2. dio ERCC1 mutacije sprječavaju popravak oštećenja DNK i uzrokuju disfunkciju jetre i bubrega kod pacijenata

Kontakt:ali.ma@wecistanche.com

Kliknite ovdje za 1. dio

2. dio

Kliknite na Cistanche NZ za bolest bubrega

Rasprava

Novi slučaj bialelaERCC1mutacije Samo dvije jedinke s dvoalelnimERCC1do danas su prijavljene mutacije, a obje su imale značajke slične CS-u. Najteže pogođena osoba (165TOR) imala je nonsens varijantu (Q158X) i F231L missense varijantu u (HhH)2 motivu ERCC1 (Sl. S5 F), pokazala je zastoj u rastu, neuspjeh u razvoju i kontrakture te je umrla nakon prve godine života zbog upale pluća (Jaspers i sur., 2007.). Druga pogođena osoba (CS20LO) imala je kontrakture, mikrocefaliju i hipertoniju i bila je homozigotna za F231L missense varijantu te je umrla u drugoj godini života (Kashiyama et al., 2013.).

Izvještavamo o dva brata i sestara s bialelomERCC1mutations—a paternally inherited missense variant (p.R156W; c.466C>T) i nulti alel zbog intragenske delecije naslijeđene s majke. Sav preostali protein ERCC1 izražen u stanicama ovih pacijenata nosi aminokiselinsku supstituciju R156W, koja prekida slani most između pozitivno nabijenog ostatka R156 i suprotnog negativno nabijenog ostatka D129 koji se nalazi odmah ispod XPA-veznog džepa u središnjoj domeniERCC1. Utjecaj ove supstitucije je dvostruk: (1) ona snažno umanjuje ukupnu stabilnost ERCC1 i njegovog partnera za vezanje XPF, i (2) ona posebno utječe na međudjelovanje s XPA (Slika 9).

Smanjene razine nuklearnog proteina ERCC1 zbog djelomičnog pogrešnog savijanja

Western blot i imunofluorescentne analize otkrile su da je ukupnaERCC1and XPF protein levels are dramatically reduced to below 20% of WT levels in the fibroblasts from both siblings. This effect is also recapitulated by the bi-allelic KI of the missense mutation (p.R156W; c.466C>T) u endogenomERCC1lokus stanica RPE1-hTERT. Zanimljivo je da je potpuni gubitak ERCC1 kod miševa doveo do smrti unutar 4 tjedna, dok je povećanje razine proteina na oko 15 posto razina u WT miševa peterostruko produžilo životni vijek (Weeda et al., 1997.), što sugerira da čak i niske razine ERCC1 znatno povećati potencijal za održivost. U skladu s našim nalazima, prethodne studije su pokazale da missense mutacije u središnjoj domeniERCC1općenito uzrokuju destabilizaciju (Sijbers et al., 1996b), što ukazuje da je ovo područje važno za stabilnost proteina.

Nedavno objavljena kriogena elektronska mikroskopska struktura pune duljineERCC1-XPF heterodimer (Jones et al., 2020.) otkriva da jeERCC1R156ostatak se nalazi na samom rubu heterodimera. Nagađamo da povećana glomaznost i izmijenjena elektronička struktura supstitucije arginina triptofanom ne samo da remeti XPA-vezujući džep, već i dimerizacijsko sučelje između središnje domene ERCC1 i nukleazne domene XPF-a, uzrokujući opću destabilizaciju (Sl. S5 F). Zanimljivo je da se missense varijanta XPFR799W nalazi na istom sučelju na XPF strani (Sl. S5 F) i također rezultira destabilizacijom i ozbiljno smanjenim razinama XPF proteina (Mori et al., 2018). Kod jedne oboljele osobe (CALIF1010) koja je imala značajke slične CS-u i segmentalne progeroide, varijanta XPFR799W naslijeđena je zajedno s intergenskom delecijom u drugom alelu XPF, što je rezultiralo jakim defektom NER u kombinaciji s blagim defektom popravka ICL (Mori et. al., 2018), slično braći i sestrama prijavljenima u ovoj studiji.

Ektopična ekspresija inducibilne verzijeERCC1R156Wtijekom 24 h omogućilo nam je da postignemo WT razine ovog mutantnog proteina, što je rezultiralo pogrešnom lokalizacijom u citoplazmi, smanjenom interakcijom s XPF-om i povećanom interakcijom s šaperonima koji savijaju proteine, kao što je otkriveno MS-om. Svi ovi nalazi podupiru ideju daERCC1R156Wdjelomično se pogrešno savija i razgrađuje u stanicama pacijenata, što rezultira -80 postotnim smanjenjem razina nuklearnog proteina ERCC1. KI ERCC1R156W u stanicama RPE1-hTERT podupire ovaj zaključak.

Kada se uspoređujuERCC1i razine proteina XPF u stanicama PV46LD i PV50LD s onima u stanicama teže pogođenih pojedinaca (165TOR i CS20LO), primijetili smo da su te razine usporedive, ili možda čak niže, u stanicama braće i sestara opisanih u ovoj studiji (Slika 3. C i sl. S3, E i F; Jaspers i sur., 2007.; Kashiyama i sur., 2013.). Imajte na umu da je CS20LO homozigot za ERCC1F231L, dok je 165TOR heterozigot i nosi dodatno prerano zaustavljanje na drugomERCC1alel (Q158X). Ovi nalazi sugeriraju da uz smanjene razine proteina, funkcionalnost mutantnog proteina koji se još eksprimira i kombinaciju dvaju mutiranih alela treba uzeti u obzir kao potencijalni modulator fenotipske ozbiljnosti i ekspresije.

ERCC1R156W: Diferencijalni utjecaj na putove popravka DNK ovisne o ERCC1-

Ekspresija ERCC1R156W-GFP u ERCC1-KO stanicama na razinama sličnim ERCC1WT omogućila nam je da odvojimo utjecaj zamjene aminokiselina na stabilnost proteina od utjecaja na funkcionalnost proteina. Dok je mutirani protein ERCC1R156W bio ozbiljno oslabljen u svojoj UV-induciranoj interakciji s XPA i ribom i nije se uspio učinkovito lokalizirati na mjesta UV-induciranih lezija DNA, još uvijek smo otkrili značajnu (~40 posto) aktivnost popravka u UDS testovima, klonogenim preživljavanjima, i in vitro NER testovi. Ova otkrića upućuju na to da mutirani protein ERCC1 koji vrlo slabo stupa u interakciju s kompleksom NER još uvijek može podržati značajne razine aktivnosti NER (~40 posto) unutar stanica. Zajedno, ovi nalazi sugeriraju da niska razina ekspresije ERCC1 (~20 posto) u kombinaciji s preostalom GGR aktivnošću mutantnih proteina koji se još uvijek eksprimiraju pruža dovoljnu zaštitu za sprječavanje PV46LD i PV50LD da razviju puni XP. Zaista, rezidualna GGR aktivnost još uvijek je otkrivena pod osjetljivijim uvjetima u UDS testovima u usporedbi s fibroblastima ozbiljno pogođenog i raku sklonog pacijenta XP-A. Unatoč tome, oba pacijenta još uvijek mogu biti u opasnosti od razvoja raka kože, pa se stoga savjetuje zaštita od sunčeve svjetlosti. Preostala aktivnost u stanicama PV46LD i PV50LD bila je slična ili niža od aktivnosti popravka koju smo otkrili u stanicama 165TOR ili CS20LO (Slika 6 J; Jaspers i sur., 2007; Kashiyama i sur., 2013). Klinička ozbiljnost stoga nije u korelaciji s aktivnošću NER-a, ali je vjerojatno posljedica uloge ERCC1 izvan NER-a koja je važna tijekom razvoja.

Unatoč našim nalazima da je ERCC1R156W pokazao smanjenu interakciju sa SLX4 te da je manje učinkovito regrutiran na mjesta lokalne indukcije ICL-a, daljnja analiza otkrila je da je mutirani protein ERCC1R156W bio samo blago pogođen u podržavanju popravka ICL-a kada je ektopično izražen u ERCC-u1- KO ćelije. Međutim, učinak na popravak ICL-a bio je puno blaži od utjecaja supstitucije R156W na NER, što, u kombinaciji s ranijim nalazima da popravak ICL-a zahtijeva mnogo manje proteina ERCC1 nego popravak NER-specifičnih lezija DNA (Jaspers et al. , 2007; Sijbers et al., 1996b), može vrlo dobro objasniti blagi utjecaj na popravak ICL-a. U fibroblastima pacijenata, koji imaju snažno smanjene razine ERCC1, otkrili smo umjerenu osjetljivost, kao i povećano lomljenje kromosoma nakon izlaganja spoju MMC koji inducira ICL, iako mnogo blaže nego stanice pacijenta s FA koje su uključene paralelno. Važno je da ni PV46LD ni PV50LD nisu pokazali nikakve očite znakove kliničkih značajki sličnih FA, što sugerira da mutirani protein ERCC1R156W pruža dovoljnu zaštitu od niskog endogenog ICL opterećenja kod ovih pacijenata.

Nedostatak ERCC1 uzrokuje oštećenje jetre i bubrega

Miševi koji su KO za ERCC1 ili XPF pokazuju ozbiljno trčanje (tj. manji i slabiji od WT miševa) i umiru prije prva 4 tjedna života zbog teškog zatajenja jetre (McWhir i sur., 1993; Sijbers i sur., 1996b; Tian i sur., 2004; Weeda i sur., 1997). Ekspresija ERCC1 specifična za jetru kod ovih miševa djelomično je ispravila manju veličinu i produljila životni vijek do 12 tjedana, ali je također razotkrila teškeporemećaj rada bubregai zatajenje bubrega kao sekundarni uzrok smrti (Selfridge et al., 2001). KO miševi specifični za XP ili FA ne pokazuju bolest jetre, sugerirajući da ovaj fenotip nije uzrokovan defektom popravka NER ili ICL. Moguće je da bi djelomična redundancija između ova dva puta, koja je izgubljena kod ERCC1-KO miševa s manjkom oba puta, mogla objasniti ovaj fenotip. U skladu s ovom idejom, hepatocit ibubreg-proksimalne tubulne stanicepostao poliploidan u ERCC1-KO miševa i akumulirao visoke razine p53 (McWhir i sur., 1993.; Selfridge i sur., 2001.; Weeda i sur., 1997.), što ukazuje na nakupljanje endogenog oštećenja DNA u tim organima. može se pojaviti. Precizna priroda ove endogene DNA lezije, međutim, ostaje nejasna.

Zanimljivo je da miševi sa zajedničkom inaktivacijom popravka NER-a i ICL-a ne pokazuju disfunkciju jetre, što sugerira da redundancija između ovih putova popravka DNK nije jedino objašnjenje i da dodatna funkcija ERCC1-XPF izvan ovih putova popravka DNK doprinosi na oštećenje jetre (Mulderrig i Garaycoechea, 2020.). Moguće je da je ERCC1-XPF uključen u dodatne puteve popravka DNK koji se bave endogenim oštećenjem DNK. Na primjer, nedavno je pokazano da ERCC1-XPF djeluje na alternativne strukture DNK, kao što je Z-DNK, pri čemu surađuje s proteinima popravka neusklađenosti umjesto NER ili ICL faktora popravka (McKinney et al., 2020.). Osim toga, pokazalo se da je ERCC1-XPF uključen u podput popravka baze ekscizije zajedno s RECQ1 helikazom (Woodrick et al., 2017.).

Dvoje braće i sestara (PV46LD i PV50LD) u ovoj studiji pokazali su neuspjeh u razvoju, nizak rast i nedostatak potkožnog masnog tkiva, što podsjeća na malu veličinu primijećenu kod ERCC1-KO miševa (McWhir et al., 1993.; Selfridge i sur., 2001.; Weeda i sur., 1997.). Štoviše, kod braće i sestara razvila su se oštećenja jetre s pretežno kolestatskom slikom koja su dovela do ortotopske transplantacije jetre prije dobi od 9 godina. Ova je intervencija jasno spriječila ranu smrt, ali nije poboljšala neuspjeh u razvoju, što je vidljivo iz rasta težine, visine i opsega glave nakon transplantacije znatno ispod trećeg centila.

Zanimljivo je da je kolestatska bolest jetre prijavljena kao uobičajena značajka u egipatskih bolesnika s CS-om, što sugerira da bi se to trebalo pažljivije pratiti u bolesnika s CS-om drugog etničkog podrijetla kako bi se vidjelo je li to češća značajka nego što se prije priznavalo (Abdel Ghaffar et al. , 2011). Iako nisu opisane abnormalnosti jetre u bolesnika s XP-om, postoje neki slučajevi jetrene citolize (razgradnje ili pucanje stanica) u bolesnika s FA (Masserot-Lureau et al., 2012.), što se može razlikovati od abnormalnosti jetre uočenih u ERCC-u. 1- braće i sestara s nedostatkom. Histološki pregled biopsije jetre starijeg brata i sestre (PV50LD) otkrio je promjene u morfologiji hepatocita s povećanjem jezgre i varijabilnošću, kao što je primijećeno kod miševa s nedostatkom ERCC1- (Sl. S1 D; N´uñez et al., 2000. ).

Drugi uzrok smrti kod ERCC{0}}KO miševa s ekspresijom ERCC1 specifične za jetru bio je težakzatajenja bubrega(Selfridge i sur., 2001.). Oba brata i sestre također pokazuju bubrežnu disfunkciju, sa značajkama koje upućuju na proksimalnu tubularnu disfunkciju koja dovodi do progresivnogbubregoštećenje. Međutim, tubularna funkcija se stabilizirala nakon transplantacije jetre, alibubregfunkcijazahtijeva kontinuirano praćenje. Bubrežni fenotip ERCC1- KO miševa—s proširenim tubulima koji sadrže iscurjeli proteinski materijal koji je u skladu s tubulopatijom (McWhir i sur., 1993; Selfridge i sur., 2001; Weeda i sur., 1997)—je sličan u odnosu na pacijente opisane u našoj studiji. Štoviše, oštećenje bubrega i, u nekim slučajevima, zatajenje zabilježeno je u kombinaciji XP/CS (Ben Chehida i sur., 2017.; Kondo i sur., 2016.; Kralund i sur., 2013.), kao i CS (Funaki i sur. ., 2006; Reiss i sur., 1996; Sato i sur., 1988), dok je povezanost između FA i strukturnih anomalijabubreghas also been reported (Sathyanarayana et al., 2018). The phenotype in these siblings is distinct from prior reports of individuals with biallelic ERCC1 mutations and also distinct from the known phenotypic entities, CS and XP. Neither individual had features suggestive of FA. There may be parallels between the phenotype of these siblings and a previously reported individual with biallelic ERCC1 mutations (XP2020DC; p.K266X; IVS6-26G>A) koji je umro u dobi od 37 godina (Gregg et al., 2011.; Imoto, K., et al. 2007. Pacijenti s defektima u interaktivnim nukleotidnim ekscizijskim popravljajućim proteinima ERCC1 ili XPF pokazuju pigmentnu kserodermu s kasnom pojavom teške neurološke degeneracije [Sažetak] J. Invest.Dermatol. 127:S92). Iako nije prijavljeno nikakvo oštećenje jetre, ovaj je pacijent razvio tešku atrofiju mozga u dobi od 15 godina, koja se razvila u progresivnu neurodegeneraciju s demencijom. Blaga atrofija mozga također je primijećena kod oba brata i sestre u dobi od 13 i 11 godina, što ukazuje da treba pažljivo pratiti neurološki razvoj oba brata i sestre.

A previously reported 15-yr-old boy with bi-allelic XPF mutations (XP51RO; p.R153P; c.458G>C; Jaspers i sur., 2007.; Niedernhofer et al., 2006.) predstavljen je s fenotipom s određenim preklapanjem s braćom i sestrama navedenim ovdje, uključujući fotoosjetljivost bez raka kože, nizak rast, nedostatak potkožnog masnog tkiva, kašnjenje u razvoju i bubrežnu insuficijenciju (Niedernhofer et al., 2006.). Za razliku od ovdje navedene braće i sestara, ovaj je dječak pokazao izražene segmentne progeroidne karakteristike, ali mnogo blažu sliku jetre bez kolestaze. Braća i sestre navedeni ovdje pokazuju da bi-alelne ERCC1 mutacije mogu uzrokovati spektar fenotipova, od onog koji se tipično vidi u CS-u do fenotipa koji uključuje blaži nizak rast, fotoosjetljivost i teške jetrene ibubregoštećenje, potencijalno zbog kombiniranog snažnog utjecaja na NER i istovremenog utjecaja na popravak ICL-a, što može posebno utjecati na te organe.

Materijali i metode

Svi postupci provedeni u ovoj studiji u skladu su s etičkim standardima i odobrili su ih Povjerenstvo za ljudsku etiku Kraljevske dječje bolnice, Melbourne, Victoria, Australija (HREC36291C) i Povjerenstvo Nacionalne službe za etiku istraživanja UK-a North East–Newcastle i North Tyneside 2. Pacijenti su uvršteni u programe nedijagnosticiranih bolesti za pedijatrijske pacijente s pretpostavljenim Mendelovim poremećajima "siroče". Uzorci sline ili krvi pacijenata i članova njihovih obitelji prikupljeni su za ekstrakciju genomske DNK nakon davanja pismenog informiranog pristanka. Roditelji su dali dopuštenje za prikazivanje neredigiranih fotografija pogođene braće i sestara na slici 1 A.

Next-generation sequencing (NGS) DNA extracted from the blood of both affected siblings and unaffected parents was subjected to exome capture and sequencing through Oxford Gene Technologies Ltd. Genomic data were analyzed using a custom-made in-house pipeline using an autosomal recessive disease model. A paternally inherited missense variant in NM_202001.2 (ERCC1), g.45922415G>A, c.466C>T je identificiran u obje zahvaćene osobe u egzonu 4 od 8 gena ERCC1. Na početnom ispitivanju podataka egzoma u obje pogođene osobe, činilo se da je ova varijanta u homozigotnom stanju, ali je bila prisutna u heterozigotnom stanju kod oca i odsutna kod majke, što ukazuje na moguću deleciju na alelu majke. Missense varijanta prisutna je u bazi podataka gnomAD s učestalošću od 0.01 posto (22 heterozigota, bez homozigota) i nije prethodno prijavljena kod pogođenih pojedinaca. Missense varijanta pohranjena je u bazi podataka LOVD (http://www.LOVD.nl/ERCC1_000020 i http://www.LOVD.nl/ERCC1_000021) i bazi podataka ClinVar ( ID varijacije: 978472).

Detekcija brisanja qPCR-om

Kako bi se detektirala delecija, genomska DNA ekstrahirana je iz limfocita/epitelnih stanica, a relevantna regija gena ERCC1 umnožena je u qPCR. qPCR je proveden pomoću sondi i specifičnih početnica (navedenih u tablici S1) dizajniranih korištenjem Universal ProbeLibrary Assay Design Center (Roche) i sintetiziranih od strane Sigma-Aldrich. Početnice su dizajnirane tako da uključuju izbrisanu regiju u egzonu 4 i regiju unutar gena koja nije izbrisana kao kontrola (egzon 5). Multipleksni qPCR pomoću reakcijske mješavine LightCycler R 480 Probes Master (Roche) proveden je u skladu s protokolom proizvođača kako bi se pojačala i kvantificirala regija gena ERCC1, koristeći gen CFTR (egzon 27) kao interni standard (tablica S1). qPCR je učinjen na instrumentu LightCycler R 480 (Roche), a analiza podataka urađena je pomoću softvera LightCycler R 480 verzije 1.5.0 (Roche). Slijeđene su smjernice Američkog koledža medicinske genetike za tumačenje varijacije sekvence.

Detekcija missense varijante Sangerovim sekvenciranjem

Genomska DNA izolirana je resuspendiranjem staničnih taloga u puferu lizata cijele stanice (50 mM KCL, 10 mM Tris, pH 8.0,25 mM MgCl2, {{12} }.1 mg/ml želatine, 0.45 posto Tween-20 i 0,45 posto NP-40) koji sadrži 0,1 mg/ml proteinaze K (EO0491; ThermoFisher Scientific) i inkubira se 1 h na 56 stupnjeva nakon čega slijedi 10-min toplinska inaktivacija proteinaze K na 96 stupnjeva. Fragmenti od ~1 kb koji obuhvaćaju missense mutacije su amplificirani PCR-om (prajmeri za sekvenciranje navedeni su u tablici S1), nakon čega je uslijedilo Sangerovo sekvenciranje korištenjem prednjeg ili obrnutog početnica.

Stanične linije

Stanične linije fibroblasta ustanovljene su iz biopsija kože oboljelih pojedinaca i roditelja. Sve stanične linije (navedene u tablici S2) uzgajane su na 37 stupnjeva u atmosferi od 5 posto CO2 indija (Thermo Fisher Scientific) s dodatkom penicilina/streptomicina (Sigma-Aldrich) i 10 posto FBS-a (Bodinco BV). Sve su stanične linije rutinski testirane na infekciju mikoplazmom.

Imortalizacija fibroblasta s hTERT

Fibroblasti WT (48BR) i PV50LD besmrtni su nukleofekcijom p Babe-Neo-TERT (Addgene Plasmid #1774) korištenjem Amaxa Nucleofector (program U23). Svaka elektroporacija sadržavala je 400000 fibroblasta i 2,5 µg plazmidne DNA. Nakon elektroporacije, stanice su nasađene u 25-cm2 boce za kulturu tkiva koje sadrže 5 ml DMEM i 10 posto FBS. Nakon 2 dana, medij kulture zamijenjen je medijem koji sadrži 20 µg/ml neomicina.

/streptomicin (Sigma-Aldrich) i 10 posto FBS (Bodinco BV). Sve su stanične linije rutinski testirane na infekciju mikoplazmom.

Plazmidni konstrukti

All plasmids used in this study are listed in Table S3. The GFP gene in pERCC1-GFP-N1 (Houtsmuller et al., 1999) was replaced with m Venus (a gift of Joachim Goedhart, Amsterdam, Netherlands) using AgeI and BsrGI. The GFP-NLS gene (Luijsterburg et al., 2017) was inserted into pcDNA5-FRT-TO-Puro. The ERCC1-m Venus cassette was amplified by PCR (see Table S1 for primers) and inserted as a NheI and BspEI fragment into plenty-CW57-TO-GFP digested with NheI and AgeI to generate plenty-CW57-TO-ERCC1WT-mVenus. Overlap PCR was used to introduce the c.466C>T mutacije u ERCC1. PCR produkt preklapanja umetnut je kao NheI i AgeI fragment da bi se generirao plenty-CW57-TO-ERCC1R156W-mVenus. ERCC1WT i ERCC1R156W umetnuti su kao NheI i AgeI fragmenti u pcDNA5-FRT-TO Puro-EGFP-N1 za generiranje pcDNA5-FRT-TO-Puro-ERCC1WT-EGFP i pcDNA5-FRT-TO -Puro-ERCC1R156W-EGFP. Mutageneza usmjerena na mjesto korištena je za uvođenje točkastih mutacija u pMacro Bac-XPF-ERCC1WT pomoću kompleta za mutagenezu KOD-plus (Toyobo), kao što je opisano u protokolu proizvođača, uz upotrebu početnica navedenih u tablici S1. Sve sekvence su verificirane Sangerovim sekvenciranjem.

Generacija KO ćelije

linije za generiranje pojedinačnih KO, U2OS(FRT) i RPE1-hTERT (PuroR/TP53-dKO) stanica kotransficirane su s pLV-U6g-PPB koji kodira vodeću RNA iz Medicinskog centra Sveučilišta Leiden/Sigma -Aldrichova knjižnica RNA s jednim vodičem (sgRNA) (pogledajte tablicu S3 za plazmide i tablicu S4 za sekvence sgRNA) koja cilja na ERCC1 gen zajedno s vektorom ekspresije koji kodira Cas9-2A-GFP (pX458; Addgene #48138) koristeći Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Transficirane U2OS(FRT) stanice su odabrane na puromicinu (1 µg/ml) tijekom 3 dana i nasađene na ploču niske gustoće, nakon čega su pojedinačni klonovi izolirani. Transficirane RPE1-hTERT stanice sortirane su FACS na BFP/GFP i nasađene na ploču niske gustoće, nakon čega su pojedinačni klonovi izolirani. KO klonovi su verificirani Western blot analizom. Odsutnost Cas9 integracije/stabilne ekspresije potvrđena je Western blotom.

Stvaranje stabilnih staničnih linija

Jedan ERCC1 KO klon u pozadini U2OS(FRT) (vidi tablicu S2) korišten je za stabilnu ekspresiju ERCC1WT-GFP, ERCC1R156W-GFP ili GFP-NLS kotransfekcijom pcDNA5-FRT-TO-puroplazmida koji kodira ove cDNA (2 µg), zajedno s pOG44 plazmidom koji kodira Flp rekombinazu (0.5 µg). Poliklonalna stanična populacija dobivena je nakon selekcije na 1 µg/ml puromicina i 4 µg/ml blasticidina S. Ekspresija GFP-označenih ERCC1 proteina ili GFP-NLS inducirana je dodatkom 2 µg/ml doksiciklina tijekom 24 sata.

Generacija KI staničnih linija

Kako bi se generirali homozigotni KI, RPE{{0}}hTERT stanice su prvo tretirane 30 minuta s 1 µM DNA-PK inhibitorom (NU7441) kako bi se suzbio DSB popravak sklon pogreškama i povećala upotreba popravka ovisnog o homologiji. Zatim je 350,000 stanica resuspendirano u 20 µl nukleofektorskog pufera (V4XP-3032; Lonza) u prisutnosti 4,5 µg plazmida koji je sadržavao Cas9 i sgRNA ciljano na ERCC1 gen (vidi tablicu S3 za plazmide i tablicu S4 forsgRNA sekvence) i 100 µM jednolančane donorske DNA koja sadrži pacijentovu mutaciju kao i tihe mutacije za uništavanje PAM mjesta kako bi se spriječilo ponovno rezanje pomoću Cas9 i tihe mutacije za uvođenje HindIII restrikcijskog mjesta za olakšavanje pregleda KI klonova. Stanice su elektroporirane pomoću Amaxa 4D-X Nucleofector Unit (Lonza) pomoću programa EA-104. Nakon elektroporacije, stanice su stavljene na ploče niske gustoće u McCoy mediju s 10 posto FBS-a. Sljedeći dan, medij je zamijenjen s DMEM (10 posto FBS i 1 posto penicilin/streptomicin), a stanice su ostavljene da formiraju kolonije. Otprilike 400 kolonija je izolirano i prošireno. Izolirana je genomska DNA, a fragment koji uključuje uvedenu mutaciju i uvedeno restrikcijsko mjesto (HindIII) umnožen je ugniježđenom PCR (pogledajte tablicu S1 za početnice). PCR fragmenti su digestirani s HindIII (NEB) 3 h na 37 stupnjeva i zatim odvojeni gel elektroforezom. Klonovi koji su imali uvedeno HindIII restrikcijsko mjesto analizirani su Sangerovim sekvenciranjem (vidi tablicu S1 za početnice). Dobili smo dva homozigotna KI klona između 400 izoliranih klonova, što odgovara učinkovitosti KI od ~0,5 posto.

Lentivirusna transdukcija

za lentivirusnu transdukciju, mVenus-ERCC1WT ili mVenus ERCC1R156W umetnut je u lentivirusni vektor pLenti-CW57-TO. HEK293T je transfektiran vektorima koji kodiraju ove fuzije ERCC1, VSV-G, RRE i REV korištenjem JetPEI (Sigma Aldrich) za proizvodnju virusa. Supernatant koji je sadržavao virus sakupljen je nakon 24 sata i filtriran filtrom od 0.44-µm. Primarni fibroblasti PV46LD i PV50LD transducirani su lentivirusno u prisutnosti polibrena (Sigma-Aldrich). Stanice su odabrane s 15 ug/ml puromicina. Ekspresija mVenus-označenih ERCC1 proteina inducirana je dodatkom 2 µg/ml doksiciklina tijekom 24 sata.

Klonogeni testovi preživljavanja

Cells were trypsinized, seeded at low density, and allowed to attach. The next day, cells were either mock-treated or exposed to an increasing dose of UV light (1, 2, 3, and 4 J/m2 of UV-C 266nm), an increasing dose of IR (2, 4, 6, and 8 Gy), or increasing concentrations of MMC (2, 4, 6, and 8 ng/ml). After 7–9 d, the cells were washed with 0.9% NaCl and stained with methylene blue. Colonies of >Ocijenjeno je 20 stanica. Pokusi preživljavanja izvedeni su u duplikatu i ponovljeni najmanje dva puta.

Imunoprecipitacija za Co-IP

Stanice su lažno tretirane ili ozračene UV-C (20 J/m2) i sakupljene nakon 1 h. Stanične pelete lizirane su 20 min na ledu u EBC-150 puferu (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 posto NP-40, 2 mM MgCl2 i inhibitor proteaze koktel [Roche]) dopunjen s 500 U/ml benzonaza nukleaze (Novagen). Stanični lizati su inkubirani 1,5 h na 4 stupnja s GFP-Trap A kuglicama (Chromotek). Kuglice su zatim isprane šest puta s EBC-150 puferom (50 mM Tris, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,5 posto NP-40, 1 mM EDTA i koktel inhibitora proteaze) i kuhane u Laemmli-SDS međuspremnik uzorka.

Western blot

Stanice su centrifugirane, isprane s PBS-om i kuhane 10 min u Laemmli puferu (40 mM Tris, pH 6,8, 3,35 posto SDS, 16,5 posto glicerola, 0,0005 posto Bromophenol Blue i 0,05 M ditiotreitol). Proteini su odvojeni na 4 posto – 12 posto Criterion XT Bis-Tris gelova (#3450124; Bio-Rad) u NuPAGE MOPSrunning puferu (NP0001-02; Thermo Fisher Scientific) i naneseni na membrane od poliviniliden fluorida (IPFL00010; EMD Millipore ). Membrana je blokirana puferom za blokiranje (MB-070-003; Rock land) 1 sat na sobnoj temperaturi. Membrana je zatim ispitana antitijelima (navedenim u tablici S5) kako je naznačeno. Za detekciju je korišten Odyssey CLx sustav (LI-COR Biosciences).

Analiza oporavka RNK (RRS)

30,000 stanice nasađene su na 12-mm staklene pokrovne stakalce u 24-pločice s jažicama u DMEM s 1 posto FBS-a. Nakon 24 h stanice su ozračene UV-C dozom od 6 J/m2 i inkubirane u kondicioniranom mediju različita vremenska razdoblja ({{20}} h, 3 h i 18 h). Nakon inkubacije, novonastali transkripti obilježeni su inkubiranjem stanica s 400 µM 5-etinil-uridina (CLK-N002-10; Jena Bioscience), koji je zatim vizualiziran pomoću Click-iT mješavine koja se sastojala od 50 mM Tris pufer, pH 8,0, 60 µM Atto Azida (647N-101; ATTO-TEC), 4 mM CuSO4•5H2O, 10 mM L-askorbinske kiseline (A0278; Sigma-Aldrich) i 0,1 µg/ml DAPI (D1306; Thermo Fisher Scientific) 1 h. Stanice su isprane tri puta po 5 minuta s PBS-om i postavljene na stakalce mikroskopa (Thermo Fisher Scientific) pomoću Aqua Polymount (Brunschwig).

Imunofluorescencija

Za imunofluorescentno bojenje, 250,000 stanica nasađeno je na 18- mm staklena pokrovna stakalca. Sljedeći dan, stanice su fiksirane s 4 posto paraformaldehida, nakon čega je uslijedila permeabilizacija s{{10}}.5 posto Triton X-100 tijekom 10 min. Stanice su tretirane sa 100 ul glicina u PBS-u tijekom 10 minuta kako bi se blokirale neizreagirane aldehidne skupine, isprane s PBS-om i ekvilibrirane u puferu za pranje (PBS koji sadrži 0,5 posto BSA i 0,05 posto Tween-20; Sigma-Aldrich) tijekom 10 minuta. Koraci antitijela i ispiranja su bili u puferu za ispiranje. Primarna antitijela su inkubirana 2 sata na sobnoj temperaturi, zatim sekundarna antitijela 1 sat i DAPI 5 minuta. Primarna i sekundarna antitijela navedena su u tablici S5. Stanice su inkubirane s 0,1 ug/ml DAPI i postavljene pomoću Aqua Polymount.

H2AX bojenje

200,000 stanica nasađeno je na 18-mm staklenim pokrovnim stakalcima u 24-jažičnim pločama s DMEM (10 posto FBS i 1 posto P/S). Sljedeći dan, stanice su bile izložene IR zračenju YXlon International rendgenskim generatorom (200 KV, 4 mA; brzina doze 2 Gy/min). U naznačenim vremenskim točkama, stanice su fiksirane s 3 posto paraformaldehida u PBS-u tijekom 10 minuta i obojene na H2AX tijekom 1 sata (vidi gore). Slike su kvantificirane pomoću prilagođenog makroa u ImageJ koji je omogućio automatsku i objektivnu analizu broja žarišta po stanici, kao što je prethodno opisano (Typas et al., 2015.).

Mikroskopska analiza fiksnih stanica

Slike fiksiranih uzoraka dobivene su na Zeiss AxioImagerM2 ili D2 širokopoljnom fluorescentnom mikroskopu opremljenom s 63× PLAN APO (1,4 numerička apertura [NA]) uljnim imerzijskim objektivima (Zeiss) i HXP 120 metal-halidnom lampom korištenom za pobuđivanje. Fluorescentne sonde detektirane su korištenjem sljedećih filtera za DAPI (filtar pobude: 350/50 nm; dikroično zrcalo: 400 nm; emisijski filtar: 460/50 nm), Alexa 555 (filtar pobude: 545/25 nm; dikroično zrcalo: 565 nm ; emisijski filtar: 605/70 nm), ili Alexa 647 (ekscitacijski filtar: 640/30 nm; dikroično zrcalo: 660 nm; emisijski filtar: 690/50 nm). Slike su snimljene pomoću softvera ZEN 2012 i analizirane u ImageJ.

UV lasersko mikrozračenje

Stanice su uzgajane na 18-mm kvarcnim (UV-C) ili staklenim (UV-A) pokrovnim stakalcima i stavljene u Chamlide CMB magnetsku komoru u kojoj je medij za rast zamijenjen CO2-neovisnim Leibovitz L{ {4}} medij (Thermo Fisher Scientific). Tragovi UV-C lasera napravljeni su korištenjem diodno pumpanog krutog lasera 266-mm itrijevog aluminijskog granata (prosječna snaga 5 mW, brzina ponavljanja do 10 kHz i duljina impulsa 1 ns). Prije UV-Amicro-zračenja, stanice su bile senzibilizirane sa 6 µM trioksalena tijekom 1 sata za stvaranje ICL-ova ili s 15 µM BrdU tijekom 24 sata za stvaranje DSB-ova. Tragovi UV-A lasera napravljeni su krutim 355-nm itrijevo-aluminijskim granatnim laserom s diodom pumpanom (prosječna snaga 14 mW i brzina ponavljanja do 200 Hz). Oba su lasera integrirana u UGA-42-Caliburn/2L Spot Illumination sustav (Rapp OptoElectronic).

Mikrozračenje kombinirano je sa snimanjem živih stanica u komori za okoliš postavljenoj na 37 stupnjeva na kvarcnom fluorescentnom mikroskopu širokog polja Zeiss Axio Observer 7, korištenjem 100× (1,2NA) ultrafilter glicerol-imerzijskog objektiva (UV-C ) ili Plan-Neofluar 63× (1,25 NA) uljni imerzioni objektiv (UV-A). Laserski sustav povezan je s mikroskopom preko TriggerBoxa, a filter neutralne gustoće (ND-1) blokira 90 posto laserskog svjetla. Za pobudu je korištena AnHXP 120-V metal-halogena žarulja. Slike su dobivene u Zeiss ZEN i kvantificirane u ImageJ.

Test loma kromosoma

2 × 1{{20}}6 fibroblasta nasađeno je u 175-cm2 tikvice za kulturu tkiva s DMEM (10 posto FBS) i uzgajano na 37 stupnjeva u prisutnosti ili odsutnosti 50 nM MMC. Nakon 48 h, 600 µl demekolcina (10 µg/µl) dodano je u svaku tikvicu kulture, a stanice su inkubirane dodatnih 30 minuta na 37 stupnjeva kako bi se obogatile za metafaze. Stanice su zatim tripsinizirane i resuspendirane u 75 mM KCL i inkubirane 20 minuta na sobnoj temperaturi. Stanice su centrifugirane, resuspendirane u 10 ml fiksativa (75 posto metanola i 25 posto octene kiseline), inkubirane 30 minuta na sobnoj temperaturi i centrifugirane. Peleti su resuspendirani u 10 ml fiksativa i inkubirani 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ovaj korak je ponovljen i na kraju je talog resuspendiran u 0,5–1,0 ml fiksativa. Stanična suspenzija je ispuštena na stakalce i ostavljena da se osuši. Stakalca su bojana 5 minuta u 3-postotnoj Giemsinoj otopini, isprana vodom iz slavine i ostavljena da se osuše. Slajdovi su kodirani, a iz svake kodirane kulture, 50 metafaza je ispitano na kromosomska oštećenja. Nakon bodovanja slajdovi su dekodirani, a rezultati analizirani kako su prikazani (Stoepker i sur., 2011.).

UDS

180,000 stanica nasađeno je na 18-mm staklenim pokrovnim stakalcima u 12-pločama s jažicama u DMEM s 1 posto FBS-a. Nakon 24 sata, stanice su lokalno ozračene kroz 5-µm filter s 30 J/m2 UV-C. Stanice su zatim pulsno obilježene s 20 µM EdU (VWR) i 1 µM5-fluoro-deoksiuridina (Sigma-Aldrich) 1 h ili 4 h. Nakon obilježavanja, stanice su 30 minuta tretirane s 10 µM timidina u DMEM bez dodataka i fiksirane 15 minuta s 3,7 posto formaldehida u PBS-u. Stanice su permeabilizirane 20 minuta u PBS s 0,5 posto Triton-X100 i blokirane u 3 posto BSA (Thermo Fisher Scientific) u PBS. Ugrađeni EdU spojen je s Attoazide Alexa Fluor 647 pomoću Click-iT kemije prema uputama proizvođača (Invitrogen). Nakon spajanja, stanice su naknadno fiksirane s 2 posto formaldehida tijekom 10 minuta i zatim blokirane sa 100 mM glicina. DNA je denaturirana s 0,5 M NaOH tijekom 5 minuta, nakon čega je uslijedilo blokiranje s 10 posto BSA tijekom 15 minuta. Zatim su stanice inkubirane s protutijelima protiv dimera ciklobutan pirimidina (vidi tablicu S5) tijekom 2 sata, nakon čega su uslijedila sekundarna protutijela tijekom 1 sata i DAPI tijekom 5 minuta. Ćelije su montirane u Polymountu (Brunschwig).

MS prikupljanje podataka

MS je izvedena uglavnom kao što je prethodno opisano (Salas Lloret et al., 2019). Svi eksperimenti izvedeni su na sustavu EASY-nLC 1000 (Proxeon) spojenom na Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) preko ionskog izvora nano-elektrospreja. Q-Exactive je spojen s 25-cm emiterom od silicijevog dioksida (FS360-75-15-N-5-C25; NewObjective) interno pakiranim s 1,9 µm C18-AQ kuglicama (Reprospher -DE; Pur; Dr. Manish, Ammerbuch-Entringen, Njemačka). Uzorci su pušteni u 40-min kromatografskom gradijentu od 0 posto do 30 posto acetonitrila, a zatim su povećani na 95 posto acetonitrila prije ponovnog ekvilibriranja kolone s brzinom protoka od 200 NL/min. Maseni spektrometar je radio u načinu prikupljanja ovisnom o podacima s metodom top-7 i rasponom skeniranja od 300–1600 m/z. MS spektri punog skeniranja dobiveni su pri ciljnoj vrijednosti od 3 × 106 i razlučivosti od 70,000, a tandemski maseni spektri veće kolizijske disocijacije (MS/MS) zabilježeni su pri ciljnoj vrijednosti od 105, i s rezolucijom od 35 000, izolacijskim prozorom od 2,2 m/z i normaliziranom energijom sudara od 25 posto. Minimalni cilj automatske kontrole pojačanja bio je 104. Maksimalna vremena ubrizgavanja MS1 i MS2 bila su 250 odnosno 120 ms. Mase prekursora skeniranih iona dinamički su isključene iz MS/MS analize na 30 s. Ioni s nabojem 1 i većim od 6 isključeni su iz pokretanja MS2 analize.

MS analiza podataka Svi neobrađeni podaci analizirani su korištenjem MaxQuant (verzija 1.6.6.0) kako je prethodno opisano (Tyanova et al., 2016a). Proveli smo pretragu prema in silico-digestiranom UniProt referentnom proteomu za Homo sapiensa, uključujući kanonske i izoformne sekvence (27. svibnja, 2019.). Pretraživanje baze podataka provedeno je prema standardnim postavkama uz sljedeće izmjene. Upotrijebljena je probava s Tripsinom/P, dopuštajući četiri propuštena cijepanja. Oksidacija (M) i acetil (proteinski N-term) dopušteni su kao varijabilne modifikacije s maksimalnim brojem od tri. Karbamido-metil (C) je onemogućen kao fiksna modifikacija. Kvantifikacija bez oznake (LFQ) bila je omogućena, ne dopuštajući brzi LFQ. Max-Quant izlazni podaci dodatno su obrađeni pomoću računalne platforme Perseus (v 1.6.6.0; Tyanova et al., 2016b). Vrijednosti LFQ intenziteta su log2 transformirane, a potencijalni kontaminanti i proteini identificirani samo prema mjestu ili reverznim peptidima su uklonjeni. Uzorci su grupirani u eksperimentalne kategorije, a uklonjeni su i proteini koji nisu identificirani u četiri od četiri ponavljanja u barem jednoj skupini. Vrijednosti koje nedostaju pripisane su korištenjem normalno raspodijeljenih vrijednosti s pomakom prema dolje od 1,8 (log2) i randomiziranom širinom od 0,3 (log2) uzimajući u obzir vrijednosti cijele matrice. Provedena je statistička analiza (t-testovi) kako bi se odredilo koji su proteini značajno obogaćeni. Generirani su grafikoni vulkana, a tablice rezultata statističke analize dalje su obrađene u Microsoft Excelu. Podaci o MS proteomici pohranjeni su u ProteomeXchange Consortium putem PRIDE (Perez-Riverol et al., 2019.) partnerskog repozitorija s identifikatorom skupa podataka PXD017940.

Pročišćavanje rekombinantnog ERCC1-XPF

Proizvodnja bakulovirusa izvedena je kako je opisano upotrebom pMacroBac-His-ERCC1/XPF-HA konstrukata (Enzlin i Sch¨arer, 2002). ERCC1WT i ERCC1R156W bili su koeksprimirani s XPFWT iz jednog bakulovirusa u Sf9 stanicama insekata. Heterodimeri su pročišćeni afinitetom prema niklu, isključenjem veličine i heparinskom kromatografijom kako je opisano (Enzlin i Sch¨arer, 2002.). ERCC1-XPF je eluiran iz heparinske kolone na oko 600 mM NaCl. Koncentracije proteina kretale su se od 0,1 do 0,2 mg/ml.

Nukleazni test

Supstrat matične petlje (GCCAGCGCTCGG(T)22CCGAGCGCTGGC) koji sadrži fluorescentnu boju Cy5 (50 pmol) na 39 terminusa (IDT) žaren je u 100-µl puferu za žarenje (10 mM Tris, pH 7,5 i 50 mM NaCl) zagrijavanjem na 95 stupnjeva tijekom 5 minuta i polaganim hlađenjem tijekom razdoblja od 2 sata. 200 fmol žarenog supstrata korišteno je u 20-µl reakcijama koje su sadržavale 25 mM HEPES, pH 8,0, 2 mM MgCl2, 10 posto glicerola, 0,5 mM -merkaptoetanola, 0,1 mg/ml BSA, 40 mM NaCl i 0-40 nM proteina. Reakcije su inkubirane na 30 stupnjeva 30 minuta i zaustavljene dodavanjem 10 ul 90 postotnog formamida/10 mM EDTA. Nakon zagrijavanja na 95 stupnjeva tijekom 5 minuta i hlađenja na ledu, 15 µl svakog uzorka naneseno je na 15-postotni denaturirajući poliakrilamidni gel. Gelovi su pušteni na 30 mA tijekom 30 minuta, a trake su vizualizirane fluorescencijom pomoću Typhoon RGB (Amersham Biosciences).

In vitro NER test

Ekstrakti stanica s nedostatkom XPF (XP2YO) i dG-AAF lezija koja sadrži plazmid specifična za mjesto stvoreni su kako je prethodno opisano (Gillet et al., 2005; Shivji et al., 1999.) . Za svaku reakciju, 2 µl pufera za popravak (2{{40}}0 mM Hepes-KOH, 25 mM MgCl2, 2,5 mM DTT, 10 mM ATP, 110 mM fosfokreatina i 1,8 mg / ml BSA, konačni pH 7,8), 0,2 µl pufera kreatin fosfokinaze (2,5 mg/ml kreatin fosfokinaze iz zečjeg mišića [Sigma Aldrich], 10 mM glicina, pH 9,0 i 50 posto glicerola), 3 µl stanica s nedostatkom XPF-a ekstrakt, NaCl (do konačne koncentracije od 70 mM) i pročišćeni ERCC1-XPF proteini u ukupnom volumenu od 9 µl prethodno su zagrijavani na 30 stupnjeva 10 minuta. 1 µl plazmida koji je sadržavao dG-AAF (50 ng/µl) dodan je svakoj reakciji, a reakcije su inkubirane na 30 stupnjeva 45 minuta. Reakcijska smjesa je zatim ohlađena na ledu 5 minuta, praćeno dodatkom 0,5 µl 1 µM komplementarne niti d(GGGGCATGTGGCGCCGGTAATAGC TACGTAGCTC), i reakcijska smjesa je denaturirana zagrijavanjem na 95 stupnjeva 5 minuta. Nakon 15 minuta žarenja na sobnoj temperaturi, dodano je 1 µl mješavine sekvence (koja sadrži 0,13 U sekvence i 2,0 µCi [ -32P] dCTP za svaku reakciju). Nakon prethodne inkubacije na 37 stupnjeva tijekom 3 minute, dodano je 1,2 ul smjese deoksiribonukleotid trifosfata (50 uM dCTP, 100 uM dTTP, 100 uM dATP i 100 uM dGTP). Reakcijska smjesa je inkubirana na 37 stupnjeva 12 minuta, a reakcija je zaustavljena dodavanjem 8 µl boje za punjenje (80 posto formamida i 10 mM EDTA). Uzorci su zagrijavani na 95 stupnjeva 5 minuta, ohlađeni na ledu i stavljeni na 14 postotni denaturirajući poliakrilamidni gel. Gelovi su radili na 45 W tijekom 2,5 h, a trake su vizualizirane korištenjem PhosphorImager (Typhoon RGB).

Online dodatni materijal

Slika S1 prikazuje laboratorijske vrijednosti funkcija jetre i bubrega kod brata 1 i brata 2. Slika S2 prikazuje podatke genomskog sekvenciranja koji potvrđuju missense mutaciju i unutargenu deleciju u ERCC1 genu. Slika S3 prikazuje ekspresiju proteina ERCC1 i XPF u fibroblastima pacijenata. Slika S4 prikazuje pročišćene rekombinantne ERCC1 i XPF proteine ​​i Co-IP ERCC1WT i ERCC1R156W. Slika S5 prikazuje mikroskopske slike UDS-a, žarišta H2AX i mjesto pacijentovih mutacija u ERCC1-XPF. Tablica S1 sadrži sekvence svih početnica i sondi korištenih u ovoj studiji. Tablica S2 navodi sve stanične linije testirane u ovoj studiji. Tablica S3 navodi sve plazmide uključene u ovu studiju. Tablica S4 prikazuje sgRNA sekvence studije, a tablica S5 prikazuje antitijela. Tablica S6 prikazuje broj ćelija korištenih za kvantifikaciju na slikama. Data S1 prikazuje sve neobrezane Western blot datoteke.

Priznanja

Autori zahvaljuju braći i sestrama i njihovim roditeljima na doprinosu ovom radu, Sylvie Noordermeer (Medicinski centar Sveučilišta Leiden [LUMC], Leiden, Nizozemska) za vektor ekspresije lentivirala pLenti-CW57-TO-GFP i savjete o stvaranju KI stanice, Joachim Goedhart (Sveučilište u Amsterdamu, Amsterdam, Nizozemska) za mVenus cDNA, Bert van derKooij (LUMC, Leiden, Nizozemska) za inhibitor DNA-PK, Wim Vermeulen i Anja Rams (Erasmus MC, Rotterdam, Nizozemska) za pružanje 165TOR stanica, Tomoo Ogi (Sveučilište Nagoya, Japan) za pružanje CS20LO stanica, Alan Lehman (Sveučilište Sussex, UK) za pružanje CSL16NG i CSL16NG hTERT stanica i Joost Schimmel (LUMC, Leiden, Nizozemska) za savjete o stvaranju KI stanica .

Ovaj je rad financiran od strane istraživačke stipendije Medicinskog centra Sveučilišta Leiden i potpore Nederlandse Organisatie voor We tenschappelijk Onderzoek VIDI (ALW.016.161.320) za MSLuijsterburg, početne potpore Europskog istraživačkog vijeća (310913) za ACO Vertegaal, potpore KWF-a Kankerbestrijding YoungInvestigator ( 11367) za R. Gonz´alez-Prieto, potporu KWF Kan kerbestrijding (VU 2013-5983) za MA Rooimans i potpore Korejskog instituta za osnovnu znanost (IBS-R022-A1) i Nacionalne Institut za rak (P01CA092584) ODSch arer.

Doprinosi autora: K. Apelt je stvorio KO stanice, KI stanice i stabilne stanične linije; izvršio Western blot i imunološko bojenje za ERCC1 i XPF ekspresiju, lentivirusne transdukcije, klonogena preživljavanja (UV, MMC, IR), Co-IP eksperimente za Western blot analizu, UDS eksperimente, Co-IP eksperimente za MS i H2AX bojenja; i napisao rad. A. Kragten izvršio je UDS, RRS i imunološko bojenje nakon lokalnog UV-a. AP Wonder gem generirao je KO i KI stanice i proveo UDS eksperimente, Western blot i Sanger sekvenciranje kako bi potvrdio missense mutaciju. SM White je davao savjete za pacijente, analizirao podatke o egzomima, izvodio biopsije, generirao primarne fibroblaste i napisao klinički opis pacijenta. S. Lunke i BT Wilson generirali su NGS podatke. S. Pantaleo i D. Flanagan izveli su qPCR kako bi potvrdili brisanje. C.Quinlan je napisao klinički opis bubrega. W. Hardikar je napisao klinički opis jetre. MA Rooimans i R.MF Wolthuis generirali su hTERT-ovesmrtne 48BR i PV50LD fibroblaste i proveli testove lomljenja kromosoma izazvanih MMC-om. R. Gonzalez-Prieto i ACO Vertegaal analizirali su sve MS pokuse. WW Wiegant i H. vanadium izveli su klonogena preživljavanja u U2OS stanicama (IR). J.-E.Yeo i HS Kim pročistili su rekombinantne proteine ​​i proveli nukleazni test i in vitro NER testove. OD Sch¨arers pod nadzorom in vitro NER rada pridonio je strukturnoj interpretaciji alela R156W i uredio rad. MS Luij sterburg nadzirao je projekt i napisao rad.

Reference

Abdel Ghaffar, TY, ES Elsobky i SM Elsayed. 2011. Kolestaza u bolesnika s Cockayneovim sindromom i predloženi modificirani kriteriji za kliničku dijagnozu. OrphanetJ. Rijetko Dis. 6:13. -1172-6-13

Abdullah, UB, JF McGouran, S. Brolin, D. Ptchelkine, AH El-Sagheer, T. Brown i PJ McHugh. 2017. RPA aktivira endonukleazu XPF-ERCC1 za pokretanje obrade međulančnih veza DNA. EMBO J. 36: 2047–2060.

Adair, GM, RL Rolig, D. Moore-Faver, M. Zabelshansky, JH Wilson i RS Nairn. 2000. Uloga ERCC1 u uklanjanju dugih nehomolognih repova tijekom ciljane homologne rekombinacije. EMBO J. 19:5552–5561.

Ahmad, A., AR Robinson, A. Duensing, E. van Drunen, HB Beverloo, DB Weisberg, P. Hasty, JH Hoeijmakers i LJ Niedernhofer. 2008. ERCC1-XPF endonukleaza olakšava popravak prekida dvostrukog lanca DNA. Mol. Ćelija. Biol. 28: 5082-5092.

Ahmad, A., JH Enzlin, NR Bhagwat, N. Wijgers, A. Raams, E. Appledoorn, AF Theil, JH J Hoeijmakers, W. Vermeulen, NG J Jaspers, et al. 2010. Pogrešna lokalizacija nukleaze XPF-ERCC1 pridonosi smanjenom popravku DNA u bolesnika s XP-F. PLoS Genet. 6:e1000871.

Auerbach, AD 2009. Fanconijeva anemija i njezina dijagnoza. Mutat. Res. 668:4–10.

Ben Chehida, A., N. Ghali, R. Ben Abdelaziz, F. Ben Moussa i N. Tebib. 2017. Zahvaćenost bubrega kod 2 braće i sestara s Cockayneovim sindromom. Iran. J. Kidney Dis. 11: 253-255.

Biggerstaff, M., DE Szymkowski i RD Wood. 1993. Ko-korekcija defekata popravka DNA ERCC1, ERCC4 i xeroderma pigmentosum skupine F in vitro. EMBO J. 12:3685-3692.

-2075.1993.tb06043.xBogliolo, M., B. Schuster, C. Stoepker, B. Derkunt, Y. Su, A. Raams, JP Trujillo, J. Minguillón, MJ Ramı´rez, R. Pujol , et al. 2013. Mutacije u ERCC4, koji kodira endonukleazu XPF za popravak DNA, uzrokuju Fanconijevu anemiju. Am. J. Hum. Genet. 92: 800-806.

Ceccaldi, R., P. Sarangi i AD D'Andrea. 2016. Put Fanconijeve anemije: novi igrači i nove funkcije. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 17: 337–349.

de Laat, WL, E. Appeldoorn, NG Jaspers i JH Hoeijmakers. 1998a. Strukturni elementi DNA potrebni za aktivnost endonukleaze ERCC1-XPF. J. Biol. Chem. 273:7835-7842.

de Laat, WL, AM Sijbers, H. Odijk, NG Jaspers i JH Hoeijmakers. 1998b. Mapiranje interakcijskih domena između ljudskih proteina za popravak ERCC1 i XPF. Nucleic Acids Res. 26: 4146-4152.

nar/26.18.4146

de Vries, A., CT van Oostrom, FM Hofhuis, PM Dortant, RJ Berg, FR de Gruijl, PW Wester, CF van Kreijl, PJ Capel, H. van Steeg i SJ Verbeek. 1995. Povećana osjetljivost na ultraljubičasto-B i kancerogene tvari kod miševa kojima nedostaje gen XPA za popravak ekscizije DNA. Priroda. 377: 169-173.

DiGiovanna, JJ i KH Kraemer. 2012. Shining a light on xeroderma pigmentosum. J. Invest. Dermatol. 132: 785-796.

Enzlin, JH i OD Schrer. 2002. Aktivno mjesto endonukleaze za popravak DNA XPF-ERCC1 tvori visoko konzervirani motiv nukleaze. EMBO J. 21:2045–2053.

Funaki, S., S. Takahashi, H. Murakami, K. Harada i H. Kitamura. 2006. Cockayneov sindrom s rekurentnim akutnim tubulointersticijskim nefritisom. Pathol. Int. 56: 678-682.

.02029.x

Gillet, LC, J. Alzeer i OD Schrer. 2005. Ugradnja N-(deoksiguanozin-8-il)-2-acetilaminofluorena (dG-AAF) u oligonukleotide specifična za mjesto korištenjem modificirane 'ultra-blage' sinteze DNA. Nucleic Acids Res. 33: 1961-1969.

Gregg, SQ, AR Robinson i LJ Niedernhofer. 2011. Fiziološke posljedice defekata u ERCC1-XPF endonukleazi za popravak DNA. Popravak DNK (Amst.). 10:781-791.

Guo, C., Y. Nakazawa, L. Woodbine, A. Bjorkman, M. Shimada, H. Fawcett, N. Jia, K. Ohyama, TS Li, ​​Y. Nagayama, et al. 2015. Nedostatak XRCC4 kod ljudi uzrokuje izražen neurološki fenotip, ali ne i očitu imunodeficijenciju. J. Allergy Clin. Immunol. 136:1007-1017.

Helfricht, A., PE Thijssen, MB Rother, RG Shah, L. Du, S. Takada, M. Rogier, J. Moritz, H. IJspeert, C. Stoepker, et al. 2020. Gubitak ZBTB24 narušava nehomologno spajanje krajeva i rekombinaciju promjene klase u bolesnika s ICF sindromom. J. Exp. Med. 217:e20191688.

Houtsmuller, AB, S. Rademakers, AL Nigg, D. Hoogstraten, JH Hoeij-makers i W. Vermeulen. 1999. Djelovanje endonukleaze za popravak DNA ERCC1/XPF u živim stanicama. Znanost. 284:958-961. h

znanosti.284.5416.958

Jaspers, NG, A. Raams, MC Silengo, N. Wijgers, LJ Niedernhofer, AR Robinson, G. Giglia-Mari, D. Hoogstraten, WJ Kleijer, JH Hoeij-makers i W. Vermeulen. 2007. Prvi prijavljeni pacijent s nedostatkom humanog ERCC1 ima Cerebro-oculofacio-skeletni sindrom s blagim defektom u popravku ekscizije nukleotida i ozbiljnim zatajenjem u razvoju. Am. J. Hum. Genet. 80: 457-466.

Joenje, H., AB Oostra, M. Wijker, FM di Summa, CG van Berkel, MA Rooimans, W. Ebell, M. van Weel, JC Pronk, M. Buchwald i F. Arwert. 1997. Dokazi za najmanje osam Fanconijevih gena anemije. Am. J. Hum. Genet. 61:940-944.

Jones, M., F. Beuron, A. Borg, A. Nans, CP Earl, DC Briggs, AP Snijders, M. Bowles, EP Morris, M. Linch i NQ McDonald. 2020. Cryo-EM strukture endonukleaze XPF-ERCC1 otkrivaju kako uključenje spoja DNA remeti auto-inhibiranu konformaciju. Nat. Komun. 11: 1120.

Karikkineth, AC, M. Scheibye-Knudsen, E. Fivenson, DL Croteau i VA Bohr. 2017. Cockayneov sindrom: kliničke značajke, modelni sustavi i putovi. Starenje Res. Otkr. 33:3–17.002

Kashiyama, K., Y. Nakazawa, DT Pilz, C. Guo, M. Shimada, K. Sasaki, H. Fawcett, JF Wing, SO Lewin, L. Carr, et al. 2013. Neispravnost nukleaze ERCC1-XPF rezultira različitim kliničkim manifestacijama i uzrokuje Cockayneov sindrom, pigmentnu kserodermu i Fanconijevu anemiju. Am. J. Hum. Genet. 92: 807-819.