PRVI DIO Feniletanolni glikozidi štite hipertrofiju miokarda izazvanu konstrikcijom abdominalne aorte putem ECE-1 inhibicije demetilacije i poboljšanja puta PI3K/PKB/eNOS
Mar 06, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com
Qiong-Ling Fan,1 Jia-Wei Wang,1 Shi-Lei Zhang, & et al.
Feniletanoil glikozidi (CPhG)temeljna su materijalna osnova farmakološke aktivnosti uCistanche tubulosai imaju različite farmakološke učinke. Međutim, nije jasno jesu li CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) imaju meliorativni učinak na hipertrofiju miokarda izazvanu preopterećenjem tlakom. U ovoj studiji, muškim SD štakorima težine (200 ± 20) g uspostavljeni su modeli srčane hipertrofije pomoću koarktacije abdominalne aorte (AAC). Nakon operacije, štakorima je davan odgovarajući lijek 6 tjedana (CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) 125, 250 i 500 mg/kg/dan i valsartan 8,3 mg/kg/dan). Ehokardiografija, indeks težine srca (HWI), površina poprečnog presjeka kardiomiocita (CSCA), površina fibroze, razina endotelina 1 (ET-1) i proinflamatornih čimbenika u plazmi. Naši rezultati su pokazali da različiti CPhGs(Feniletanoil glikozidi) doza smanjena debljina stražnje stijenke lijeve klijetke (LVPWT), krajnji dijastolički promjer lijeve klijetke (LVED), HWI, CSCA, područje fibroze, ET-1, proupalni čimbenici, arterijski natriuretski peptid (ANP), moždani natriuretski peptid (BNP) ), razine mRNA endotelin konvertirajućeg enzima 1 (ECE-1), razine ciklooksigenaze 2 (COX-2), razine proteina okvira 1 grupe visoke mobilnosti (HMGB-1) i ECE{{8} } razina demetilacije dok se povećavaju ejekcijske frakcije lijeve klijetke (LVEF), frakcijsko skraćivanje lijeve klijetke (LVFS), fosforilirana fosfatidilinozitol 3-kinaza (p-PI3K), fosforilirana protein kinaza B (p-PKB) i fosforilirani endotelni dušikov oksid sintetaza (p-eNOS). -e indeksi CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) Skupine od 250 i 500 mg/kg značajno su se razlikovale od skupine koja je primala AAC; u usporedbi s valsartanskom skupinom (AV), indeksi CPhGs 500 mg/kg skupine nisu bili značajno različiti. Zaključno, CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) poboljšala hipertrofiju miokarda štakora pomoću AAC-a, što može biti povezano s inhibicijom demetilacije ECE- 1 i pojačanjem PI3K/PKB/eNOS.
2. Materijali i metode
2.1.Životinje.
70 mužjaka SPF SD štakora težine 200 ± 20 g (10 po skupini) osigurao je Centar za eksperimentalne životinje Medicinskog sveučilišta Xinjiang (Urumqi, Kina). Broj dozvole za proizvodnju životinja bio je SYXK(XIN)2016-0003, a broj potvrde SCXK(XIN)2016-002. -e studiju odobrio je Odbor za etiku životinja Prve pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta Xinjiang (broj odobrenja 20180223-183). -oni su držani uz slobodan pristup vodi i hrani u plastičnim kavezima i držani u 12-satnom ciklusu svjetlo/tama na temperaturi od 22 ± 2 stupnja i vlažnosti od 45-55 posto u našem Eksperimentalnom centru za životinje.
2.2. Materijali.
CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) , čiji je sadržaj ehinaceje bio veći od 40 posto, a akteozida više od 16 posto, kupljen je od Hetian Di Chen Medical Biotechnology Co., Ltd. Valsartan je kupljen od Beijing Novartis Pharma Co., Ltd. Karboksimetilceluloza natrij (CMC-Na) osigurao je Xian Zhengtian Pharmaceutical Accessories Co., Ltd. A CPhG-ovi su otopljeni u 0,5 posto CMC-Na.
Feniletanoil glikozidi iz cistanke
2.3. Koarktacija abdominalne aorte (AAC).
Nakon što su bili anestezirani 2,5 postotnim pentobarbital natrijem (2,5 ml/kg) (Merck, Darmstadt City, Hessen, Njemačka), štakori su obrijani i držani topli na jastučićima za grijanje. -en trbušna šupljina štakora je otvorena za 2 cm u sredini abdomena u sterilnom okruženju, trbušni organi su gurnuti u desnu stranu, a abdominalna aorta je bila potpuno izložena na 0.5 cm iznad desne renalne arterije. Igla broj 8 ligirana je žicom broj 2 paralelno s trbušnom šupljinom koja se šiva [18]. Trbušne aorte štakora u lažnoj skupini odvojene su bez podvezivanja i nije postojala kontrolna skupina za operaciju. - dan nakon operacije, AC 125 mg/kg, AC 250 mg/kg i AC 500 mg/kg hranjeni su CPhG-ovima(Feniletanoil glikozidi iz cistanke)sondiranjem; AV skupina hranjena je valsartanom putem sonde; i kontrolna skupina, AAC skupina i lažna skupina nisu hranjene CPhGs ili valsartanom, jednom dnevno tijekom 42 uzastopna dana. Doza lijeka određena je na temelju prethodnih referenci i preliminarnih eksperimenata [8].
2.4. Ehokardiografija.
Šest tjedana nakon AAC-a, štakori su anestezirani s 2,5 posto pentobarbital natrija i izvršena je ehokardiografija (Philips HD11 XE, Amsterdam, Nizozemska). LVPWT, LVED, LVEF i LVFS mjereni su četiri puta kako bi se izračunali prosjeci kao konačni pokazatelji.
2.5. Indeks srčane težine (HWI).
Nakon ehokardiografije, štakori su pogubljeni prikupljanjem krvi iz trbušne aorte. Srca štakora su uklonjena iz prsa i izvagana nakon što su isprana normalnom fiziološkom otopinom (4 stupnja) 3 puta i ocijeđena čistim filter papirom. -e HWI je izračunat pomoću sljedeće formule: HWI � težina srca tjelesna težina. (1)
2.6. Hematoksilin-eozin i Masson bojenje.
-e miokard iz lijeve klijetke fiksiran je 4-postotnim paraformaldehidom ugrađenim u parafin, presječen s debljinom presjeka od 4 μm, osušen u pećnici na 60 stupnjeva 2 sata, a zatim obojen hematoksilin-eozinom ili Massonom (Solaibio, Peking, Kina). -e struktura miokarda promatrana je mikroskopom s invertnim faznim kontrastom (Leica, Frankfurt, Njemačka). Softver Image J korišten je za izračunavanje CSAC i područja fibroze.
2.7. Enzyme-Linked Immune Sorbent Assay (ELISA).
Krv iz trbušne aorte ekstrahirana je iz štakora i stavljena u antikoagulacijsku epruvetu tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi i zatim centrifugirana pri brzini od 3000 o/min. -e supernatant apsorbiran je pipetama (Eppendorf, Hamburg, Njemačka) i pohranjen na 80 stupnjeva za testiranje. Plazma ET-1, interleukin 1 (IL-1), interleukin 6 (IL-6), faktor nekroze tumora Komplementarna i alternativna medicina utemeljena na dokazima
(TNF-) (Bioss, Peking, Kina) i ciklooksigenaze 1 (COX-1) (Cusabio, Wuhan, Kina) razine štakora otkrivene su prema uputama za ELISA kit.
2.8. PCR specifičan za metilaciju.
DNK je ekstrahirana iz miokardijalnog tkiva lijevog ventrikula štakora pomoću kompleta za ekstrakciju DNK (Tiangen Biotech, Peking, Kina). -e vrijednost apsorpcije (A vrijednost) bila je jednaka OD260/OD280 (1,8~1,9). 20 ul genomska DNA (500 pg-1 ug) modificirana je sumpornom kiselinom pomoću Methylation-Gold Kit (ZYMO, Orange County, CA, SAD). -e MSP reakcijski sustav bio je 25 μL, uključujući 3,0 μL sulfitom modificirane DNA šablone, 2,5 μL 10 × pufera, 2,5 μL 2,5 mm dNTP-a, 1,0 μL 10 μm primera, 0,1 μL Hotstar Taq DNA polimeraze (TAKARA Biotechnology) , i 14,9 μL ddH2O. Bilo je ukupno 45 ciklusa: denaturacija na 95 stupnjeva, žarenje na 55 stupnjeva i ekstenzija na 72 stupnja tijekom 30 s. Nakon PCR-a, 5 µL produkta je odvojeno elektroforezom na 2 postotnom agaroznom gelu. -e DNA tretirana je s M. Sssl metiltransferazom (New England Biolabs, Ipswich, MA, SAD) korištena je kao pozitivna kontrola metilacije, a DNA normalne kontrolne skupine korištena je kao pozitivna kontrola demetilacije. Na kraju, agarozni gel je fotografiran i analiziran Bio-Rad gel sustavom za snimanje. -e razina demetilacije izračunata je pomoću sljedeće formule:
Svi primeri dizajnirani u Methprimeru (Applied Biosystems, MA, SAD) i sintetizirani od strane Sangon Biotech (Šangaj, Kina) navedeni su u tablici 1.
2.10. Western Blot.
Proteini su ekstrahirani iz miokarda lijeve klijetke pomoću Ripa Buffffer (Scientific) i dodan je inhibitor proteaze. Koncentracija proteina određena je BCA metodom (Solarbio, Peking, Kina). Proteini su uzeti u količini od 50 ug i denaturirani na 100 stupnjeva C tijekom 5 minuta. Proteini su odvojeni elektroforezom na natrijevom dodecil sulfat-poliakrilamidnom gelu (SDS-PAGE, Beyotime, Shanghai, Kina) i zatim prebačeni na membranu od poliviniliden fluorida (PVDF) elektroforetskom opremom (Bio-Rad, CA, SAD). Nakon što su blokirane s 3 posto BSA tijekom 2 sata na sobnoj temperaturi, membrane su inkubirane s anti-PI3K antitijelima, antifosfo-PI3K antitijelima, anti-eNOS antitijelima, anti-fosfo-eNOS (1:1000, Bioss, Peking, Kina), anti-COX{17}} antitijela, anti-HMGB-1 antitijela (1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, SAD) i anti-ECE-1 antitijela (1: 2000, Signalway antitijela , College Park, MD, SAD), primarna antitijela preko noći na 4 stupnja . Sljedeći dan, nakon što su isprane s TBST 3 puta, membrane su inkubirane s HRP-obilježenim kozjim anti-zečjim IgG (1: 25000, 1 h, Zhongshanjinqiao, Šangaj, Kina) na sobnoj temperaturi. Nakon što su isprane s TBST 3 puta, membrane su vizualizirane pomoću Pierce™ ECL Western Blotting Substrate i snimljene pomoću FluorChem E Imaging System (Protein Simple, SAD), koje su normalizirane na -aktin kao unutarnju kontrolu.
Korist Phenylethanoild glikozida iz cistanche
cistanche korist
3. Rezultati
3.1. CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) Poboljšana srčana funkcija kod štakora nakon AAC.
-e štakori su dobili sondu od dana nakon AAC. -e pozitivnoj kontrolnoj skupini (AV) je davana sonda s valsartanom od 8,3 mg/kg/dan, a skupini CPhGs (AC) je davana sonda s CPhGs od 125, 250, odnosno 500 mg/kg/dan. Nakon šest tjedana kontinuiranog doziranja, štakori su izveli ehokardiografiju pod anestezijom s 2,5 posto natrijevog pentobarbitala. Dva štakora su umrla nakon AAC: jedan u modelnoj skupini uginuo je treći dan nakon AAC od plućnog edema; još jedan u AC 500 mg/kg umro je dan nakon operacije za koju se sumnja da je uzrokovana kirurškim stresom. Kao što je prikazano na slici 2, u usporedbi s lažnom grupom, LVED, LVEF i LVFS u AAC skupini bili su značajno smanjeni, ali je LVPWT u AAC skupini značajno povećan. U usporedbi sa skupinom koja je primala AAC, LVED, LVEF i LVFS bili su povećani, a LVPWT je smanjen do različitih stupnjeva u svakoj skupini s dozom AC; za LVPWT, značajna promjena nije pronađena u skupini s AC 125 mg/kg, ali je pronađena u skupinama s AC 250 i 500 mg/kg. U usporedbi s AV skupinom, LVPWT i LVED u skupini AC od 125 mg/kg primijećene su značajne razlike, dok LVPWT, LVED, LVFS i LVFS u skupinama AC 250 i 500 mg/kg nisu.
3.2. CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) Smanjeni HWI, CSAC i područje fibroze u štakora nakon AAC.
Izvagali smo srce svakog štakora kako bismo izračunali HWI i uzeli tkivo miokarda za HE i Massonovo bojanje kako bismo promatrali promjene površine poprečnog presjeka (CSAC) i površine fibroze u kardiomiocitima. Kao što je prikazano na slikama 3(a), 3(d) i 3(e), u usporedbi s lažnom grupom, težina srca (HW) i HWI u AAC skupini značajno su smanjeni; u usporedbi s AAC skupinom, HW i HWI u AC250 i 500 mg/kg skupinama značajno su smanjeni; u usporedbi s AV skupinom, HW i HWI značajno su porasli u skupini od AC 125 mg/kg, ali nisu bili u skupinama od AC 250 i 500 mg/kg. Na slikama 3(b) i 3(f), u usporedbi s lažnom grupom, rezultati Massonovog bojenja pokazali su da je područje fibroze u AAC skupini značajno povećano. Za područje fibroze, utvrđeno je značajno smanjenje u skupinama s AC 125, 250 i 500 mg/kg u usporedbi sa skupinom s AAC, dok je značajno povećanje u skupinama s AC 125 i 250 mg/kg te značajno smanjenje u AC s 500 mg/kg. kg skupine pronađeni su u usporedbi s AV skupinom. Na slikama 3(c) i 3(g), rezultati HE bojenja pokazali su da je CSAC u AAC skupini značajno povećan u usporedbi s onom u lažnoj skupini; u usporedbi s AAC skupinom, CSAC u AC 250 i 500 mg/kg skupinama značajno je smanjen; u usporedbi s onom u AV skupini, međutim, CSAC je značajno povećan u skupinama AC 125 i 250 mg/kg, a nije pronađena značajna razlika u skupini AC 500 mg/kg
3.3. CPhGs(Feniletanoil glikozidi iz cistanke) Smanjene razine mRNA gena za hipertrofiju miokarda u miokardnom tkivu štakora nakon AAC.
ANP, BNP i teški lanac miozina (-MHC) važni su čimbenici srčane hipertrofije [19, 20]. Otkrili smo relativne razine ekspresije ova tri gena za srčanu hipertrofiju u tkivima miokarda. Kao što je prikazano na slici 4, u usporedbi s lažnom grupom, relativne razine ekspresije ANP, BNP i -MHC mRNA u AAC skupini bile su značajno povećane; međutim, u usporedbi sa skupinom AAC, relativne razine ekspresije tri gena za hipertrofiju miokarda u AC 250 Komplementarna i alternativna medicina utemeljena na dokazima 5.
