DIO Ⅰ: Učinci okolišnih uvjeta na broj nefrona
Mar 20, 2022
za više informacija:ali.ma@wecistanche.com
Ⅰ DIO: Učinci okolišnih uvjeta na broj nefrona: Modeliranje bolesti majke i epigenetske regulacije u razvoju bubrega
Lars Fuhrmann, Saskia Lindner, Alexander-Thomas Hauser, Clemens Höse i dr.
1. Uvod
Na razvoj fetusa utječe in utero okruženje, a nepovoljno okruženje može izazvati predispoziciju za bolesti kao što su hipertenzija, kardiovaskularne bolesti i kronične bolesti bubrega kasnije u životu [1-4]. Niz intrauterinih poremećaja može rezultirati smanjenjem obdarenosti nefrona i kompromitiranom funkcijom bubrega u potomstva. Kod glodavaca stanja koja dovode do smanjenog broja nefrona pri rođenju uključuju intrauterino ograničenje rasta (IUGR), majčinu niskoproteinsku prehranu, lijekove (uključujući kortikosteroide ili nesteroidne protuupalne lijekove), monogenetske mutacije i niske razine vitamina A, kao i majčin dijabetes i nedostatak željeza [5-10]. Kod ljudi trenutno ne postoji neinvazivna metoda mjerenja broja nefrona. Međutim, studije nakon smrti pokazale su negativnu korelaciju između broja nefrona i krvnog tlaka [4,11]. Osim toga, poznato je da su intrauterina stanja povezana sa smanjenim brojem nefrona, kao što je IUGR, povezana s povećanim stopama hipertenzije i kronične bubrežne bolesti[12].
Pokusi in vivo u kojima su nepovoljni intrauterini uvjeti umjetno izazvani u gravidnih životinja pokazali su se neprocjenjivima za otkrivanje i opis bubrežnih promjena izazvanih u potomaka. Međutim, svaka eksperimentalna intervencija tijekom gestacije rezultira složenim promjenama u fiziologiji majke, posteljice i fetusa koje same po sebi mogu utjecati na okolinu metanefroija u razvoju. Ex vivo tehnike modeliranja to zaobilaze omogućujući istraživanje razvoja bubrega potpuno odvojeno od utjecaja majke životinje, placente ili drugih organa fetusa. Trowell je 1950. godine prvi izveo izolirane kulture metanefroija na sučelju medij-zrak [13], a kasnije su poboljšane uzgojem bubrega na filtarskim membranama [14], dajući osnovu za uvjete kulture s jednom varijablom.
Ukratko, sve je više dokaza koji sugeriraju da su prenatalni inzulti povezani s niskim brojem nefrona relevantni za čimbenike rizika za hipertenziju i KBB. Kako bi se razvile preventivne strategije kako bi se osigurala odgovarajuća obdarenost nefrona pri rođenju, potrebno je mehaničko razumijevanje čimbenika koji utječu na razvoj bubrega i nefrogenezu. U ovom radu, kultura metanefričkih organa korištena je za modeliranje različitih aspekata regulacije okoliša kako bi se proučili njihovi učinci na rast bubrega i mogućih implikacija na dugotrajnu bubrežnu funkciju te korištena za pretraživanje epigenetskih regulatora korištenjem malih spojeva koje je odobrila FDA.
Kliknite na Cistanche herba proizvode za rad bubrega
2. Rezultati
2.1. Upotreba kultura metanefričkih organa za proučavanje utjecaja okolišnih uvjeta na razvoj bubrega
Kako bi se modelirali nepovoljni uvjeti okoliša, bubrezi embrija embrionalnog dana (E)12.5 uzgajani su na sučelju srednjeg zraka (Slika 1A). Kako bi se olakšalo praćenje razvoja nefrona i glomerula, Six2. Cre i Pod. Upotrijebljeni su dualni fluorescentni miševi reporteri (Slika 1B, C). Uobičajeno stanje tijekom trudnoće je vrućica, koja pogađa više od 10 posto trudnoća tijekom prvih 16 tjedana trudnoće [15] Vrućina je dobro karakteriziran teratogen, a pokazalo se da hipertermija tijekom trudnoće dovodi do fetalnog pobačaja, zastoja u rastu, i razvojne nedostatke, kao što je agenezija bubrega, hipoplazija i niska porođajna težina kod nekoliko vrsta [16-21]. Kako bi se procijenio utjecaj dugotrajnih hipertermičnih stanja u rasponu vrućice na rast bubrega i formiranje nefrona, bubrezi su izolirani i održavani na 37 ili 40 stupnjeva (Slika 1D). Nakon 7 dana uzgoja, bubrezi uzgojeni na 40°C bili su u prosjeku 18,36 posto manji od svojih primjeraka uzgojenih u fiziološkim uvjetima (Slika 1E). Međutim, nije pronađena značajna razlika u broju glomerula po bubregu između skupina (Slika 1F). Ipak, smanjeni ukupni rast bubrega pokazuje negativan učinak povišene temperature na metanefrični rast.
Uz procijenjenih 19 posto trudnica koje pate od anemije uzrokovane nedostatkom željeza [22], nedostatak željeza jedno je od najraširenijih stanja s potencijalom da poremeti razvoj bubrega [23]. In vivo podaci su pokazali da su bubrežni rast, broj glomerula i bubrežni unos željeza smanjeni tijekom trudnoće uzrokovane nedostatkom željeza u majke [24]. Kako bi se procijenio utjecaj smanjene opskrbe željezom vezanim za transferin na rast bubrega i nefrogenezu, eksplantati su uzgajani u mediju koji je sadržavao 50 ug/mL holo-transferina zasićenog željezom ili 50 ug/mL apo-transferina osiromašenog željezom, odnosno. Bubrezi s ograničenim unosom željeza ostali su puno manji od svojih kolega s dovoljno željeza i pokazali su povećanu apoptozu u pupoljcima uretera i smanjeno grananje i proliferaciju pupoljaka uretera (Slika 1G, Dodatna slika S1A-F). Dok je populacija nefrona bila morfološki nepromijenjena, moglo se vidjeti smanjenje distalnog dijela nefrona u razvoju, kao i distalnih tubula (Slika 1H,I, Dodatna slika S1G-J). Bubrezi s nedostatkom željeza bili su u prosjeku 47,9 posto veličine svojih parnjaka kultiviranih holo-transferinom (Slika 1) i pokazali su smanjenje ukupnog broja glomerula po bubregu od 69,9 posto nakon 7 dana u kulturi (Slika 1K) . Stoga je smanjenje željeza apo-transferinom pokazalo ozbiljne učinke na rast bubrega s fenotipom sve proksimalne nefrogeneze.
Slika 1. Upotreba kultura metanefričkih organa za proučavanje utjecaja okolišnih uvjeta na razvoj bubrega.(A) Urogenitalni greben iz E12.5 mišjih embrija (lijeva ploča) je mikrokirurški ekstrahiran (druga ploča), a bubrezi su izolirani (treća ploča) i postavljeni na Transwell umetke (desna ploča). Ljestvice ∶ 1 mm （lijeva ploča）, 500 μm（treća ploča）. (B) Transgeni miševi s dvostrukom ekspresijom Tomato/EGFP korišteni su za uvjetno označavanje Six2-pozitivnih stanica i njihovih potomaka pomoću Six2. Cre ili (C) podocin-pozitivne stanice koristeći Pod. Cre miševi. (D) Eksplantati iz istog embrija uzgajani su 7 dana na 37 ili 40 stupnjeva. Mjerne trake∶ 500 μm. （E） Površine eksplantata koji su uzgajani 7 dana na 37 ili 40 stupnjeva .n=40 parova, upareni t-test, srednja vrijednost±SD.(F) Broj glomerula u skupinama eksplantata nakon 7 dana.n{{ 17}} parovi, upareni t-test, srednja vrijednost ±SD. （G） Eksplantati iz istog embrija uzgajani su 7 dana u mediju koji sadrži holo-Tf ili apo-Tf. Mjerne trake∶ 500 μm. (H) Slike širokog polja holo-Tf i apo-Tf kultiviranog para eksplantata obojenog protiv SIX2 i E-kadherina nakon 48 h kulture pokazuju normalan skup progenitorskih stanica i defekte u ranoj morfologiji nefrona. Skala ∶100 μm.（I） Slike širokog polja holo-Tf i apo-Tf uzgojenog para eksplantata obojenih protiv WT1 i JAG1. Mjerne trake∶100 μm. （） Površine holo-Tf i apo-Tf uzgojenih eksplantata nakon 7 dana.n=30 parova, upareni t-test, srednja vrijednost ± SD.(K) Broj glomerula u skupinama eksplantata nakon 7 dana.n =17 parovi, upareni t-test, srednja vrijednost ± SD.
2.2. Ex Vio visoka izloženost glukozi dovodi do promjena povezanih s dijabetičkom nefropatijom u bubrezima u razvoju
Šećerna bolest majke još je jedno uobičajeno stanje tijekom trudnoće, s globalnom prevalencijom hiperglikemije u trudnoći od ~17 posto i preko 20 milijuna živorođene djece svake godine [25]. Pokazalo se da dijabetes izazvan na modelima miševa i štakora dovodi do potomstva s nižim brojem nefrona[10,26,27]. Kultura metanefričkih organa korištena je prije za proučavanje učinka visoke glukoze na razvoj bubrega [27-29]. Prethodno smo izvijestili o smanjenju veličine, broja nefrona i metilacije DNA u uvjetima visoke glukoze od 55 mM [30]. Za razliku od objavljenih podataka [28], u našim se uzorcima nije mogao vidjeti učinak na veličinu eksplantata ili broj glomerula kada su kultivirani u različitim medijima s glukozom od 30 mM u usporedbi s kontrolnim uvjetima od 5 mM nakon 7 dana (dodatna slika S2A, B). Nadalje, nije se moglo otkriti smanjenje metilacije DNA na LINE-1 i glavnim satelitskim mjestima (dodatna slika S2C, D). Učinak 55 mM visoke glukoze na razvoj bubrega nakon 7--dnevne kulture dodatno je analiziran, pokazujući smanjenje stope rasta počevši od 3. dana u kulturi (Slika 2A, B). Imunofluorescentno bojenje nije pokazalo morfološke nedostatke SIX2-pozitivnog skupa progenitorskih stanica (Slika 2C), ali je pokazalo smanjeno bojenje markera podocita podokaliksina (PODXL, Slika 2D). Utvrđeno je da glomeruli sadrže zadebljali glomerularni bazalni matriks vidljiv u histološkim bojama (Slika 2E). Slični su nalazi dobiveni elektronskom mikroskopijom, pokazujući povećanje debljine bazalne membrane glomerula (Slika 2F), jednog od najranijih markera predijabetesa i dijabetičke nefropatije (DN) [31,32], u pet od šest bubrega i niti u jednom od sedam kontrolnih bubrega srodnika iz legla. Kako bi se dalje otkrile promjene u transkriptomu, provedena je parna analiza diferencijalne ekspresije gena (DGE) kultura bubrega iz tri legla, s jednim bubregom iz svakog embrija uzgojenim s visokom glukozom, a drugim s kontrolnim medijem i bubrezima skupljenim za analizu ( n=3).DGE je potvrdio pojačanu regulaciju komponenata izvanstaničnog matriksa kao primarni regulirani biološki proces (dodatna tablica S1). Geni s niskom regulacijom bili su uglavnom uključeni u aktivaciju (imunoloških) stanica i egzocitozu/sekreciju (dodatna tablica S1). Ontologija fenotipa sisavaca ukazuje na abnormalnu morfologiju korteksa bubrega i bubrežnih tjelešaca zbog gena s niskom regulacijom kao što su Pdgfb, Podxl, Ren, Ptpro, Mafb i Vegfa (dodatna tablica S1). Bubrežna ekspresija nekoliko gena, kao što su Angptl4, Spon2 (Mindin), Pappa i Txnip, za koje se pokazalo da su pojačano regulirani u dijabetičkoj nefropatiji [33-36], utvrđeno je da je povećana u uvjetima hiperglikemije. Kako bi se usporedio profil ekspresije gena kulture bubrega s visokom glukozom i ljudskim DN-om, DGE podaci su usklađeni s ljudskim podacima iz mikrodiseciranih glomerula i tubula iz biopsija bolesnika s dijabetičkom nefropatijom iz Europske renalne cDNA banke (ERCB). Od 216 različito reguliranih gena koji su upareni nakon šaržne analize, 94 gena su odgovarajuće različito regulirana u glomerularnoj i/ili tubularnoj frakciji (Slika 2G). Preklapanje našeg modela i ljudskih DNgena pokazalo je 40 od 95 gena reguliranih naviše u glomerulima i 34 gena u tubulima (25 zajedničkih gena) (Slika 2H). Geni su uglavnom bili uključeni u organizaciju izvanstaničnog matriksa (COL4A5, COL4A6, COL8A2, LAMB3, LAMC3) i staničnu adheziju (ITGBL1, CLDN15). Dodatno, geni povezani s dijabetesom kao što su TXNIP, SPON2 i PAPPA bili su regulirani na gore. Od 120 smanjeno reguliranih gena iz bubrežnih kultura, 22 također su smanjeno regulirani u glomerulima, a 39 također je smanjeno regulirano u tubulima (zajedno 16 (Slika 2I). Ti su geni bili uključeni u odgovor na endogeni podražaj (BMP2, KLF15, JUNB, CTSB), razvoj epitela nefrona (PTPRO, PODXL, VEGFA) i pozitivna regulacija kemotaksije endotelnih stanica (LGMN, P2RX4, VEGFA). Dodatno, geni povezani s dijabetesom kao što su RASGRP3, SIRPA, GATM i ESM1 bili su smanjeni [ 37-39]. Diferencijalno regulirani geni koji se ne preklapaju s ERCB podacima također odražavaju promjene povezane s dijabetesom, kao što su izvanstanični matriks (ANGPTL4, TNN, DPT, COL9A2) ili gestacijski dijabetes (LAT2, HP, CXCL10, CD{{76} }, CD68, REN, SLC2A3, VCAM1). Stoga je razvoj bubrega u uvjetima visoke glukoze pokazao nevjerojatne sličnosti s dijabetičkom nefropatijom kod odraslih ljudi.
Slika 2. Ex vivo visoka izloženost glukozi dovodi do promjena povezanih s dijabetičkom nefropatijom u bubrezima u razvoju.(A) Embrionalni bubrezi iz Pod.Cre; Životinje rajčice/EGFP uzgajane 7 dana u uvjetima niske glukoze (LG, 5,5 mM -D-glukoza, 55 mM manitol) ili visoke glukoze (HG, 55 mM -D-glukoza). Ljestvica: 500 um. (B) Površina bubrega HG i LG stanja.*,p=0.0474;*,p=0.0052;*,p<0.0001.paired t-test,="" mean="" ±="" sd.(c)="" confocal="" immunofluorescent="" stainings="" of="" day="" 7="" kidney="" cultures="" against="" six2="" and="" (d)="" podocalyxin="" with="" pan-cytokeratin="" and="" hoechst.scale="" bar:="" 100="" um.="" (e)="" stainings="" of="" 6="" um="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" scale="" bar:="" 20="" um.="" (f)transmission="" electron="" microscopy="" of="" sections="" from="" day="" 7="" kidney="" cultures.="" glomerular="" basement="" membranes="" are="" thickened="" in="" kidneys="" exposed="" to="" high="" glucose="" conditions.="" left="" column:="" magnification="" showing="" podocyte="" foot="" processes.="" scale="" bars:="" 500="" nm="" (left="" panels),100="" nm="" (right="" panels).(g)="" fold="" change="" of="" rna-seq="" data="" from="" hg="" compared="" to="" lg="" kidneys="" and="" ercb="" diabetic="" nephropathy="" (dn)patient="" microarray="" data="" from="" microdissected="" glomeruli="" and="" tubules="" showing="" differentially="" expressed="" genes.="" (h)="" genes="" upregulated="" in="" the="" kidney="" cultures(kc)overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="" highlighted.="" (i)genes="" downregulated="" in="" the="" kidney="" cultures="" (kc)="" overlapping="" with="" ercb="" dn="" patient="" data="" and="" selected="" genes="">
2.3. Ex vivo visoka izloženost glukozi utječe na formiranje dugotrajne memorije putem metilacije DNA
Za daljnje razumijevanje molekularnih promjena posredovanih hiperglikemijskim okruženjem, kulture bubrega uzgajane su u uvjetima visoke glukoze 3,5 dana, a zatim su promijenjene u uvjete niske glukoze na isto vrijeme (Slika 3A). Zanimljivo je da inkubacija u fiziološkim uvjetima nakon kraćeg razdoblja inkubacije u mediju s visokim sadržajem glukoze nije poništila smanjenje rasta nakon 7 dana u kulturi, pri čemu su kulture rasle istom brzinom kao pod kontinuiranim tretmanom s visokim sadržajem glukoze (Slika 3B). Nadalje, metilacija DNA pokazala je hipometilaciju elementa LINE-1 i glavnih satelitskih lokusa (Slika 2C, D), kao i stalnu hipermetilaciju DNA promotora Ppargcla, i pod visokom glukozom i pod obrnutim uvjetima (Slika 3E), što ukazuje na formiranje metaboličke memorije putem metilacije DNK zbog ranijih nepovoljnih uvjeta okoline kao sredstvo fetalnog programiranja.
Slika 3. Ex vivo visoka izloženost glukozi utječe na formiranje dugotrajne memorije putem metilacije DNA.(A) Snimanje E12.5 embrionalnih bubrega od 0 dana do 7. dana u mediju s niskom razinom glukoze (5,5 mM), mediju s visokom razinom glukoze (55 mM) ili mediju s visokom razinom glukoze tijekom 3,5 dana i prelazak na medij s niskom razinom glukoze za preostale dane.Skala:500 um. (B) Površina bubrega tijekom 7 dana. Srednja vrijednost ± SD. n=36 bubrega. LG, liječenje niskom glukozom; HG, liječenje visokom glukozom; HG do LG, 3,5 dana liječenja visokom i 3,5 dana niske razine glukoze.***, LG-HG (neupareni t-test): p=0.0004;**, LG-HG do LG (upareni t-test) ):str<0.0001.(c) analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" line-1="" and(d)major="" satellite="" loci="" shows="" continuous="" dna="" hypomethylation="" in="" high="" glucose="" treated="" conditions.**,p-value="0.0022.*,p-value=0.0357.(E)" analysis="" of="" the="" dna="" methylation="" at="" the="" ppargcla="" locus="" shows="" continuous="" dna="" hypermethylation="" in="" high="" glucose="" conditions.="" mean="" ±="" sd.="" *,p-value="">
2.4. Ex vivo Small Compound Screen identificira epigenetske regulatore bubrežnog razvoja
Rezultati ovog rada kao i prethodnih radova sugeriraju da epigenetski mehanizmi igraju ulogu u razvoju bubrega [30, A40-45]. Stoga smo željeli sustavno procijeniti učinak epigenetskih modulatora različitih klasa enzima na razvoj bubrega. Za ovo smo odabrali biblioteku od 22 mala spoja odobrena od strane FDA s dokazanom inhibicijskom aktivnošću [46-56] (Slika 4A). Koristeći Six2.Cre-reporter miševe za procjenu razvoja nefrona, bubrežne strukture su uzgajane 3 dana s inhibitorima u mediju. Veličina se povećavala tijekom vremena u usporedbi s kontrolnim organima iz legla, a morfologija je provjerena za abnormalnosti u razvoju (Slika 4B). Moglo bi se pokazati da nekoliko inhibitora ometa normalan ex vivo razvoj bubrega. Inhibitor HDAC entinostat, inhibitor benzamid histon deacetilaze s visokim afinitetom za HDAC1, 2 i 3 [57], pokazao je dosljedno smanjenje rasta i nedostatak diferencijacije i proliferacije nakon 3 dana (Slika 4C). TH39 se razvio kao selektivni HDAC8 inhibitor (IC50 HDAC8 88 nM, 26-struko selektivan prema HDAC1,28-struko selektivan prema HDAC6[56]), pokazao je sličnu jaku inhibiciju rasta u usporedbi s kontrolnim organima legla. Nadalje, kelatori željeza i inhibitori JmJC deferasiroksa i deferoksamina pokazali su smanjenje rasta analogno mediju s nedostatkom željeza. Dodatno, SET7/9 inhibitor ciproheptadin [58,59] pokazao je smanjenje rasta i nedostatak diferencijacije i proliferacije u usporedbi s kontrolnim bubrezima (Slika 4D), ali također se činilo da ometa Wnt signalizaciju (Dodatna slika S3). Ostali inhibitori HDAC, HAT, HDM i HMT te inhibitor DNMT 5-azacitidin nisu pokazali smanjenje rasta ili razvojne anomalije unutar izmjerenog vremenskog okvira (Slika 4A).
Slika 4. Ex vivo mali složeni ekran identificira modulatore bubrežnog razvoja.(A) Popis malih spojeva, njihovih epigenetskih ciljeva i korištenih koncentracija pokazuje smanjenje rasta bubrega s entinostatom, TH39, deferasiroksom, deferoksaminom i ciproheptadinom u 3 neovisna pokusa veća ili jednaka nakon 3 dana u kulturi. Kontrolne kulture su tretirane s DMSO. ***, p-vrijednost<0.0001. (b)examples="" of="" two="" sets="" of="" embryonic="" kidney="" cultures="" with="" pictures="" taken="" from="" day="" 0="" until="" day="" 3="" showing="" growth="" reduction="" and="" morphological="" differences="" in="" kidneys="" treated="" with="" th39,="" deferasirox,="" and="" deferoxamine="" compared="" to="" littermate="" control="" kidneys.="" scale="" bar∶="" 500="" μm.="" (c）entinostat="" showed="" growth="" reduction="" at="" 5="" and="" 10="" μm="" concentrations,="" no="" nephron="" differentiation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" (d)cvproheptadine="" showed="" growth="" reduction="" at="" 100="" and="" 50="" μm="" concentrations,="" lack="" differentiation,="" ureter="" dilation,="" and="" lack="" of="" proliferation="" after="" 3="" days="" in="" culture.="" scale="" bar:="" 500="" um.="" panck,="" pan-cytokeratin.="" cc3,="" cleaved="" caspase-3.="" pcna,="" proliferating="" cell="" nuclear="">
