrega 1) može dovesti do dodatnih zbunjujućih učinaka. Shodno tome, bavili smo se ulogom PKD1 (policistična bolest bubrega 1)dobitak funkcije korištenjem pristupa koji cilja PKD1 (policistična bubrežna bolest 1) posebno na bubrege. Homolognom rekombinacijom prvo smo zamijenili PKD1 (policistična bolest bubrega 1) uzvodno regulatorno područje s "SB" bubrežno ograničenim regulatornim elementima, čime smo spriječili smanjenu ekspresiju gena koja se normalno vidi za PKD1 (policistična bolest bubrega 1)u odrasloj dobi kao i potencijalna regulacija sekundarne povratne sprege (36,38). Drugo, označili smo mišji PKD1 (policistična bolest bubrega 1) transgen (Pkdlr) s tihom točkastom mutacijom u egzonu 10, ali nije umetnuo oznaku epitopa kako bi se osiguralo da će biti proizveden potpuno funkcionalni protein "divljeg tipa" s očuvanom strukturom i integritetom. Iz ovog modificiranog BAC-a, fragment SBPkdlrAG je pročišćen od gena Tsc2 i vektora BAC kako bi se spriječila interferencija gena Tsc2, koji također može inducirati cistični fenotip (8.20.28). kao i da se izbjegne inhibicijski učinak prokariotskih sekvenci(5).

Proizvedene su četiri različite SBPkdlrActransgene miševe začetnice i tri neovisne linije sa specifičnim bubrežnim PKD1 (policistična bolest bubrega 1)-pojačana ekspresija. Posebno je zapanjujuća potpuna penetracija fenotipa kod ovih transgenih miševa. SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1) Osnivač rAc i mišje linije dijele nekoliko fiziopatoloških značajki zajedničkih s ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega). To uključuje razvoj cista u korteksu, meduli i glomerulima zajedno s epitelnom hiperplazijom, intersticijalnom fibrozom i žarišnom intersticijalnom upalom.

Budući da je fenotip PKD dosljedno promatran kod svih različitih transgenih miševa začetnika i da je integracija transgena u mišji genom slučajna pojava, fenotip ne može proizaći iz učinka kromosomskog položaja, već samo iz povećanog PKD1 (policistična bolest bubrega 1)izraz. Doista, pokazalo se da je ekspresija transgena PKD1 (policistična bolest bubrega 1) u svim linijama ograničena bubrezima. kao što je prethodno uočeno za druge transgene regulirane "SB" elementima (36,38). Štoviše, ovu povećanu ekspresiju PKD1 (policistične bolesti bubrega 1) uzrokovao je transgen, a ne neizravni endogeni PKD1 (policistična bolest bubrega 1) aktivacija. Stoga naši rezultati pružaju jasne dokaze da povećanje funkcije divljeg tipa funkcionalnog PKD1 (policistična bolest bubrega 1) može proizvesti višestruke bubrežne ciste. Važno je da ove prakse SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1) predstavljaju prvi mišji model generiran isključivo prekomjernom ekspresijom mišjeg ortologa ljudskog PKD1 (policistična bolest bubrega 1) gen.

SBPkdl-Ac miševi pokazuju da PKD1 (policistična bolest bubrega 1Prekomjerna ekspresija je primarni patogenetski mehanizam bubrežne cistogeneze. Važno je da se čini da najviše razine ekspresije transgena u bubrezima koreliraju s progresijom i težinom fenotipa. Također smo otkrili da je prekomjerna ekspresija PKD1 (policistična bolest bubrega 1) u razvoju SBPKD1 (policistična bolest bubrega 1Fenotip )-Ac vjerojatno signalizira aktivaciju c-Myc in vivo. Moguće je da bi ova aktivacija mogla biti čak i izravna kroz policistinski-1 C-terminalni rep koji prolazi kroz proteolitičko cijepanje i nuklearnu translokaciju (7). Budući da se pokazalo da pojačana bubrežna ekspresija c-Myc u odraslih miševa inducira PKD, bilo bi vrlo dosljedno poduprijeti c-Myc kao glavni nizvodni efektor PKD1 (policistična bolest bubrega 1) signalni putevi Ovaj rezultat je također u korelaciji s našim prethodnim otkrićima povećane ekspresije c-Myc u bubrezima svih analiziranih humanih ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega) (22). Sveukupno, ovi rezultati pokazuju da je c-Mye glavni posrednik PKD1 (policistična bolest bubrega 1) cistogeneza.

Naši rezultati iz PKD1 (policistična bolest bubrega 1)model povećanja funkcije, zajedno s haploinsuficijencijom mišjeg PKD1 (policistična bubrežna bolest 1) i gubitkom funkcije, ukazuje da bilo koji PKD1 (policistična bolest bubrega 1) disregulacija bi mogla dovesti do cistogeneze (2.19.23-26.31.40). Teška neravnoteža PKD1 (policistična bolest bubrega 1) u miševa izazvana PKD1 (policistična bolest bubrega 1) ablacija ili transgena prekomjerna ekspresija uzrokovala je ranu pojavu i brzu progresiju bubrežnih cista i zahvatila veliki udio tubula. Nasuprot tome, blaži PKD1 (policistična bolest bubrega 1) neravnoteža kao što je haploinsuficijencija dovela je do sporijeg napredovanja PKD-a s više žarišnih cista. Očigledni paradoksalan razvoj sličnog fenotipa putem suprotne disregulacije policistina-1 mogao bi se objasniti zajedničkim rezultatom, naime relativnom neravnotežom koncentracije proteina koja bi mogla promijeniti formiranje ili funkciju aktivnog policistinskog multiproteinskog kompleksa. Uzeti zajedno, naši rezultati i rezultati drugih istraživača tvrde da je mehanizam stvaranja ciste kod ADPKD (autosomno dominantna policistična bolest bubrega) vjerojatno nastaje iz tri patogenetska mehanizma: povećanje funkcije, gubitak funkcije i učinci doziranja gena.

Roman SBPkdlrAc; miševi predstavljaju moćan model bubrežne cistogeneze koji može pružiti veliki uvid u patofiziologiju PKD, PKD1 (policistična bolest bubrega 1) putevi prijenosa signala i partneri u interakciji. Studija ovog modela također može dovesti do razvoja novih terapijskih strategija za vraćanje normalne ravnoteže proteina unutar PKD1 (policistična bolest bubrega 1) multimerni kompleks.

Cistanche liječi bolesti bubrega i poboljšava rad bubrega

REFERENCE

1. Blouin, MJ, H. Beachemin, A Wright, M. E. De Paepe, M. Surrette, AM. Dečko. B. Nakamoto, CN. Ou, G. Stamatoyannopoulos i M. Trudel. 2000. Genetska korekcija bolesti srpastih stanica: uvidi korištenjem modela transgenih miševa Nat. Med.17-182.

2 Boulter, C, S. Mulroy, S. Webb, S. Fleming, K. Brindle i R. Sandford. 2001.Kardiovaskularni, skeletni. i bubrežni defekti u miševa s ciljanim poremećajem PKD1 (policistična bolest bubrega 1)gen. Proc. Natl.Acad. Sci. SAD 9812174-12179.

3. Brasier, JL, i EPHenske.1997. Gubitakpolicistična bolest bubrega(PKD1）regija kromosoma 1φp13 u stanici bubrežne ciste podržava model gubitka funkcije za patogenezu ciste. J. Clin. Investig.99:194-199.

4. Burn, TC, TD Connars, W. R Dackowski, LR. Petry, TJVan Raay, JMMilhalland, M. Venet, G. Milker, R ML Hakim, G. ML Landes, KW Klinger, F. Qiam, LF. Onuchic, T. Watnick GGGermino i N. A Doggett.1995. Analiza genomske sekvence zaautosomno dominantna policistična bolest bubregagen predviđa prisutnost ponavljanja bogatog leucinom. Hum Mol, Genet.4-575-58.

5. Chada, K, J. Magram, K. Raphael, G. Radice, E. Lacy i F. Costantini. 1985. Specifična ekspresija stranog -globin gena u eritroidnoj stanici transgenih miševa Nature 337-380.

6. Chauvet, V, F.Qian, N. Bought, Y.Cai B.Phakdeekitacharoen, LF.Onuchi, T. Attie-Bitach, L. Guicharnaud, O.Devuryst, GG Germino i M.-C. Gubler.2002. Ekspresija PKDI i PKD2 transkripata i proteina u ljudskom embriju i tijekom normalnog razvoja bubrega. Am. J.Pathol. 160973-983.

7.Chaurvet,V, X Tian, ​​H.Husson, DH Grimm, T.Wang T.Hiesberger, P. Igarashi, AMBennett, O.braghimov-Beskrovnaya, S.Somlo i MJ Caplan. 2004. Mehanički podražaji induciraju cijepanje i nuklearnu translokacija pobeystin-1 C terminusa.J. Cin.Investig 114:1433-1443.

8. Cheadle, JP, MPReeve, JR Sampson i DJ Kwiatkowski 2000. Molekularni genetski napredak kod tuberozne skleroze. Pjevušiti. Genet10797-114.

9. Konzorcij, EPKD1993. Identifikacija i karakterizacija gena tuberozne skleroze na kromosomu 16. Cell75:1305-1315.

10. Konzorcij, EPKD1994.Thepolicistična bolest bubrega 1gen kodira sve što se može transkribirati unutar duplicirane regije na kromosomu 16 stanica 7781-894.

11. Konzorcij, L PK D 1995.g.Policistična bolest bubrega: kompletna struktura PKD1 (policistična bolest bubrega1) gen i njegov protein. Ce 81:289-298

12. Couillard, M.,R Guilkume, N Tanj, V.DAgati i M. Trudel.2002. c-Myc-inducirana apoptoza upolicistična bolest bubreganeovisan je o FasL/Fas interakciji. Cancer Res. 62:2210-2214.

13. De Paepe, M Land M Trudy 1904, Model humane glomerulopatije srpastih stanica. Kidney Int. 46:1337-1345.

14. GengL,Y, Segal B.PekseL N.Den Y. Pei, F.Carone, H G. Rennke, AM Glücksman-Kuis, MCSchneider, M Ericsson, STReeders i J.Zhou. 1996. Identifikacija i lokalizacija poliestera, PKD1 (policistična bolest bubrega 1) genski proizvod. J. Clin. Istražite. 98-2674-2682