Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite ovdje za 2. dio

Cistanche ima vrlo dobar neuroprotektivni učinak

Gabriel Gonzalez 1,2 , Jiˇrí Grz 1, Cosimo Walter D'Acunto 1, Petr Kaˇnovsk2 i Miroslav Strnad1,2,*

1. Laboratorij za regulatore rasta, Institut za eksperimentalnu botaniku Češke akademije znanosti,

i Prirodoslovno-matematički fakultet, Sveučilište Palacký, Šlechtitel ˚u 27, CZ-78371 Olomouc, Češka Republika;

Gonzalez.gabriel@seznam.cz (GG); jiri.gruz@upol.cz (JG); waldacun@gmail.com (CWD)

2. Odjel za neurologiju, Sveučilišna bolnica Olomouc i Medicinski i Stomatološki fakultet,

Sveučilište Palacký Olomouc, CZ-775 20 Olomouc, Češka; Petr.Kanovsky@fnol.cz

* Dopisivanje: miroslav.strnad@upol.cz; Tel.: plus 420-585-634-850

Sažetak: Citokininisu fitohormoni na bazi adenina koji reguliraju ključne procese u biljkama, kao što su dioba i diferencijacija stanica, rast korijena i mladica, apikalna dominacija, grananje i klijanje sjemena. U preliminarnim studijama, oni su također pokazali zaštitne aktivnosti protiv ljudskih neurodegenerativnih bolesti. Kako bismo proširili znanje o zaštiti (zaštitnoj djelatnosti) koju nude, istražili smo aktivnosti prirodnihcitokininiprotiv toksičnosti izazvane salsolinolom (SAL) (aParkinsonova bolestmodel) i smrt izazvana glutamatom (Glu).neuron-poput dopaminergičkih SH-SY5Y stanica. Otkrili smo da su kinetin-3-glukozid, cis-zeatin ribozid i N6-izopentenil adenozin bili aktivni u SAL-induciranom PD modelu. Osim toga, trans-, cis-zeatin i kinetin zajedno s kelatorom željeza deferoksaminom (DFO) i inhibitorom nekroptoze nekrostatinom 1 (NEC-1) značajno su smanjili stope stanične smrti u Glu-induciranom modelu. Testovi laktat dehidrogenaze otkrili su dacitokininipod uvjetom niženeuroprotektivniaktivnost nego DFO i NEC-1. Štoviše, smanjili su aktivnosti apoptotičke kaspaze-3/7 manje od DFO-a. Međutimcitokininiimao vrlo sličan učinak kao DFO i NEC-1 na proizvodnju superoksidnog radikala. Sve u svemu, pokazali su zaštitnu aktivnost u SAL-induciranom modeluparkinsonovacneuronskistanična smrt i Glu-inducirani model oksidativnog oštećenja uglavnom smanjenjem oksidativnog stresa.

Ključne riječi: citokinin; fitohormon; neuroprotekcija; stanice slične neuronima SH-SY5Y; citotoksičnost; salsolinol; glutamat; oksidativni stres; Parkinsonova bolest

biljka cistančao učincima naNeuroprotekcija

1. Uvod

Parkinsonova bolest(PD) druga je najčešća neurodegenerativna bolest povezana s motorikom, a očekuje se da će broj globalno dijagnosticiranih slučajeva porasti sa 6 milijuna u 2015. na više od 12 milijuna do 2040. [1]. Karakteriziraju ga motorički simptomi povezani sa specifičnom degeneracijom i gubitkom približno 30-70 posto dopaminergičkog (DA)neuroniu substantia nigra pars compacta i njihove projekcije na striatum [2,3]. Neka od mnogih poznatih molekularnih obilježja PD-a uključuju pojačani oksidativni i nitrozativni stres, disfunkciju mitohondrija [4-7], ekscitotoksičnost [8], disfunkciju ubikvitin/proteasomskog sustava [9] i neuroupalu [10]. Trenutačni tretmani imaju različite nuspojave i nude samo simptomatsko olakšanje [11], tako da postoje intenzivni napori da se razviju lijekovi s učinkovitim ljekovitim učincima na degenerirajuću DA.neuroni. Resursi koji mogu pomoći takvim naporima uključuju prirodne spojeve koji obično imaju manje nuspojava. Između ostalog, tvari iz Ginkgo bilobe (ginkgetin, ginkolid, bilobalid), ginsenga (ginsenozidi) i flavonoida (baicalein, kaempferol, rutin i luteolin) pokazale su široko zaštitno djelovanje u nekoliko in vitro modela (uključujući staničnu liniju humanog neuroblastoma SH -SY5Y) i in vivo modele PD-a induciranog 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridinijevim dikloridom (parakvat), 1-metil- 4-fenil-1, 2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), 1-metil-4-fenilpiridinij (MPP plus) i 6-hidroksidopamin (6-OHDA) [12].

Ovdje predstavljena studija usredotočila se na učinke klase prirodnih fitohormona tzvcitokinini(CK) i njihovi metaboliti, koji su dobro poznati regulatori stanične diobe, rasta, diferencijacije i starenja lišća u biljaka [13]. Strukturno, CK su derivati ​​adenina supstituirani na N6-položaju s prenilnim (izopentenilnim) ili aromatskim bočnim lancem. Prirodni oblici uključuju 6-(E)-4-hidroksi-3-metil but-2-enilaminopurin (trans-zeatin, tZ), njegov 6-(Z)-izomer ( cis-zeatin, cZ), N6-izopentenil adenin (iP), 6-benzil amino purin (BAP), 6-furfurilaminopurin (kinetin, K) i orto-, meta-, i para-hidroksilirani ili metoksilirani derivati ​​BAP-a, zvani topolini (oT, mT, pT, MeoT, MemT, MepT). Različiti 9-ribozidi, 9-nukleotidi, kao i 7-, 9 i O-glukozidi ovih oblika također se često pojavljuju, kao što je prikazano u tablici 1. Uz njihovu prirodnu ulogu u biljaka, CK su pokazali snažnu antioksidacijsku aktivnost prema reaktivnim kisikovim vrstama (ROS) koja pruža zaštitu u nekoliko in vitro modela stresa poremećaja povezanih sa starenjem [14].

Tablica 1. Strukture odcitokininii sredstva pozitivne kontrole.

Konkretno, CK navodno imaju citoprotektivno djelovanje u modelima kao što je H2O2- inducirana stanična smrt ljudskih fibroblasta [15] i glikoksidativni stres izazvan D-galaktozom u astrocitima štakora [16]. Što je još važnije, u ovom kontekstu su pokazalineuroprotektivniučinci u modelima koji se odnose na neurodegenerativne bolesti kao što je obiteljska PD, toksičnost izazvana inhibitorom proteasoma MG 132-ili H2O2-u stanicama SH-SY5Y [17], Glu-inducirano oksidativno oštećenje hipokampusa miša HT22neuronskistanicama [18] i staničnim modelom PC12 Huntingtonove bolesti [19]. Druge studije pokazuju da zaštitne aktivnosti CK uključuju izravnu [20,21] i neizravnu [15,16,22] modulaciju staničnih redoks sustava. Osim karakterističnih antioksidativnih aktivnosti CK, navodno imaju regulatorne učinke u mitohondrijima koji pojačavajuneuronskiodrživost [17]. Štoviše, K može stabilizirati potencijal mitohondrijske membrane i povećati proizvodnju ATP-a, čime se ublažava Glu-inducirana smrt HT22 stanica [18]. Međutim, unatoč nalazima koji se odnose na njihove učinke u nekoliko modela, postoji ograničeno znanje o zaštitnoj aktivnosti CK u najčešćem (sporadičnom) obliku PD-a.

Kako bismo riješili gore opisani jaz u znanju, sustavno smo procijenili učinke prirodnih CK i njihovih metabolita u dva in vitro modela: model PD-a izazvan salsolinolom (SAL) i model oksidativnog oštećenja izazvan glutamatom (Glu) uneuron-poput stanica SH-SY5Y. Ova je linija korištena zbog svog dopaminergičkog fenotipa, osjetljivosti na dopaminergičke toksine kao što je SAL i pogodnog formiranja relativno stabilnih populacija diferenciranihneuronskistanice sa smanjenim stopama proliferacije nakon 48 h izloženosti 10 uM all-trans retinoične kiseline (ATRA) [23-25].

Neuron-stanice slične bile su izložene endo/egzotoksinu SAL kako bi se oponašala patologija PD-a putem disfunkcije staničnog redoks sustava: iscrpljivanje glutationa (GSH) i inhibicija aktivnosti antioksidativnih enzima (Cu/Zn superoksid dismutaza i katalaza) i mitohondrijskih kompleksa (I i II), što dovodi do apoptoze i nekroze [26]. U drugom modelu, Glu izaziva potencijalno smrtonosno oksidativno oštećenje prekidom redoks sustava. Oba modela u staničnoj liniji SH-SY5Y prethodno su korištena u studijama neuroprotekcije [26,27].

Citoprotektivne i/ili antioksidativne aktivnosti povezane s degenerativnim poremećajima K, iP, BAP, iPR, tZR i njihovih slobodnih baza su testirane, i (kao što je gore navedeno) utvrđeno je da neki CK imaju zaštitne aktivnosti uneuronskiStanice. Međutim, nijedna prethodno objavljena studija nije ispitivala strukturuneuroprotektivniodnos aktivnosti (SAR) prirodnih CK (Tablica 1). Stoga je ova studija poduzeta da se ispitaneuroprotektivni(anti-parkinsonovac) aktivnosti gotovo svih poznatih prirodnih CK u odabranim modelima neurodegeneracije izazvanim SAL-om i Glu-om. Prvo smo procijenili kapacitet apsorpcije kisikovih radikala (ORAC) i (u sigurnosnim testovima) citotoksičnost svakog CK-a premaneuron-poput stanica SH-SY5Y. Zatim smo procijenili neuroprotektivne učinke spojeva i utjecaj na razine oksidativnog stresa mjerenjem proizvodnje superoksida (O2.) (dihidroetidij, DHE test) i aktivnosti apoptotičke kaspaze-3,7. Rezultati daju prve prijavljene sustavne indikacije odnosa između prirodnih struktura CK ineuroprotektivniaktivnosti.

Cistanche herbaima vrlo dobarneuroprotektivniposljedica

2. Rezultati i rasprava

2.1. Kapacitet apsorpcije kisikovih radikala citokinina (ORAC)

Kako su neurodegenerativne bolesti povezane s povišenim oksidativnim stresom, antioksidacijska aktivnost igra ključnu ulogu u obranineuronskiStanice. Za procjenu biološkog potencijala CK u tom pogledu, antioksidativni kapacitet određen je ORAC-om, koji se obično koristi za određivanje antioksidativnog kapaciteta tvari [28]. Kapacitet antioksidansa izražen je kao Trolox ekvivalenti (TE), koji određuju učinkovitost (niže prema višoj) spojeva od Troloxa na ekvimolarnoj osnovi. Rezultati, prikazani u Tablici 1, pokazuju da topolini (oT, mT i pT) i njihovi ribozidi (oTR, mTR, pTR) imaju visoke antioksidativne aktivnosti, koje su vjerojatno usko povezane sa sustavom bogatim elektronima njihovog C{{ 3}}hidroksi benzil amino supstituent. Unatoč visokim ORAC vrijednostima, topolini nisu imali visokeneuroprotektivniaktivnost. Međutim, nekoliko heteroaromatskih CK uključujući K (N6-furfurilaminopurin) i nearomatski cis-zeatin-O-glukozid (cZOG), koji ima 4-hidroksi-3-metilbut{{7} }en-1-il)amino supstituent, također je pokazao visok antioksidativni kapacitet (Tablica 2). Ostali metaboliti CK—uključujući kinetin-3-glukozid (K3G), kinetin ribozid 5<-monophosphate (kmp),="" kinetin-9-glucoside="" (k9g),="" and="" trans-zeatin=""><- monophosphate="" (tzmp)—had="" moderate="" antioxidant="" activity.="" all="" the="" others="" had="" detectable="" capacity="" except="" bap.="" these="" results="" confirm="" previous="" findings="" that="" ip,="" pt,="" k="" can="" act="" as="" direct="" radical="" scavengers,="" but="" conflict="" with="" the="" previously="" reported="" activity="" of="" bap="" in="" the="" orac="" test="" [20,21].="" to="" conclude,="" these="" compounds="" have="" potential="" in="" the="" treatment="" of="" neurodegenerative="" diseases="" associated="" with="" increased="" oxidative="" stress="">

dobrobiti stabljike cistanchenaprotiv Alzheimerove bolesti

2.2. Diferencijacija stanica SH-SY5Y

Proučiti CK-oveneuroprotektivniučinaka, stanice neuroblastoma SH-SY5Y (izabrane iz već opisanih razloga [23]) su diferencirane izlaganjem 10 uM ATRA tijekom 48 sati kao što je prethodno opisano [23,24]. Zatim su obojene pomoću kompleta za bojenje membrane kako bi se ispitale morfološke razlike između nediferenciranih i diferenciranih stanica. Kao što je prikazano na slici 1A,neuronDiferencirane stanice poput diferenciranih stanica rasle su manje gusto, produljivale su se i proizvodile više neurita (na slici označeno žutim strelicama) od nediferenciranih stanica. Ove morfološke promjene povezane s diferencijacijom već su primijećene, čak i nakon kraćeg izlaganja (24 h) ATRA-i [24,30]. Što je još važnije, broj neurita dramatično raste do razine kada mogu stvoriti mrežu neurita. Zbog toga je izmjerena viabilnost stanica kako bi se usporedila brzina proliferacije nediferenciranih i diferenciranih SH-SY5Y stanica. Viabilnost nediferenciranog SH-SY5Y uzeta je kao maksimalna stopa proliferacije. Rezultati prisutni u

Slika 1B pokazuje da je stopa proliferacije (procijenjena Calcein AM testom održivosti) SH-SY5Y smanjena za 23 posto nakon 48 h ATRA tretmana.

Slika 1. (A) Fluorescentne mikrofotografije stanica SH-SY5Y s membranama obojenim pomoću pribora za izrastanje Neurita (Invitrogen™): kontrolne, nediferencirane stanice (izložene lažnoj otopini za liječenje:<0.1% dmso);="" cells="" differentiated="" by="" exposure="" to="" 10="" um="" all-trans="" retinoic="" acid="" (atra)="" for="" 48="" h.="" bars="50" um.="" (b)="" proliferation="" rates="" of="" undifferentiated="" and="" differentiated="" sh-sy5y="" cells:="" numbers="" of="" viable="" cells="" after="" 48="" h="" exposure="" to=""><0.1% dmso="" and="" 10="" um="" atra,="" respectively.="" data="" were="" obtained="" from="" five="" independent="" experiments="" with="" triplicate="" cultures:="" asterisks="" show="" the="" significance="" of="" differences="" in="" numbers="" of="" viable="" cells="" (as="" percentages="" of="" numbers="" of="" undifferentiated="" cells)="" between="" the="" cultures:="" *="" p="" <="">

Tablica 2. Kapacitet apsorbancije kisikovih radikala (ORAC) ispitivanihcitokinini(CK) izraženo kao Trolox ekvivalenti (TE) na ekvimolarnoj osnovi. Nazivi, kratice i strukture CK prikazani su na slici 1.

2.3. Citotoksičnost citokinina prema stanicama SH-SY5Y sličnim neuronima

U testovima potencijalne citotoksičnosti CK s Calcein AM testom održivosti [31] većina je pokazala nisku toksičnost premaneuron-poput stanica SH-SY5Y. Smanjenje vitalnosti ispod 90 posto smatralo se pragom neurotoksičnog učinka. Jedine dvije iznimke bile su KR (11,9 posto) i pTR (10,5 posto), u skladu s prethodnim nalazima da su nekicitokininmetaboliti, osobito ribozid, mogu imati citotoksične učinke [32]. Ostali ribozidi, kao što su cZR, iPR, oTR, mTR, nisu uzrokovali vidljivo smanjenjeneuron-like SH-SY5Y stanica (Tablica 3). DFO [33,34] i NEC-1 [35,36] korišteni kao pozitivne kontrole u našem in vitro modelu također su dokazani drugim studijama na stanicama SH-SY5Y kao netoksični. Zaključno, uglavnom derivati ​​KR i pTR pokazali su nižu održivost od 90 posto i stoga su se smatrali manje zanimljivima za daljnju procjenu u oba in vitro modela neurodegeneracije.

Tablica 3. Preživljavanje stanica odneuron-poput stanica SH-SY5Y nakon izlaganjacitokininitijekom 24 h. Viabilnost je izražena kao postotak DMSO kontrole.

2.4. Identifikacija neuroprotektivnih citokinina u SAL-induciranom modelu PD-a

Za ove testove,neuronskiStanice SH-SY5Y diferencirane su 48 sati, a zatim su tretirane s 500 uM SAL i svakim CK u tri koncentracije (0,1, 1, 10 uM). Kao što je prikazano isprekidanom linijom na slici 2A, primjena neurotoksina SAL od 500 uM smanjila je održivost diferenciranih SH-SY5Y stanica, prema Calcein AM testu, za 30 posto. N-acetilcistein (NAC) korišten je kao pozitivna kontrola u ovim testovima zbog njegovog prethodno prijavljenog neuroprotektivnog učinka u istom in vitro modelu SH-SY5Y koji se temelji na stanicama [37]. Koncentracije od 10, 100 i 1000 uM NAC korištene su za izazivanje djelomičnog ili gotovo potpunog oporavka u SAL modelu. NAC je uspio povećati vitalnost stanica pri koncentraciji od 100 uM i 1 mM, što odgovara 83,39 ± 1,74 posto odnosno 89,21 ± 2,89 posto. Zaštitna aktivnost NAC-a pri 100 uM (označena isprekidanom linijom na slici 2A) korištena je kao prag potencije za odabir CK za daljnja ispitivanja. Prema ovoj postavci, biološki značajne neuro-zaštitne aktivnosti uočene su s K3G na 10 uM (81,84 ± 2,36 posto), cZR na 0,1 uM (81,14 ± 2,30 posto) i 1 uM (81,53 ± 2,24 posto) i iPR na 1 uM (82,43 ± 2,51 posto). Stoga su iPR i cZR bili učinkoviti neuroprotektori pri nižim mikro ili submikromolarnim koncentracijama od NAC. Thecitokininprobir je također otkrio da mnogi drugi metaboliti mogu umjereno povećati održivost diferenciranih SH-SY5Y stanica izloženih SAL-u. Međutim, neki ispitani CK (uključujući tZR, tZMP, mT, mTR, pT i pTR) imali su vrlo mali zaštitni učinak.

Slika 2. (A)Neuroprotektivnoaktivnost odcitokininii N-acetilcistein (NAC) u SAL-induciranom modelu PD-aneuron-poput stanica SH-SY5Y. Isprekidana linija prikazuje prag NAC učinka na kojemcitokininiodabrani su za daljnje testiranje; isprekidana linija zatim broji broj živih stanica u Calcein AM testu nakon tretiranja stanica s 500 uM SAL; zdrave kontrolne stanice (CTR, DMSO < 0,1="" posto).="" tri="" primjerka="" u="" najmanje="" tri="" odvojena="" dana.="" (b)="" normalizirana="" smrt="" stanica="" sh-sy5y="" nakon="" bojenja="" propidijevim="" jodidom.="" utrostručiti="" u="" najmanje="" pet="" neovisnih="" dana.="" *="" p="" u="" usporedbi="" s="" nosačem="" s="" 500="" um="" sal,="" #="" p="" u="" usporedbi="" s="" nosačem="" bez="" 500="" um="">

Kako bi se potvrdile najaktivnije prirodne anti-PD aktivnosti CK, ukupne stope stanične smrti kvantificirane su bojenjem propidijevim jodidom (PI), koje (za razliku od testova održivosti koji se temelje na staničnom metabolizmu) označava samo stanice s narušenim integritetom membrane, umiruće stanice , i već mrtve stanice [38]. Rezultati su normalizirani s obzirom na stopu stanične smrti nakon liječenja samo SAL-om (postavljeno kao 100 posto). Kao što je prikazano na slici 2B, NAC pozitivna kontrolna tvar značajno je smanjila stope stanične smrti i kod 100 i kod 1000 uM (na 77,3 ± 2,21 posto odnosno 77,5 ± 4,44 posto). Sve u svemu, NAC se pokazao kao aneuroprotektivniagens s aktivnostima usporedivim s onima zabilježenim u drugim studijama na način ovisan o dozi (u rasponu od 50–500 uM) za stanice SH-SY5Y [37]. PI test je također pokazao da CKs cZR, K3G i iPR imaju zaštitne aktivnosti, posebno cZR, što je smanjilo stopu stanične smrti na 71,6 ± 5,08 posto pri 0,1 uM. Za razliku od cZR, K3G je imao obrnute učinke ovisne o dozi, s maksimalnom aktivnošću pri 10 uM (smanjenje stope stanične smrti na 75,0 ± 3,69 posto), a aktivnost NPR-a dosegla je vrhunac pri 1 uM (smanjenje stope na 73,9 ± 4,99 posto). Uzeti zajedno, kao što je prikazano na slici 2, CK su dali usporediveneuroprotektivniaktivnost do 100 uM NAC prema testovima vijabilnosti i citotoksičnosti. Štoviše, učinkovite koncentracije CK kao što su cZR i iPR bile su mnogo niže od onih NAC, u submikromolarnom i mikromolarnom rasponu. Prethodna opažanja dobivena nakon dvostrukog bojenja s PI i aneksinom V/PI pokazuju da K može smanjiti apoptozu [39], stoga smo također istražili učinke CK i NAC na oksidativni stres i aktivaciju kaspaze-3,7 (dobro- poznati marker apoptoze).

2.5. Citokinini smanjuju stvaranje superoksidnih radikala izazvano SAL-om

Oksidativni stres (OS) ključni je patološki čimbenik za nekoliko neurodegenerativnih bolesti, a i SAL (pri > 100 uM) i tetrahidroizokinolini snažni su induktori OS [26,40]. Stoga smo također mjerili stvaranje superoksida (ROS i važan marker OS) u prisutnosti SAL sa i bez odabranih CK ili NAC. Kako bi se osiguralo da je SAL izazvao dovoljno OS oštećenja u stanicama SH-SY5Y za otkrivanje odgovora, stanice su bile izložene 500 uM SAL-a tijekom 24 sata, kao u prethodnom radu [37] i u skladu s gore prikazanim nalazima. Stanice su zatim obojene dihidroetidijem (DHE) kako bi se otkrilo stvaranje superoksidnog radikala [41,42]. Kao što se može vidjeti na slici 3A, stanice su vizualno promatrane nakon obilježavanja s DHE (koji daje signale crvene fluorescencije nakon reakcije sa superoksidom). SAL je izazvao jasan porast DHE fluorescencije, u odnosu na razine u kontrolnim stanicama i stanicama tretiranim NAC-om. Štoviše, tri CK (cZR, K3G i iPR) imala su slične vizualne učinke kao NAC (100 uM) na DHE fluorescenciju. Nadalje, spektrofotometrijska kvantifikacija s obzirom na razine otkrivene u stanicama tretiranim samo SAL-om (postavljeno kao 100 posto), bila je u skladu s promatranjem mikroskopa. Kao što je prikazano na slici 3B, normalizirana razina superoksida u zdravim kontrolnim stanicama (CTR) bila je manja od 39 posto, a pozitivna kontrolna tvar NAC omogućila je umjereno do potpuno smanjenje proizvodnje ROS-a izazvane SAL-om pri 100 i 1000 uM (na 76,3 ± 4,33 i 44,3 ± 5,12 posto), što sugerira da smanjenje glutationa (GSH) igra ključnu ulogu u modelu [26]. Zanimljivo je da je SAL izazvao dramatično smanjenje sadržaja GSH u stanicama SH-SY5Y popraćeno povećanjem OS-a, do razina sličnih onima prethodno uočenim u studiji koja je također zabilježila učinke posredovane NAC-om na vitalnost stanica, staničnu smrt i sadržaj glutationa [43] . Ovdje prikazani rezultati pokazuju da je NAC također smanjio stvaranje superoksidnih radikala na bazalne razine (tj. razine u kontrolama tretiranim DMSO). CK ribozidi su ispitani u aktivnim koncentracijama (0,1-1 uM) zajedno s K3G, i značajno su smanjili sadržaj superoksidnih radikala u stanicama na sljedeće razine (u odnosu na one stanica tretiranih samo SAL-om): cZR 80,34 ± 5,99 posto na 0,1 uM ; K3G 77,1 ± 4,89 posto na 10 uM; iPR 79,2 ± 5,91 posto pri 1 uM, usporedivo s učincima 100 uM NAC. Zajedno, ortogonalne demonstracije snažno ukazuju na to da snažna anti-OS aktivnost igra ključnu ulogu u zaštitnim učincima NAC i CK u SAL-induciranom PD modelu. Korelaciju između poboljšanja OS i neuroprotekcije primijetili su i drugi autori [29], a nekoliko je studija otkrilo da K i BAP mogu izravno poboljšati aktivnosti OS [44] stvaranjem kompleksa s Cu2 plus ionima, što rezultira superoksid dismutazom- sličnu aktivnost [45,46]. Međutim, CK su također opisani kao neizravni antioksidansi s učincima posredovanim indukcijom staze antioksidativnog odgovora (iPR) 2-srodnog faktoru 2 (NRF2) [22] ili djelomičnim obnavljanjem aktivnosti glutation peroksidaze i SOD ( K) [16]. Osim toga, K navodno imaneuroprotektivniaktivnosti protiv OS oštećenja izazvanih H2O2 u SH-SY5Y stanicama [17]. Obje vrste prijavljenih anti-ROS aktivnosti CK potencijalno bi mogle objasniti učinke cZR, K3G i iPR u smanjenju superoksidnih radikala u modelu PD stanica SH-SY5Y izazvanom SAL-om [47-50].

Slika 3. (A) Mikrofotografije koje prikazuju oksidativni stres izazvan SAL-om i aktivnosti smanjenja oksidativnog stresacitokininiu ljudskom diferenciranneuronstanice slične SH-SY5Y vizualizirane fluorescentnom mikroskopijom nakon obilježavanja dihidroetidijem (DHE). Šipke=50 um. Slike prikazuju stanice tretirane otopinom DMSO (kontrole), 500 uM salsolinola (SAL) samog i kombinacije 500 uM SAL i 1000 uM NAC (plus NAC), 0,1 uM cZR (plus cZR); 10 uM K3G (plus K3G), 1 uM iPR (plus iPR) 24 h prije bojenja s DHE. (B) SAL-inducirano stvaranje superoksidnog radikala icitokininili zaštitnu aktivnost N-acetilcisteina (NAC). Grafikon prikazuje kvantifikaciju DHE obojenih stanica pomoću čitača mikropločica Infinite M200 Pro (Tecan, Austrija). Utrostručiti u najmanje pet neovisnih dana. * P u usporedbi s nosačem s 500 uM SAL, # P u usporedbi s nosačem bez 500 uM SAL.