Sažetak

Regenerativna medicina dobiva sve veću pozornost kao novi terapijski pristup zbog nedostatka tretmana za bolesti bubrega. Nedavni napredak u bubrežnoj regeneraciji korištenjem ljudskih induciranih pluripotentnih matičnih stanica (hiPSC) vrijedan je pažnje. Na temelju znanja o razvoju bubrega, hiPSC-i se diferenciraju u dvije vrste embrionalnih bubrežnih progenitorskih stanica, nefronskih metaboličkih progenitorskih stanica (NPC) i ureteralnih pupoljaka (UB), sposobnih za generiranje nefrona i prikupljanje organa sličnih kanalima. Osim toga, tkivo ljudskog bubrega može se generirati iz ovih progenitorskih stanica izvedenih iz hiPSC-a u kojima su glomeruli i tubuli izvedeni iz NPC-a i sabirnih kanalića izvedenih iz UB-a međusobno povezani. Inducirano bubrežno tkivo je dalje vaskularizirano nakon transplantacije u imunodeficijentne miševe. Osim bubrežne rekonstrukcije za transplantaciju, pokazalo se da stanična terapija NPC-om izvedenim iz hiPSC-a ublažava akutnu ozljedu bubrega (AKI) kod miševa. Modeliranje bolesti i studije otkrivanja lijekova koji koriste hiPSC specifične za bolest također su snažno korišteni u refraktornim bolestima bubrega kao što je autosomno dominantna policistična bolest bubrega (ADPKD). Kako bi se riješile komplikacije povezane s bubrežnim bolestima, stanice koje proizvode eritropoetin (EPO) izvedene iz hiPSC-a uspješno su stvorene za otkrivanje lijekova i razvoj staničnih terapija za bubrežnu anemiju. Ovaj članak daje pregled sadašnjih i budućih perspektiva bubrežne razvojne biologije i regenerativne medicine za bubrežne bolesti temeljene na iPSC tehnologiji.

Ključne riječi

iPSC ;Regeneracija bubrega ;Nephron progenitor stanica;Ureterični pupoljak;Stanična terapija ; Modeliranje bolesti;Cistanche tubulosa

Uvod

Bolest bubrega predstavlja veliki medicinski problem i ekonomski teret u cijelom svijetu, ali zbog ozbiljnog nedostatka organa darivatelja, postoji nekoliko drugih mogućnosti liječenja osim transplantacije bubrega. Jedno je rješenje razviti strategije regenerativne medicine korištenjem ljudskih pluripotentnih matičnih stanica (hPSC), kao što su embrionalne matične stanice (hESC) i inducirane pluripotentne matične stanice (hiPSC). Budući da hPSC imaju potencijal beskonačne proliferacije i diferencijacije u bilo koju vrstu stanica, uključujući bubrežne stanice, očekuje se da služe kao izvor stanica za regenerativnu medicinu, kao što je rekonstrukcija bubrega i stanična terapija. Osim toga, hPSC-i specifični za bolest s genetskom osjetljivošću na izazivanje specifičnih bolesti mogu se koristiti za razvoj patoloških analiza i modela otkrivanja lijekova u kojima oštećeni tipovi stanica diferencirani od hPSC-a repliciraju fenotipove bolesti in vitro. U ovom članku sažimam nedavni napredak u istraživanju regeneracije bubrega temeljenom na razvojnoj biologiji i opisujem buduće izglede za regenerativnu medicinu i modeliranje bolesti bubrega.

Kliknite ovdje za kupnjuEkstrakt Cistanche tubulosa

Razvoj bubrega

Bubreg potječe iz ranog embrionalnog blastoderma, intermedijarnog mezoderma (IM) (Slika 1a). U kralješnjaka, IM daje tri bubrega u nizu, primarni, srednji i stražnji bubreg (Slika 1b). Srednji bubreg je odrasli bubreg riba i vodozemaca, a stražnji bubreg je odrasli bubreg gmazova, ptica i sisavaca. Iako su ova tri bubrega slična jer se sastoje od nefrona, koji su funkcionalne jedinice bubrega, imaju različit broj nefrona. Postnefron bubrega odraslih sisavaca sastoji se od dva embrionalna tkiva, postnefričnog mezenhima (MM) i ureteralnog pupoljka (UB; slika 1 c). MM tvori nefron i mezenhim bubrega odrasle osobe, a UB se diferencira i formira donji urinarni trakt od sabirnog kanala do dijela mokraćnog mjehura.

Slika 1: Usmjerena diferencijacija stanica loze bubrega. ac Shematski crteži koji prikazuju specifikaciju mezoderma (a), formiranje tri bubrega (b) razvoj metanefrosa (c). IM: intermedijarni mezoderm; MM: metanefrični mezenhim; UB: pupoljak uretera.

Generiranjem novog klonogenog testa, prvi put smo pokazali da MM sadrži multipotentne progenitorske stanice koje se mogu diferencirati u više vrsta epitelnih stanica koje čine nefron, kao što su glomerularne stanice stopala i tubularne epitelne stanice. Kasnije su eksperimenti s genealoškim praćenjem otkrili da su te progenitorske stanice obilježene transkripcijskim faktorom Six2. Ove stanice preteče sada se nazivaju bubrežne metaboličke pretečke stanice (NPC). Taguchi i sur. pokazalo je da je IM podijeljen na prednju i stražnju domenu, što dovodi do UB, odnosno MM. na temelju ovih otkrića u razvoju bubrega, pokrenuti su napori za regeneraciju bubrežnih genealoških stanica iz hPSC-a.

Usmjerena diferencijacija hPSC-a u loze bubrega

Kao preliminarna mjera diferenciranja hiPSC izravno u loze bubrega oponašanjem razvoja bubrega, naša se grupa usredotočila na stvaranje IM stanica i generirala reporterske hiPSC linije s genom OSR1, specifičnim markerom za IM, uređivanjem gena. Koristeći sustav kvantitativne procjene i reporterske hiPSC linije, razvili smo učinkovitu shemu diferencijacije za induciranje hiPSC-a u IM stanice koje eksprimiraju osr1. Ove inducirane IM stanice pokazale su razvojni potencijal za daljnju diferencijaciju u tipove odraslih bubrežnih stanica, kao što su glomerularni podociti i tubularne stanice, i formirale su trodimenzionalne (3D) tubularne strukture ko-kulturom sa stanicama stražnjeg bubrega miša.

Prednosti ekstrakta cistanche

Taguchi i sur. razvili su prvu metodu za selektivnu diferencijaciju mišjih ESC-a (mESC-a) i hiPSC-a putem stražnjeg IM-a za induciranje NPC-a i generirali organe slične bubrežnim jedinicama koji sadrže glomerule i tubule iz induciranih NPC-a in vitro. Takasato i sur. su izvijestili o stvaranju organa sličnih bubrezima koji sadrže više tipova bubrežnih stanica, kao što su glomeruli, tubuli, sabirni kanalići, intersticijske stanice i vaskularne stanice. Razvijanjem 2D sustava kulture, Morizane et al. učinkovito generirao NPC iz hiPSC-a, a zatim generirao bubrežne metaboličke organoide iz NPC-a. Nedavno je naša skupina razvila metodu postupne diferencijacije koja učinkovito inducira hiPSC u NPC koji ima potencijal diferencijacije za stvaranje organa sličnih bubrežnim jedinicama (Slika 2 d, e). Naša metoda diferencijacije sastoji se od šest koraka i bolje sažima prirodni razvojni proces NPC-a od metoda koje su objavili Takasato i sur. i Morizane et al. i generira NPC u formatu 2D diferencijacije učinkovitije od metode koja koristi 3D kulturu Taguchija i sur.

Što se tiče usmjerene diferencijacije UB loze, Taguchi i Nishinakamura diferencirali su mESC i hiPSC u strukture slične UB kroz prednji IM i bubrežne tubule (ND). Međutim, ND epitelne stanice inducirane su s niskom učinkovitošću, a naknadna analiza zahtijevala je pročišćavanje ND stanica protočnom citometrijom. Razvili smo učinkovitiju metodu 2D diferencijacije koja generira ND epitelne stanice iz hiPSC-a pomoću pre-IM i uključuje naknadni korak diferencijacije bez pročišćavanja (Slika 2 f, g). U 3D kulturi, inducirane ND stanice formirale su UB-like strukture s RET(plus) vrhovima i CK8(plus) matičnim strukturnim domenama. Međutim, generirane UB-like strukture iz obje skupine pokazale su ograničen potencijal grananja.

Slika 2: d: Imunološko bojenje nefronskih progenitorskih stanica (NPC) izvedenih iz hiPSC za OSR1, SIX2 i HOXD11.e: Imunološko bojenje organoida nefrona formiranog iz NPC-a izvedenih iz hiPSC-a nakon 10 dana kulture sučelja zrak-tekućina. PODXL: Podocalyxin (podocitni marker; bijeli); LTL: Lotus tetragonolobus lektin (marker proksimalnog tubula; crveno); CDH1: CADHERIN 1 (marker distalnog tubula; zeleno).f, g: Imunološko bojenje prednjih IM stanica za OSR1 (zeleno) i GATA3 (crveno; f) i agregat stanica nefričnog kanala za E-KADHERIN (zeleno), GATA3 (crveno) i jezgre (plavo; g).h: Morfološka promjena tijekom rekonstrukcije grananja iUB organoida tijekom 7 dana.

Nedavno smo modificiranjem naše metode diferencijacije UB uspješno generirali inducirane organe slične UB (iUB) s epitelnim polaritetom, tubularnim lumenom i ponavljajućom morfogenezom grananja (Slika 2,3 hj). Nadalje, uspješno smo inducirali diferencijaciju ovih organa sličnih iUB-u u njihove in vivo parnjake skupljanjem organa sličnih kanalima u ljudskim embrijima u 7. tjednu gestacije (Slika 3k).

Slika 3:i: Imunološko bojenje iUB organoida za RET (zeleno), CK8 (crveno) i PAX2 (plavo).j Bojanje iUB organoida toluidin plavim koje pokazuje cjevaste lumene.k: Slike svijetlog polja (lijevo) i slike imunološkog bojenja (sredina i desno) cjevastih struktura sličnih sabirnim kanalima izvedenih iz iUB organoida za FOXA1 (bijelo), AQP2 (crveno) i GATA3 (zeleno). Mjerne trake, 100 μm. (d) i (e) prilagođeni su iz Tsujimoto et al. [12], (f) i (g)–(k) prilagođeni su iz Mae et al. odnosno

Ekspanzija progenitora bubrega

Kako bi se osigurao velik broj bubrežnih stanica za temeljna i klinička istraživanja, istražene su metode in vitro ekspanzije embrionalnih bubrežnih progenitorskih stanica u kulturi. Brown i sur. i Tanigawa et al. izvijestio je o in vitro ekspanziji NPC-a u mišjim embrijima. NPC iz mišjih i ljudskih embrija ekspandirani su i održavani in vitro 17 odnosno 7 mjeseci, koristeći 3D kulturu agregacije stanica Li et al. Skupina je također koristila istu metodu za proširenje NPC diferenciranih od hiPSC-a in vitro tijekom 2 mjeseca. Iako sve tri metode koriste koštani morfogenetski protein (BMP), uloga BMP7 u širenju NPC ostaje nepoznata. Probirom spojeva identificirali smo inhibitor JAK3, TCS21311, kao alternativu BMP7 u ekspanzijskoj kulturi bb0 koju su razvili Li et al. i otkrio inhibicijski učinak BMP7 na širenje nazofaringealnog karcinoma u JAK3- stat3 signalnom putu. Osim toga, dodavanje TCS21311 ekspanzijskoj kulturi poboljšalo je stopu proliferacije mišjih embrija i NPC-a izvedenih iz hiPSC-a.

Nedavno smo razvili ekspanzionu kulturu UB stanica izvedenih iz hiPSC-a u kojoj su pojedinačne stanice izolirane iz organa sličnih iUB-u proliferirale i formirale kolonije koje eksprimiraju markere UB vrha. Ove vršne kolonije mogu rekonstituirati organe slične iUB-u u potencijalu ponavljajućeg grananja, a ovaj se proces rekonstitucije može ponoviti najmanje tri puta.

standardizirani Cistanche

Rekonstrukcija bubrega

Rani radovi na rekonstrukciji bubrežnih struktura koristili su pretpostavljenu ektodermalnu regiju oplođenog jajeta vodozemca, nazvanu životinjska kapa, koja je pluripotentna stanična masa (Slika 4a). Moriya i sur. izvijestili su da kombinacija tretmana aktivinom A i retinoičnom kiselinom (RA) inducira diferencijaciju životinjske kapice u prorenalne tubule in vitro. Brennan i sur. također inducira prorenalne angiosperme u egzosomima. Pokazali smo da inducirani egzosomi sadrže prerenalne tubule i mogu regenerirati prerenalno tkivo iz pluripotentnih stanica vodozemaca in vitro (Slika 4 bd). Iako se in vitro regeneracijski sustav prerenalnog ne može izravno prevesti u kliničke studije, može poslužiti kao jednostavan i koristan sustav za proučavanje razvoja bubrega.

Slika 4: Rekonstrukcija bubrežnih struktura. a: Shema koja prikazuje stvaranje pronefrosnih struktura iz životinjske kapice embrija Xenopusa. b–d: Cijeli nosač (b) i dvostruke imunološke bojene slike presjeka (c, d): Xenopus eksplantata ekvivalentnog stadija 42 (b, c) i ličinke stadija 40 (d) pomoću antitijela specifičnog za pronefrične tubule (3G8, crveno ) i protutijelo specifično za pronefrični kanal (4A6, plavo).

Za razliku od stvaranja organa sličnih jedinicama bubrega iz NPC-a izvedenih iz mESC-a i hPSC-a i prikupljanja organa sličnih kanalima iz UB stanica izvedenih iz hPSC-a, Taguchi et al. generirao organe nalik mišjim bubrezima kombiniranjem NPC-a i UB-ova izvedenih iz mESC-a i mezenhimalnih progenitorskih stanica uklonjenih iz mišjih embrija, koji sadrže glomerule, tubule i sabirne kanaliće, kao što je gore opisano. Generirali smo organe slične ljudskim bubrezima in vitro kokulturom NPC i UB stanica induciranih hiPSC-ima, u kojima su glomeruli i tubuli izvedeni iz NPC-a i sabirni kanalići izvedeni iz UB-a bili međusobno povezani (Slika 5 e, f). Kada su transplantirani u subepitelni prostor imunodeficijentnih miševa, ti organi slični bubrezima izvedeni iz hiPSC-a integrirali su se u vaskulaturu miševa domaćina (Slika 5gi).

Slika 5:e: Shema koja prikazuje in vitro rekonstrukciju bubrežnih struktura iz hiPSC-a. f: Trostruko imunološko bojenje organoida bubrega 20. dana za markere podocita (PODXL), proksimalnih tubula (LTL) i distalnih tubula i sabirnih kanalića (CDH1; lijevo), te za PODXL i markere distalnih tubula i sabirnih kanalića (AVPR2) i sabirnih kanalića samo kanali (CALB1; desno). Imajte na umu da su slabi CDH1 signali također pronađeni u dijelovima LTL plus proksimalnih tubula na lijevoj ploči. g: Shema koja prikazuje in vivo rekonstrukciju bubrežnih struktura iz hiPSC-a. h: Slika manjeg povećanja koja prikazuje cijeli bubreg domaćina i transplantat bubrega izveden iz hiPSC (zeleno) nakon primjene dekstrana konjugiranog s rodaminom B kroz repnu venu miša domaćina. i: Intravitalna multifotonska mikroskopska slika nakon injekcije rodaminom B-konjugiranog dekstrana u repnu venu koja pokazuje kako lumeni krvnih žila miševa domaćina prodiru u strukturu sličnu glomerulu izvedenu iz hiPSC (zeleno). Mjerne trake, 100 μm u (b)–(d) i (f), 500 μm u (h) i 40 μm u (i). (b)–(d) i (e)–(i) prilagođeni su iz Osafune et al. i Tsujimoto et al

Za transplantaciju bubrežnih organa s urinarnim traktom istraživane su metode koje koriste tijela pokusnih životinja, kao što su međuvrsna komplementacija blastociste i metode ekotona organa. Goto i sur. ubrizgali mESC divljeg tipa u blastociste anemičnih Sall1(-/-) štakora i uspješno generirali mišje bubrege u štakora domaćina. Fujimoto i sur. razvili su metodu transplantacije stanica u kojoj su NPC-ovi izvedeni iz hiPSC-a transplantirani u regiju bubrega u razvoju (tj. ekoton organa) embrija maternice miša, a transplantirani NPC-ovi zajedno su formirali mezenhim himerne kapice s NPC-ima domaćina pričvršćenim na UB miša domaćina. Međutim, iako su glomeruli i tubuli izvedeni iz mm izvedeni iz ubrizganih PSC-ova ili NPC-ova, preostali tipovi bubrežnih sastavnih stanica, kao što su sabirni kanalići izvedeni iz UB-a i inferiorne uretralne i vaskularne stanice, izvedeni su iz životinje domaćina u obje strategije.

Biljna cistanča

REFERENCE

1. GBD suradnja s kroničnom bubrežnom bolešću. Globalni, regionalni i nacionalni teret kronične bubrežne bolesti, 1990. – 2017.: sustavna analiza za studiju Globalnog tereta bolesti 2017. Lancet. 2020;395(10225):709–33.

2. Karagiannis P, Takahashi K, Saito M, Yoshida Y, Okita K, Watanabe A, Inoue H, Yamashita JK, Todani M, Nakagawa M, Osawa M, Yashiro Y, Yamanaka S, Osafune K. Inducirane pluripotentne matične stanice i njihove korištenje u ljudskim modelima bolesti i razvoja. Physiol Rev. 2019;99(1):79–114.

3. Saxen L. Organogeneza bubrega. Cambridge: Cambridge University Press; 1987. godine.

4. Osafune K, Takahata M, Kispert A, Asashima M, Nishinakamura R. Identifikacija multipotentnih progenitora u embrionalnom mišjem bubregu pomoću novog testa stvaranja kolonija. Razvoj. 2006;133(1):151–61.

5. Kobayashi A, Valerius MT, Mugford JW, Carroll TJ, Self M, Oliver G, McMahon AP. Six2 definira i regulira multipotentnu samoobnavljajuću populaciju progenitora nefrona tijekom razvoja bubrega sisavaca. Matične stanice stanica. 2008;3(2):169–81.

6. Taguchi A, Kaku Y, Ohmori T, Sharmin S, Ogawa M, Sasaki H, Nishinakamura R. Redefiniranje in vivo podrijetla metanefričkih nefronskih progenitora omogućuje stvaranje složenih struktura bubrega iz pluripotentnih matičnih stanica. Matične stanice stanica. 2014;14(1):53–67.

7. Mugford JW, Sipilä P, McMahon JA, McMahon AP. Ekspresija Osr1 razgraničava multi-potentnu populaciju srednjeg mezoderma koja prolazi kroz progresivnu restrikciju na odjeljak progenitor nefrona ovisan o Osr1- unutar bubrega sisavaca. Dev Biol. 2008;324(1):88–98.

8. Mae S, Shono A, Shiota F, Yasuno T, Kajiwara M, Gotoda Nishimura N, Arai S, Sato-Otubo A, Toyoda T, Takahashi K, Nakayama N, Cowan CA, Aoi T, Ogawa S, McMahon AP, Yamanaka S, Osafune K. Praćenje i snažna indukcija nefrogenog intermedijarnog mezoderma iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica. Nat Commun. 2013;4:1367.

9. Araoka T, Mae S, Kurose Y, Uesugi M, Ohta A, Yamanaka S, Osafune K. Učinkovita i brza indukcija ljudskih iPSC/ESC u nefrogeni intermedijarni mezoderm korištenjem metoda diferencijacije temeljenih na malim molekulama. PLoS JEDAN. 2014;9(1):e84881.

10. Takasato M, Er PX, Chiu HS, Maier B, Baillie GJ, Ferguson C, Parton RG, Wolvetang EJ, Roost MS, de Sousa C, Lopes SM, Little MH. Organoidi bubrega iz ljudskih iPS stanica sadrže više loza i modeliraju ljudsku nefrogenezu. Priroda. 2015;526(7574):564–8.

11. Morizane R, Lam AQ, Freedman BS, Kishi S, Valeius MT, Bonventre JV. Nefronski organoidi izvedeni iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica modeliraju razvoj i ozljedu bubrega. Nat Biotechnol. 2015;33(11):1193–200.

12. Tsujimoto H, Kasahara T, Sueta S, Araoka T, Sakamoto S, Okada C, Mae SI, Nakajima T, Okamoto N, Taura D, Nasu M, Shimizu T, Ryosaka M, Li Z, Sone M, Ikeya M, Watanabe A, Osafune K. Modularni sustav diferencijacije mapira višestruku lozu ljudskih bubrega iz pluripotentnih matičnih stanica. Cell Rep. 2020;31(1):107476.

13. Taguchi A, Nishinakamura R. Organogeneza bubrega višeg reda iz pluripotentnih matičnih stanica. Matične stanice stanica. 2017;21(6):730-46. e6.

14. Mae SI, Ryosaka M, Toyoda T, Matsuse K, Oshima Y, Tsujimoto H, Okumura S, Shibasaki A, Osafune K. Stvaranje razgranatog tkiva pupoljaka uretera iz ljudskih pluripotentnih matičnih stanica. Biochem Biophys Res Commun. 2018;495(1):954–61.

15. Mae SI, Ryosaka M, Sakamoto S, Matsuse K, Nozaki A, Igami M, Kabai R, Watanabe A, Osafune K. Ekspanzija humanih iPSC-derived ureteric pupoljaka organoida s ponovljenim potencijalom grananja. Cell Rep. 2020;32(4):107963.

16. Brown AC, Muthukrishnan SD, Oxburgh L. Sintetička niša za stanice preteče nefrona. Dev Cell. 2015;34(2):229–41.

17. Tanigawa S, Taguchi A, Sharma N, Perantoni AO, Nishinakamura R. Selektivno in vitro razmnožavanje progenitora nefrona izvedenih iz embrija i pluripotentnih matičnih stanica. Cell Rep. 2016;15(4):801–13.

18. Li Z, Araoka T, Wu J, Liao H, Li M, Lazo M, Zhou B, Sui Y, Wu MZ, Tamura I, Xia Y, Beyret E, Matsusaka T, Pastan I, Rodriguez Esteban C, Guillen I , Guillen P, Campistol JM, Ispisua Belmonte JC. 3D kultura podržava dugoročnu ekspanziju mišjih i ljudskih nefrogenih pretka. Matične stanice stanica. 2016;19(4):516–29.

19. Tsujimoto H, Araoka T, Nishi Y, Ohta A, Nakahata T, Osafune K. Mala molekula TCS21311 može zamijeniti BMP7 i olakšati staničnu proliferaciju in vitro ekspanzijske kulture nefronskih progenitorskih stanica. Biochem Biophys Res Commun. 2020.

20. Moriya N, Uchiyama H, Asashima M. Indukcija pronefričnih tubula aktivinom i retinoičnom kiselinom u pretpostavljenom ektodermu Xenopus laevis. Razlika u razvoju razvoja. 1993;35:123-8.

21. Brennan HC, Nijjar S, Jones EA. Specifikacija i inducibilnost faktora rasta pronefričnog glomusa u Xenopus laevis. Razvoj. 1999;126(24):5847–56.

22. Osafune K, Nishinakamura R, Komazaki S, Asashima M. In vitro indukcija pronefričnog kanala u Xenopus eksplantatima. Razlika u razvoju razvoja. 2002;44(2):161–7.

23. Goto T, Hara H, Sanbo M, Masaki H, Sato H, Yamaguchi T, Hochi S, Kobayashi T, Nakauchi H, Hirabayashi M. Generation of pluripotent stem cell-derived mouse kidney in Sall1-targeted anephric štakori. Nat Commun. 2019;10(1):451.

24. Fujimoto T, Yamanaka S, Tajiri S, Takamura T, Saito Y, Matsumoto N, Matsumoto K, Tachibana T, Okano HJ, Yokoo T. Stvaranje humanih bubrežnih mjehurića u niši organa miša korištenjem sustava zamjene nefronskih progenitorskih stanica. Cell Rep. 2020;32(11):108130.