2. dio|Hiperaktivnost glikogen sintaze kinaze 3b u odljuštenim stanicama mokraćnog sustava predviđa napredovanje dijabetičke bolesti bubrega

Kliknite ovdje za 1. dio

Za više informacija kontaktirajte:emily.li@wecistanche.com

RASPRAVA

U Sjedinjenim Američkim Državama i drugim zapadnim zemljama, DKD ostaje vodeća etiologija progresivne bolestikronična bolest bubregai nameće veliki teret državnoj blagajni i sustavima zdravstvene skrbi jer još nije dostupno konačno liječenje.5 Dugo je poznato da neće svi pacijenti s dijabetesom razviti DN.5 Ovisno o ispitivanoj kohorti, procijenjeno je da DN pogađa w30 posto do 50 posto pacijenata s dijabetesom. Mjere usvojene u sadašnjoj kliničkoj praksi za identifikaciju dijabetičara kod kojih postoji rizik od razvoja DKD-a uglavnom su ograničene na očne preglede za retinopatiju i analizu urina za albuminuriju.5 Međutim, konvergentni epidemiološki dokazi sugeriraju da je ekstrarenalna mikrovaskulopatija ili albuminurija u značajnom neskladu s posljedičnim napredovanjem DKD.12,13,26,27 Kao takva, postoji hitna potreba za razvojem novog biomarkera za preciznu stratifikaciju dijabetičara kod kojih postoji rizik od DN. Ova studija po prvi put izvješćuje da je GSK3b prekomjerno izražen i hiperaktivan u parenhimububregstanice u eksperimentalnoj i kliničkoj DN, povezani snapredovanje bolesti bubrega. Štoviše, hiperaktivnost GSK3b u odljuštenim stanicama mokraćnog sustava vjerojatno može predvidjeti progresiju DN.

Cistanche tubulosa sprječava bolesti bubrega, kliknite ovdje za uzorak

GSK3b, visoko očuvana, redoks-osjetljiva serin/treonin-protein kinaza, središnje je uključena u inzulinsku signalizaciju kao i niz drugih staničnih signalnih putova koji su ključni za patofiziološke procese povezane sbubregozljeda, popravak i regeneracija. U tkivima osjetljivim na inzulin, kao što su jetra i skeletni mišići, GSK3b je aktivan u bazalnim uvjetima i potiskuje aktivnost glikogen sintaze.19,28 Inzulin brzo inaktivira GSK3b putem inhibitorne fosforilacije na serinu 9, što rezultira biosintezom glikogena. Sve veći broj dokaza sugerira da je disregulacija GSK3b povezana s dijabetesom melitusom tipa 2.19,29-31 Doista, postoje podaci koji ukazuju na prekomjernu ekspresiju i hiperaktivnost GSK3b u mišićima dijabetičara31-33 i u masnom tkivu pretilih dijabetičkih miševa.34 Štoviše. , transgena prekomjerna ekspresija GSK3b u skeletnim mišićima miševa uzrokuje oslabljenu toleranciju glukoze, inzulinsku rezistenciju i hiperinzulinemiju.29,35 Nasuprot tome, miševi kojima nedostaje GSK3b u skeletnim mišićima pokazali su poboljšanu toleranciju glukoze.36 Dosljedno, inhibitori GSK3, poput litija, mogu oponaša djelovanje inzulina u staničnim linijama i tkivima.37 Štoviše, kod pretilih dijabetičkih miševa, inhibitori GSK3 poboljšali su osjetljivost na inzulin i homeostazu glukoze.38bubregtradicionalno se ne smatra ciljnim organom djelovanja inzulina. Međutim, uvjerljivi dokazi nedavno sugeriraju da inzulinska signalizacija ububregstanicama, posebice u podocitima, igra ključnu ulogu u održavanju glomerularnih ibubreghomeostaze.39-41 Neispravno signaliziranje inzulina u podocitima, zbog nedostatka ili rezistencije inzulina, vjerojatno je ključni pokretač za mnoge patološke lezije uočene u DN. Nadalje, kliničke studije su pokazale da inzulinska rezistencija korelira s pojavom i ozbiljnošću albuminurije čak i kod normotenzivnih pacijenata koji nemaju dijabetes, što sugerira da inzulinska rezistencija sama po sebi može uzrokovati albuminuriju.42 Slično, miševi s inzulinskom rezistencijom specifičnom za podocite, postignuti su uvjetno izbacivanje inzulinskog receptora u glomerularnim podocitima, razvijena albuminurija i glomerularne lezije koje rekapituliraju DN, unatoč odsutnosti hiperglikemije ili dijabetesa.41 Nasuprot tome, u životinja s dijabetesom, inzulinski senzibilizatori mogu usporiti napredovanje DN neovisno o kontroli glikemije.43 Ovi nalazi sugeriraju da inzulinska signalizacija regulira funkciju podocita neovisno o razinama glukoze u krvi. Međutim, kao ključnog pretvarača inzulinskog signalnog puta, uloga GSK3b u patogenezi i napredovanju DN-a uvelike je nedovoljno istražena.

ububreg, GSK3b se pretežno eksprimira u podocitima i, u manjoj mjeri, u mezangijalnim i endotelnim stanicama u glomerulu 20,21 i ekstenzivno se eksprimira u stanicama bubrežnih tubula. Postoje podaci iz naše i drugih skupina koji pokazuju da GSK3b posreduje u autonomnoj ozljedi podocita integracijom višestrukih podocitopatskih signalnih putova.17,20,44,45 Nedosljednost, genetska ili farmakološka blokada GSK3b može zaštititi od ozljede podocita i smanjiti proteinuriju u životinjskim modelima razne nedijabetičke glomerulopatije.21 Štoviše, kod progresivnihkroničnibubregbolest, utvrđeno je da je GSK3b modulator oštećenja bubrežnih tubula i intersticija. Međutim, je li i kako GSK3b uključen u DN bilo je neizvjesno i intenzivno kontroverzno, iako je ova studija pokazala da pojačana aktivacija GSK3b ububregi u urinu odljuštene stanice mogu biti povezane s razvojem ili progresijom DKD-a. Na primjer, kod štakora s dijabetesom izazvanim streptozotocinom, Lin i sur.46 otkrili su da inhibicija GSK3b adenozin trifosfatom–kompetitivni inhibitor (20 Z, 30 E)-6- Bromo u indirubin-30 -oksimu ( BIO) smanjena proteinurija i poboljšane glomerularne lezije DN u nedostatku korekcije hiperglikemije, što sugerira da GSK3b ima štetnu ulogu u DN. Također, kod štakora s dijabetesom izazvanim streptozotocinom, Paeng i sur.22 došli su do sličnih otkrića korištenjem BIO i zaključili da je pojačana aktivnost GSK3b unutar podocita u dijabetičkim uvjetima povezana s apoptozom podocita i gubitkom DN. Ovo je u skladu s drugom in vitro studijom, gdje je utvrđeno da GSK3b posreduje u dediferencijaciji i ozljedi podocita nakon izlaganja mediju s visokim sadržajem glukoze.47 Naprotiv, Mariappan i sur.48 tvrdili su da aktivacija GSK3b umjesto toga ublažava dijabetes induciranbubregozljeda. U njihovoj studiji, dijabetički miševi izazvani streptozotocinom liječeni su natrijevim nitroprusidom, donorom dušikovog oksida koji može aktivirati GSK3b. Otkrili su da su albuminurija, hipertrofija bubrega i nakupljanje izvanstaničnog matriksa u glomerulima poboljšani u nedostatku poboljšanja kod hipertenzije ili hiperglikemije. Međutim, ovi su nalazi u oštroj suprotnosti s podacima iz genski ciljanih knock-in miševa s konstitutivno aktivnim GSK3 koji su razvili spontanu albuminuriju i ozljedu podocita.49 Kako bi se pomirili proturječni nalazi, treba biti oprezan pri tumačenju podataka generiranih korištenjem kemijskih inhibitora ili aktivatora od GSK3b. Iako je više puta potvrđeno da je BIO vrlo selektivan inhibitor GSK3b male molekule, natrijev nitroprusid nije specifični aktivator GSK3b, ali je poznato da ima snažan hemodinamski učinak,50 što će vjerojatno zbuniti njegovo djelovanje na smanjenje albuminurije i renoprotektivno djelovanje u dijabetički miševi. Sve zajedno, unatoč nekim proturječnim podacima, prevladavajući dokazi idu u prilog tome da je GSK3b vjerojatno povezan sbubregozljedai proteinurija u DN. Potrebno je spomenuti nekoliko ograničenja ove studije. Prvo, pretklinički podaci bili su ograničeni samo na DB/DB mišje modele. Kako bi se utvrdila mogućnost generalizacije uloge GSK3b udijabetička ozljeda bubrega, potrebno je potvrditi nalaze u drugim modelima DN, uključujući modele tipa 1 DN. Drugo, ovdje su klinička opažanja izvedena iz retrospektivnih kohorti dijabetičara s ograničenom veličinom uzorka i relativno kratkim vremenom praćenja. Doduše, potrebne su opsežne, prospektivne, randomizirane, multicentrične studije kako bi se potvrdila naša zapažanja i potvrdila moć GSK3b u odljuštenim stanicama urina u predviđanju ishoda DKD-a.

GSK3b, visoko očuvana, redoks-osjetljiva serin/treonin-protein kinaza, središnje je uključena u inzulinsku signalizaciju kao i niz drugih staničnih signalnih putova koji su ključni za patofiziološke procese povezane sbubregozljeda, popravak i regeneracija. U tkivima osjetljivim na inzulin, kao što su jetra i skeletni mišići, GSK3b je aktivan u bazalnim uvjetima i potiskuje aktivnost glikogen sintaze.19,28 Inzulin brzo inaktivira GSK3b putem inhibitorne fosforilacije na serinu 9, što rezultira biosintezom glikogena. Sve veći broj dokaza sugerira da je disregulacija GSK3b povezana s dijabetesom melitusom tipa 2.19,29-31 Doista, postoje podaci koji ukazuju na prekomjernu ekspresiju i hiperaktivnost GSK3b u mišićima dijabetičara31-33 i u masnom tkivu pretilih dijabetičkih miševa.34 Štoviše. , transgena prekomjerna ekspresija GSK3b u skeletnim mišićima miševa uzrokuje oslabljenu toleranciju glukoze, inzulinsku rezistenciju i hiperinzulinemiju.29,35 Nasuprot tome, miševi kojima nedostaje GSK3b u skeletnim mišićima pokazali su poboljšanu toleranciju glukoze.36 Dosljedno, inhibitori GSK3, poput litija, mogu oponaša inzulin

djelovanje na stanične linije i tkiva.37 Štoviše, kod pretilih dijabetičkih miševa, inhibitori GSK3 poboljšali su osjetljivost na inzulin i homeostazu glukoze.38 Bubreg se tradicionalno nije smatrao ciljnim organom djelovanja inzulina. Međutim, uvjerljivi dokazi nedavno sugeriraju da inzulinska signalizacija u bubrežnim stanicama, posebno u podocitima, igra ključnu ulogu u održavanju glomerularne i bubrežne homeostaze.39-41 Neispravna inzulinska signalizacija u podocitima, zbog nedostatka inzulina ili rezistencije, vjerojatno je ključni pokretač za mnoge patološke lezije uočene u DN. Nadalje, kliničke studije su pokazale da inzulinska rezistencija korelira s pojavom i ozbiljnošću albuminurije čak i kod normotenzivnih pacijenata koji nemaju dijabetes, što sugerira da inzulinska rezistencija sama po sebi može uzrokovati albuminuriju.42 Slično, miševi s inzulinskom rezistencijom specifičnom za podocite, postignuti su uvjetno izbacivanje inzulinskog receptora u glomerularnim podocitima, razvijena albuminurija i glomerularne lezije koje rekapituliraju DN, unatoč odsutnosti hiperglikemije ili dijabetesa.41 Nasuprot tome, u životinja s dijabetesom, inzulinski senzibilizatori mogu usporiti napredovanje DN neovisno o kontroli glikemije.43 Ovi nalazi sugeriraju da inzulinska signalizacija regulira funkciju podocita neovisno o razinama glukoze u krvi. Međutim, kao ključnog pretvarača inzulinskog signalnog puta, uloga GSK3b u patogenezi i napredovanju DN-a uvelike je nedovoljno istražena.

U bubrezima, GSK3b se pretežno eksprimira u podocitima i, u manjoj mjeri, u mezangijalnim i endotelnim stanicama u glomerulu 20,21 i ekstenzivno se eksprimira u stanicama bubrežnih tubula. Postoje podaci iz naše i drugih skupina koji pokazuju da GSK3b posreduje u autonomnoj ozljedi podocita integracijom višestrukih patičkih signalnih putova podocita.17,20,44,45 Nedosljednost, genetska ili farmakološka blokada GSK3b može zaštititi od ozljede podocita i smanjiti proteinuriju u životinjskim modelima razne nedijabetičke glomerulopatije.21 Štoviše, u progresivnoj kroničnojbubregbolest, utvrđeno je da je GSK3b modulator oštećenja bubrežnih tubula i intersticija. Međutim, je li i kako GSK3b uključen u DN bilo je neizvjesno i intenzivno kontroverzno, iako je sadašnja studija pokazala da pojačana aktivacija GSK3b u bubrezima i u mokraćnim odljuštenim stanicama može biti povezana s razvojem ili progresijom DKD-a. Na primjer, kod štakora s dijabetesom izazvanim streptozotocinom, Lin i sur.46 otkrili su da inhibicija GSK3b adenozin trifosfatom–kompetitivni inhibitor (20 Z, 30 E)-6- Bromo u indirubin-30 -oksimu ( BIO) smanjena proteinurija i poboljšane glomerularne lezije DN u nedostatku korekcije hiperglikemije, što sugerira da GSK3b ima štetnu ulogu u DN. Također, kod štakora s dijabetesom izazvanim streptozotocinom, Paeng i sur.22 došli su do sličnih otkrića korištenjem BIO i zaključili da je pojačana aktivnost GSK3b unutar podocita u dijabetičkim uvjetima povezana s apoptozom podocita i gubitkom DN. Ovo je u skladu s drugom in vitro studijom, gdje je utvrđeno da GSK3b posreduje u dediferencijaciji i ozljedi podocita nakon izlaganja mediju s visokim sadržajem glukoze.47 Naprotiv, Mariappan i sur.48 tvrdili su da aktivacija GSK3b umjesto toga ublažava dijabetes induciranbubregozljeda. U njihovoj studiji, dijabetički miševi izazvani streptozotocinom liječeni su natrijevim nitroprusidom, donorom dušikovog oksida koji može aktivirati GSK3b. Otkrili su da su albuminurija, hipertrofija bubrega i nakupljanje izvanstaničnog matriksa u glomerulima poboljšani u nedostatku poboljšanja kod hipertenzije ili hiperglikemije. Međutim, ovi su nalazi u oštroj suprotnosti s podacima iz genski ciljanih knock-in miševa s konstitutivno aktivnim GSK3 koji su razvili spontanu albuminuriju i ozljedu podocita.49 Kako bi se pomirili proturječni nalazi, treba biti oprezan pri tumačenju podataka generiranih korištenjem kemijskih inhibitora ili aktivatora od GSK3b. Iako je više puta potvrđeno da je BIO vrlo selektivan inhibitor GSK3b male molekule, natrijev nitroprusid nije specifični aktivator GSK3b, ali je poznato da ima snažan hemodinamski učinak,50 što će vjerojatno zbuniti njegovo djelovanje na smanjenje albuminurije i renoprotektivno djelovanje u dijabetički miševi. Sve zajedno, unatoč nekim proturječnim podacima, prevladavajući dokazi idu u prilog tome da je GSK3b vjerojatno povezan sbubregozljedai proteinurija u DN. Nekoliko ograničenja za

treba spomenuti sadašnju studiju. Prvo, pretklinički podaci bili su ograničeni samo na dB/dB mišje modele. Kako bi se utvrdila mogućnost generalizacije uloge GSK3b udijabetička ozljeda bubrega, potrebno je potvrditi nalaze u drugim modelima DN, uključujući modele tipa 1 DN. Drugo, ovdje su klinička opažanja izvedena iz retrospektivnih kohorti dijabetičara s ograničenom veličinom uzorka i relativno kratkim vremenom praćenja. Doduše, potrebne su opsežne, prospektivne, randomizirane, multicentrične studije kako bi se potvrdila naša zapažanja i potvrdila moć GSK3b u odljuštenim stanicama urina u predviđanju ishoda DKD-a.

Ukratko, naše studije su pokazale da su bubrežna ekspresija i aktivnost GSK3b pojačani u eksperimentalnoj i kliničkoj DN. Aktivnost GSK3b u izljuštenim stanicama mokraće može poslužiti kao novi biomarker za predviđanje progresije DN. Naši podaci mogu utrti put opsežnom, dubinskom ispitivanju vrijednosti GSK3b u oljuštenim stanicama mokraće kao prognostički biomarker DN.

METODE

Studije na životinjama

Studije na životinjama odobrio je Institucionalni odbor za skrb o životinjama i one su u skladu s propisima Ministarstva poljoprivrede SAD-a i Vodičem Nacionalnog instituta za zdravlje za njegu ljudi i korištenje laboratorijskih životinja. Muški DB/DB miševi i kontrolni db/m legla stari 6 tjedana kupljeni su od Nanjinguniversity Model Animal Research Center (Nanjing, Kina) i smješteni u Central Animal Facility Sveučilišta Zhengzhou. Svi miševi su hranjeni ad libitum, a 8 do 10 miševa je ubijeno u naznačenoj dobi. Uzorci urina i krvi uzorkovani su u naznačenim vremenskim točkama. Nakon usmrćivanja, bubrezi su sakupljeni za daljnje ispitivanje. Razine albumina u urinu mjerene su korištenjem kompleta za kvantitativno ispitivanje enzimskog imunosorbentnog testa mišjeg albumina (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX). Razine kreatinina u urinu određene su pomoću kompleta za analizu kreatinina (BioAssay Systems, Hayward, CA).

Kultura stanica

Uvjetno besmrtni mišji podociti između prolaza 21 i 25 uzgajani su u mediju Roswell Park Memorial Institute 1640 dopunjenom s 10 posto fetalnog goveđeg seruma pod prihvatljivim uvjetima kao što je prethodno opisano.22 Subkulture podocita bile su podvrgnute nedopuštenim uvjetima kako bi se izazvala diferencijacija tijekom 14 dana i bile su zatim izložen normalnom miljeu/mediju kulture koji je sadržavao 5 mM glukoze, dijabetičkom miljeu koji se sastoji od glukoze (25 mM) i transformirajućeg faktora rasta b1 (2 ng/ml), ili kontrolnom mediju visoke osmolalnosti koji sadrži 20 mM manitola tijekom 48 sati. Mišje proksimalne tubularne epitelne stanice i mišje glomerularne mezangijske stanice održavane su u Dulbeccovom modificiranom Eagleovom mediju/F12 s dodatkom 5 posto fetalnog goveđeg seruma. Stanice su postavljene na 70 posto konfluencije u mediju koji je sadržavao 5 posto fetalnog goveđeg seruma tijekom 24 sata, a zatim su podvrgnute izgladnjivanju seruma tijekom dodatnih 24 sata nakon čega je uslijedilo izlaganje normalnom miljeu/mediju za kulturu koji je sadržavao 5 mM glukoze, dijabetičkom miljeu koji se sastoji od glukoze (25 mM) i transformirajućeg faktora rasta b1 (2 ng/ml), ili medij za kontrolu visoke osmolalnosti koji sadrži 5 mM glukoze i 20 mM manitola tijekom 48 sati. Viabilnost stanica procijenjena je isključivanjem Trypan blue. U naznačenim vremenskim točkama, stanice su fiksirane ili su stanični lizati sakupljeni za daljnje istraživanje.

Prolazna transfekcija vektora

Vektore koji kodiraju prazan vektor ili hemaglutininom (HA)– označeni konstitutivno aktivni (S9A) mutant (S9A-GSK3b-HA/ pcDNA3) GSK3b osigurao je dr. Gail VW Johnson (Birmingham, AL) i transficirani su u kultivirane podocite, mezangijske stanice i tubularne epitelne stanice korištenjem Lipofectamine 2000 (Life Technologies, Carlsbad, CA) kao što je prethodno opisano.44 Učinkovitost transfekcije potvrđena je imunofluorescentnim bojenjem ili imunoblotingom za HA nakon 12 sati. Stanice su zatim sakupljene i pripremljene za Western blot analizu ili druge testove.

RNAi

Grupa od 3 miša GSK3b-specifična mala, interferirajuća RNA duplexa—50-CUUGUCCUGUAGAACUUUCtt-30, 50-AUGAUCCAUUUCCAAUCACtt-30 i 50-AUACCGCAGUCGGACUAUGtt-30 — dizajnirani su i sintetizirani prema potpunoj kodirajućoj sekvenci mišjeg gena GSK3b (pristupni br. GenBank BC060743.1). Osim toga, kodirana mala, interferirajuća sekvenca RNA (50-GCGAGUAGCGCUAGGAAGUtt-30) bez sličnosti sekvence s bilo kojim poznatim sekvencama gena miševa, štakora ili ljudi korištena je kao kontrola za RNAi. Učinkovitost utišavanja gena posredovanog lipofektaminom (Invitrogen, Carlsbad, CA) procijenjena je imunoblot analizom za GSK3b. Zadovoljavajuća supresija ekspresije proteina GSK3b opažena je u kultiviranim podocitima, mezangijskim stanicama i tubularnim epitelnim stanicama 24 sata nakon RNAi. Stanice su zatim podvrgnute normalnom miljeu/mediju kulture, dijabetičkom miljeu ili kontrolnom mediju visoke osmolalnosti 48 sati, kako je gore navedeno, prije nego što su stanice obrađene za daljnja ispitivanja.

Kliničke studije

Klinički dio ove studije bio je u skladu s etičkim smjernicama Helsinške deklaracije iz 1975. i odobrio ga je Institucionalni revizijski odbor Prve pridružene bolnice Sveučilišta Zhengzhou. Sudionici istraživanja na ljudima nisu bili posebno angažirani za ovu studiju. Svi klinički podaci prikupljeni su retrospektivnim pregledom karata i pregledom arhiviranih dijelova tkiva ili uzoraka urina. Prekomjerni ili odbačeni uzorci biopsije bubrega, kao i frakcionirani uzorci urina, rutinski su pohranjeni u Institutu za nefrologiju Prve pridružene bolnice Sveučilišta Zhengzhou. Arhivirana neidentificirana tkiva biopsije bubrega fiksirana u formalinu i parafinom od pacijenata u različitim stadijima DN nasumično su odabrana za ispitivanje. Dodatni uzorci bubrega bez histomorfoloških lezija dobiveni su iz bubrega odbačenih za transplantaciju zbog vaskularnih anomalija ili iz tkiva prijeimplantacijske biopsije i služili su kao normalne kontrole. Za retrospektivnu kohortnu studiju, ukupno 127 pacijenata sa šećernom bolešću tipa 2, koji su od 2010. praćeni sa skupljenim uzorcima frakcioniranog urina, retrospektivno je pregledano za uključivanje u ovu studiju. Proučavani pacijenti bili su u dobi između 29 i 80 godina i dijagnosticiran im je dijabetes tipa 2 prema kriterijima Američke dijabetičke udruge. Kriteriji isključenja uključivali su gubitak praćenja, neodgovarajuće informacije,bubregdisfunkcija, or overt proteinuria at baseline, or other superimposed kidney diseases such as acute kidney injury or glomerulopathies. Finally, 60 patients have enrolled in this study for further assessment. All patients had been followed up for >5 godina. Tijekom rutinskog praćenja dokumentirani su demografski podaci, kao i klinički parametri, uključujući spol, dob, komorbiditete, lijekove, trajanje dijabetesa, krvni tlak, razinu glikemije, razinu kreatinina u serumu, podatke analize urina, UAE i eGFR. Klinički ishod nakon 5 godina praćenja bila je prisutnost ili odsutnost progresije bubrežnog oštećenja, što je definirano ili kao 25-postotno smanjenje eGFR-a ili kao progresija albuminurije na što ukazuje eskalacija ozbiljnosti albuminurije duž različitih kliničkih stadija DN, odnosno normoalbuminurija, mikroalbuminurija, makroalbuminurija ili izražena proteinurija. Svi su pacijenti dali pismeni informirani pristanak.

Procjena renalne morfologije i imunohistokemijska analiza

Blokovi mišjeg bubrežnog tkiva umetnuti u parafin i formalinom fiksirani su na rezove od 3- mm. Za opću histologiju, rezovi su obrađeni za bojenje periodičnom kiselinom po Schiffu. Imunohistokemijsko bojenje za GSK3b i p-GSK3b provedeno je pomoću kompleta VECTASTAIN ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA) kao što je prethodno opisano.20 Kao negativna kontrola, primarno protutijelo zamijenjeno je neimunim serumom iste vrste; nije došlo do mrlja. Morfološke značajke svih presjeka procijenio je jedan promatrač na slijepi način uz pomoć renalnog patologa.

Imunofluorescentno bojenje

Kultivirane stanice ili zamrznuti kriostatski odsječci fiksirani su i obojeni primarnim antitijelima, nakon čega je uslijedila primjena sekundarnih antitijela konjugiranih Alexa Fluor (Invitrogen). Kao negativna kontrola, primarna antitijela su zamijenjena preimunim IgG iz iste vrste; nije došlo do mrlja. Na kraju, rezovi su obojeni s 40,6-diamidino-2-fenilindolom ili propidijevim jodidom i montirani s VECTASHIELD medijem za montiranje (Vector Laboratories). Za FL fluorescentnu mikroskopiju, sve su sekcije analizirane u isto vrijeme kako bi se isključili artefakti zbog varijabilnog raspadanja fluorokroma. Isječci su ispitani korištenjem Olympus FL fluorescentnog mikroskopa opremljenog digitalnom kamerom Spot II (Olympus, Tokyo, Japan). Za dvobojno bojenje, slike su snimljene uzastopno kako bi se izbjegla interferencija boje. Softver ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD) korišten je za naknadnu obradu slika, na primjer, skaliranje, spajanje i analizu kolokalizacije.

Kompjuterizirana morfometrija

Slike imunohistokemijskog bojenja snimljene su i digitalizirane korištenjem kompjutoriziranog sustava za analizu slike koji se sastoji od digitalne kamere visoke rezolucije s nabojno spregnutim uređajem spojene na mikroskop (Olympus BX41, Olympus) i na računalo. Slike su prikazane u razlučivosti piksela od 1024 768 piksela (prostorna razlučivost, 0,24 mm/pikselu). Za slike imunohistokemijskog bojenja tkiva ljudskih bubrega korišten je softver ImageJ za segmentaciju slike, uspostavljanje praga i mjerenje intenziteta signala. Po potrebi su izvršene ručne korekcije. Sveukupno je uzorkovano 10 glomerula ili 10 nasumičnih tubulointersticijskih polja za morfometrijsku analizu, a konačni podaci izraženi su kao vrijednost integrirane gustoće piksela u odnosu na kontrolnu skupinu.

Western imunoblot analiza

Kultivirane stanice su lizirane;bubregtkivaili izolirani bubrežni glomeruli homogenizirani su u puferu za radioimunoprecipitacijski test dopunjenom inhibitorima proteaze, a uzorci su obrađeni za imunoblot analizu. Za imunoblot analizu ograničenog broja oljuštenih stanica u urinu, protokol Western blota modificiran je kako je prethodno opisano upotrebom visokoučinkovitih NuPAGE Bis-Tris gelova (Invitrogen) i visokokvalitetnih prijenosnih membrana.25 Pročišćeni imunoblot mogao bi otkriti umjereno izražene proteine ​​u samo 1000 stanica. Antitijela protiv GSK3b, fibronektina, kolagena IV, aktina i gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze (GAPDH) kupljena su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); oni protiv sinaptopodina su kupljeni od PROGEN Biotechnik GmbH (Heidelberg, Njemačka); a oni protiv ZO-1 i p-GSK3b dobiveni su od Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Statistička analiza

All in vitro studies were repeated 3 to 6 times. For immunoblot analysis, bands were scanned and the integrated pixel density was determined using a densitometer and the ImageJ analysis program, version 1.48 (National Institutes of Health). Data were expressed as mean -SD or median (interquartile range). All included patients had baseline data. Patients with missing data or lost to follow-up were excluded from this study. Continuous variables were analyzed as appropriate by using the t-test, Mann-Whitney U test, or 1-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Student-NewmanKeuls test if there were 3 comparisons or by the Scheffé test if there were >3 usporedbe. Podaci o kategorijama uspoređeni su između skupina pomoću hi-kvadrat testa. Linearna regresijska analiza primijenjena je za ispitivanje mogućih odnosa između 2 parametra. Univarijatne Coxove regresijske analize proporcionalnih opasnosti provedene su kako bi se procijenile povezanosti između relevantnih varijabli i rizika od progresije bubrežnog oštećenja, nakon čega su uslijedile multivarijatne analize s obzirom na potencijalne zbunjujuće faktore. Provedena je analiza ROC krivulje i izmjerene su površine ispod ROC krivulja kako bi se analizirala snaga određenih varijabli u predviđanju progresije bubrežnog oštećenja kod dijabetičara. Varijable s nenormalnom distribucijom, kao što je UAE, transformirane su logaritmom kako bi se postigla normalnost za analizu regresijske analize rizika Coxovog udjela i analize ROC krivulje. Sve statističke analize provedene su korištenjem PSS verzije 22 (IBM Corporation, Armonk, NY). P vrijednosti<0.05 in2-tailed="" tests="" were="" considered="" statistically="" significant="" in="" all="">

RAZOTKRIVANJE

Svi autori izjavili su da nema suprotstavljenih interesa.

ZAHVALA

Dio ove studije predstavljen je kao usmena prezentacija na KidneyWeek 2016: godišnjem sastanku Američkog nefrološkog društva, 15. i 20. studenog 2016., Chicago, IL. RG je djelomično poduprla Zaklada za zdravlje. XL je dobio potporu istraživačke stipendije za izvanškolsko usavršavanje. ZL je dobio potporu Kineske nacionalne zaklade za prirodne znanosti U1604284, 81770672 i 81873612. Financijeri nisu imali nikakvu ulogu u osmišljavanju i provođenju ove studije, prikupljanju i tumačenju podataka ili pripremi i odobrenju rukopisa.

AUTORSKI PRILOZI

RG je osmislio konceptualne ideje. XL, ZL i RG pridonijeli su dizajnu studije. XL, PW, BC, YG, AYG i BF proveli su pokuse s kulturom stanica. XL i ZL izveli su pokuse na životinjama i prikupili podatke od dijabetičara. XL, LJW, DKM, LDD, ZL, te pridonijeli raspravi i interpretaciji rezultata. preuzeo vodstvo u pisanju rukopisa. XL, BC i BF pridonijeli su uređivanju rukopisa. Svi su se autori složili da cjelokupni koncept i vlasništvo nad ovim radom pripada RG-u. Svi su autori odobrili konačni rukopis.

DOPUNSKI MATERIJAL

Dopunske metode.

Tablica S1. Karakteristike kontrolnih ispitanika i bolesnika s dijabetičkom nefropatijom, stratificiranih prema histološkim klasama dijabetičke nefropatije. Tablica S2. Osnovni demografski, klinički i laboratorijski podaci retrospektivne skupine bolesnika s dijabetesom u ranom stadiju bez znakova DKD-a. Tablica S3. Demografski, klinički i laboratorijski podaci bolesnika s dijabetesom tipa 2 u ranom stadiju, stratificirani prema njihovim bubrežnim ishodima nakon 5 godina praćenja. Slika S1. Pojačana bubrežna aktivnost GSK3b predviđa razvoj i težinudijabetičarbubregbolestkod db/db miševa. Muški db/db i db/m miševi praćeni su između 4. i 13. tjedna starosti. (A) Krv je uzorkovana miševima koji nisu bili natašte u dobi od 4 i 7 tjedana, te su ispitane razine glukoze u plazmi. *P < 0.001="" naspram="" db/m="" miševa="" u="" dobi="" od="" 7="" tjedana.="" n="" ¼="" 15–18.="" (b)="" točkasta="" mokraća="" uzorkovana="" je="" u="" dobi="" od="" 4,="" 7,="" 10="" i="" 13="" tjedana="" i="" podvrgnuta="" ispitivanju="" albumina="" u="" mokraći="" i="" kreatinina="" u="" mokraći="" za="" određivanje="" omjera="" albumin-kreatinin="" u="" mokraći="" (uacr).="" *p="">< 0,001="" u="" odnosu="" na="" db/m="" miševe="" u="" dobi="" od="" 10="" tjedana="" (n="15–18);" #p=""><0,001 naspram="" db/m="" miševa="" u="" dobi="" od="" 13="" tjedana.="" n="" ¼="" 15–18.="" (c)="" svi="" miševi="" su="" primili="" otvorenu="" biopsiju="" bubrega="" u="" dobi="" od="" 7="" tjedana,="" a="" uzorci="" biopsije="" obrađeni="" su="" za="" imunoblot="" analizu="" na="" p-gsk3b,="" gsk3b="" i="" gapdh.="" (d)="" imunoblotovi="" su="" podvrgnuti="" denzitometrijskoj="" analizi.="" relativna="" zastupljenost="" gsk3b="" i="" p-gsk3b="" određena="" je="" kao="" denzitometrijski="" omjer="" odnosne="" molekule/gapdh="" kao="" višestruke="" promjene="" u="" usporedbi="" s="" kontrolnim="" db/m="" miševima.="" relativna="" aktivnost="" gsk3b="" izračunata="" je="" kao="" omjeri="" p="" gsk3b="" prema="" gsk3b="" kao="" nabori="" kontrolnih="" db/m="" miševa.="" (e)="" linearna="" regresijska="" analiza="" pokazala="" je="" statistički="" značajnu="" pozitivnu="" korelaciju="" između="" bubrežne="" aktivnosti="" gsk3b="" u="" dobi="" od="" 7="" tjedana="" u="" db/db="" miševa="" i="" razvoja="" i="" ozbiljnosti="" albuminurije,="">dijabetičarbubregbolestu dobi od 13 tjedana. R=0.699; P ¼ 0.0{{20}}1. (F) Analiza radne karakteristike prijemnika pokazala je da aktivnost bubrežnog GSK3b u ranim stadijima dijabetesa (7 tjedana starosti) pruža izvrsnu točnost i snagu u predviđanju razvoja albuminurije i DKD u dobi od 13 tjedana kod db/db miševa. Slika S2. Inzulinska rezistencija i visoka glukoza u okolini sinergistički aktiviraju GSK3b u stanicama bubrega. (A) Kultivirani mišji podociti, (B) mezangijske stanice glomerula u mokraći (MMC) i (C) epitelne stanice bubrežnih tubula (TEC) transficirane su kodiranim siRNA oligonukleotidima (siCon) ili siRNA oligonukleotidima (siIRb) specifičnim za b izoformu inzulinski receptor (IRB) za modeliranje stanja inzulinske rezistencije in vitro. Stanice su zatim bile izložene 48 sati normalnom miljeu koji sadrži glukozu (NG) ili miljeu za dijabetes s visokim sadržajem glukoze (HG). Stanični lizati su sakupljeni i podvrgnuti imunoblot analizi za IRB, p-GSK3b, GSK3b i GAPDH nakon čega je uslijedila denzitometrijska analiza mrlja. *P < 0,01="" naspram="" ekspresije="" irb-a="" u="" stanicama="" tretiranim="" sicon-om="" izloženih="" istom="" okruženju="" (n="3)," #p="">< 0,05="" naspram="" iste="" ekspresije="" proteina="" u="" skupini="" siirb="" þ="" ng="" ili="" sicon="" þ="" hg="" (n="3)," &p="">< 0,05="" u="" odnosu="" na="" istu="" ekspresiju="" proteina="" u="" drugoj="" þ="" hg="" ili="" siirb="" þ="" ng="" skupini="" (n="3)." slika="" s3.="" razine="" ekspresije="" gsk3b="" mrna="" u="" uzorcima="" ljudskih="" bubrega="" dobivenih="" od="" zdravih="" živih="" donora="" i="" pacijenata="" s="" dijabetičkom="" nefropatijom.="" podaci="" su="" izvedeni="" s="" www.nephroseq.org="" na="" temelju="" skupa="" podataka="" ju="" ckd="" glom51="" i="" izraženi="" kao="" intenzitet="" usmjeren="" na="" medijan="" log2.="" slika="" s4.="" povećana="" aktivnost="" gsk3b="" u="" oljuštenim="" stanicama="" mokraće="" prikupljenim="" od="" pacijenata="" s="" dijabetesom="" u="" ranoj="" fazi="" predviđa="" razvoj="" dijabetičke="" bolesti="" bubrega.="" (a,="" b)="" detekcija="" gsk3b="" i="" aktiviranog="" gsk3b="" u="" oljuštenim="" stanicama="" mokraće="" prikupljenim="" od="" pacijenata="" s="" dijabetesom="" u="" ranom="" stadiju="" (pts)="" i="" zdravih="" kontrola="" (ctrl).="" oljuštene="" stanice="" iz="" mokraće="" su="" sakupljene="" i="" lizirane.="" stanični="" lizati="" obrađeni="" su="" za="" imunoblot="" analizu="" na="" gsk3b,="" p-gsk3b="" i="" gapdh.="" (c)="" imunoblotovi="" su="" podvrgnuti="" denzitometrijskoj="" analizi.="" relativna="" zastupljenost="" gsk3b="" i="" p-gsk3b="" određena="" je="" kao="" denzitometrijski="" omjeri="" odnosne="" molekule/gapdh="" kao="" višestruke="" promjene="" u="" usporedbi="" s="" kontrolama="" (ctrl).="" relativna="" aktivnost="" gsk3b="" izračunata="" je="" kao="" omjeri="" p-gsk3b="" prema="" gsk3b="" kao="" nabori="" normalne="" kontrole="" (ctrl).="" (d)="" analiza="" krivulje="" radne="" karakteristike="" prijemnika="" pokazala="" je="" da="" relativna="" aktivnost="" gsk3b="" (omjer="" p-gsk3b/gsk3b)="" u="" odljuštenim="" stanicama="" mokraće="" prikupljenim="" od="" pacijenata="" s="" dijabetesom="" u="" ranoj="" fazi="" pruža="" izvrsnu="" točnost="" u="" predviđanju="">dijabetička bolest bubregaza 5 godina, s površinom ispod krivulje (AUC) 0,886.

REFERENCE

1. Umanath K, Lewis JB. Ažuriranje dijabetičke nefropatije: temeljni nastavni plan i program 2018. Am J Kidney Dis. 2018;71:884-895.

2. Gregg EW, Li Y, Wang J, et al. Promjene u komplikacijama povezanim s dijabetesom u Sjedinjenim Državama, 1990-2010. N Engl J Med. 2014;370:1514-1523.

3. Haller H, Ito S, Izzo JL Jr, et al. Olmesartan za odgodu ili prevenciju mikroalbuminurije kod dijabetesa tipa 2. N Engl J Med. 2011;364:907-917.

4. Schena FP, Gesualdo L. Patogenetski mehanizmi dijabetičke nefropatije. J Am Soc Nephrol. 2005;16(dodatak 1):S30–S33.

5. Ritz E, Zeng XX, Rychlik I. Klinička manifestacija i prirodna povijest dijabetičke nefropatije. Doprinesite Nephrolu. 2011;170:19-27.

6. Holman RR, Paul SK, Bethel MA, et al. 10-godišnje praćenje intenzivne kontrole glukoze kod dijabetesa tipa 2. N Engl J Med. 2008;359:1577-1589.

7. Perkins BA, Ficociello LH, Ostrander BE, et al. Mikroalbuminurija i rizik od ranog progresivnog pada bubrežne funkcije kod dijabetesa tipa 1. J Am Soc Nephrol. 2007;18:1353-1361.

8. Koye DN, Magliano DJ, Reid CM, et al. Rizik od progresije normoalbuminurijske kronične bubrežne bolesti do krajnjeg stadija bolesti bubrega u osoba s dijabetesom: studija CRIC (kohorta kronične bubrežne insuficijencije). Am J Kidney Dis. 2018;72:653-661.

9. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Potreba za ranim prediktorima rizika od dijabetičke nefropatije: je li stopa izlučivanja albumina dovoljna? Dijabetes. 2000;49:1399-1408.

10. Caramori ML, Fioretto P, Mauer M. Niska stopa glomerularne filtracije u normoalbuminurnih pacijenata s dijabetesom tipa 1: pokazatelj uznapredovalih glomerularnih lezija. Dijabetes. 2003;52:1036-1040.

11. Krolewski AS. Progresivno zatajenje bubrega: nova paradigma dijabetičke nefropatije kod dijabetesa tipa 1. Skrb za dijabetes. 2015;38:954-962.

12. Robles NR, Villa J, Gallego RH. Neproteinurička dijabetička nefropatija. J Clin Med. 2015;4:1761-1773.

13. Adler AI, Stevens RJ, Manley SE, et al. Razvoj i progresija nefropatije kod dijabetesa tipa 2: prospektivna studija o dijabetesu Ujedinjenog Kraljevstva (UKPDS 64). Kidney Int. 2003;63:225-232.

14. Gluhovschi C, Gluhovschi G, Petrica L, et al. Urinarni biomarkeri u procjeni rane dijabetičke nefropatije. J Diabetes Res. 2016;2016: 4626125.

15. Doi T, Moriya T, Fujita Y, et al. Urinarni IgG4 i Smad1 su specifični biomarkeri za bubrežne strukturne i funkcionalne promjene u ranim fazama dijabetičke nefropatije. Dijabetes. 2018;67:986-993.

16. De S, Kuwahara S, Hosojima M, et al. Izlučivanje megalina punom dužinom putem urina posredovano egzocitozom povezano je s patogenezom dijabetičke nefropatije. Dijabetes. 2017;66:1391-1404.

17. Xu W, Ge Y, Liu Z, et al. Glikogen sintaza kinaza 3b diktira pokretljivost podocita i promjenu žarišne adhezije moduliranjem aktivnosti paksilina: implikacije za zaštitni učinak niske doze litija u podocitopatiji. Am J Pathol. 2014;184:2742-2756.

18. Ali A, Hoefiich KP, Woodgett JR. Glikogen sintaza kinaza-3: svojstva, funkcije i regulacija. Chem Rev. 2001;101:2527-2540.

19. Beurel E, Grieco SF, Jope RS. Glikogen sintaza kinaza-3 (GSK3): regulacija, djelovanje i bolesti. Pharmacol Ther. 2015;148:114–131.

20. Li C, Ge Y, Dworkin L, et al. B izoforma GSK3 posreduje u autonomnoj ozljedi podocita u proteinuričkoj glomerulopatiji. J Pathol. 2016;239:23.