Dio 1: Feniletanoidni glikozidi Cistanche Tubulosa induciraju apoptozu stanica hepatocelularnog karcinoma i pojačavaju antitumorski učinak
Mar 25, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Pengfei Yuan, BSc1, Changshuang Fu, MSc1, Yi Yang, PhD1, Aipire Adila, PhD1, Fangfang Zhou, MSc1, Xianxian Wei, MSc1, Weilan Wang, PhD1, Jie Lv, PhD1, Yijie Li, PhD1, Lijie Xia, PhD1, i Jinyao Li, PhD1
Sažetak
Cistanche tubulosa je vrsta kineskog biljnog lijeka i ima različite biološke funkcije. Prethodne studije su to pokazaleCistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) pokazuju antitumorske učinke na različite tumorske stanice. Međutim, antitumorski učinci CTPG-a na HepG2 i BEL-7404 stanice hepatocelularnog karcinoma (HCC) još su nedostižni. Naše je istraživanje pokazalo da CTPG značajno inhibira rast stanica HepG2 i BEL-7404 putem indukcije zaustavljanja staničnog ciklusa i apoptoze, što je povezano s aktivacijom MAPK putova karakteriziranih pojačanom fosforilacijom p38, JNK, i ERK1/2 i put ovisan o mitohondrijima karakteriziran smanjenjem potencijala mitohondrijske membrane. Otpuštanje citokroma c i cijepanje kaspaze-3, -7, -9 i PARP naknadno su povećani tretmanom CTPG-om. Štoviše, CTPG je značajno potisnuo migraciju HepG2 smanjenjem razina matrične metaloproteinaze-2 i faktora rasta vaskularnog endotela. Zanimljivo, CTPG ne samo da je pojačao proliferaciju splenocita, već je također smanjio apoptozu splenocita induciranu cisplatinom. U mišjem modelu H22 tumora, CTPG u kombinaciji s cisplatinom dodatno je inhibirao rast H22 stanica i smanjio nuspojave cisplatina. Uzeto zajedno, CTPG je inhibirao rast HCC-a putem izravnog antitumorskog učinka i neizravnog učinka imunojačanja te poboljšao antitumorsku učinkovitost cisplatina.
Ključne riječi Cistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi, apoptoza, MAPK put, mitohondrijski ovisan put, cisplatin, imunopojačanje
Cistanche ima antitumorski učinak.
Kliknite na Cistanche proizvode i Cistanche
Uvod
Predviđalo se da će rak jetre biti šesti najčešće dijagnosticirani rak i četvrti vodeći uzrok smrti od raka u svijetu u 2018., s oko 841 000 novih slučajeva i 782 000 smrtnih slučajeva godišnje u jugoistočnoj Aziji (Mongolija, Kambodža i Vijetnam) .1 U Kini je rak jetre bio treći vodeći uzrok smrti povezanih s rakom u 2015. godini.2 Više od 90 posto primarnih karcinoma jetre je hepatocelularni karcinom (HCC) diljem svijeta. Trenutno su glavne metode liječenja HCC-a hepatektomija, transplantacija jetre i perkutana ablacija. Nažalost, ti su tretmani učinkoviti za 30 posto pacijenata kojima je dijagnosticiran rani rak jetre, dok se pacijenti s dijagnozom uznapredovalog raka jetre (što čini 40 posto) moraju oslanjati na palijativno liječenje kako bi produljili vrijeme preživljavanja.3,4 Sorafenib u kombinaciji s jetrenim arterijska kemoembolija važna je i uobičajena palijativna terapija za većinu bolesnika s uznapredovalim HCC-om u azijsko-pacifičkoj regiji.5 Sorafenib, odobren od strane FDA 2006. za liječenje uznapredovalog raka jetre, višestruki je inhibitor kinaze koji inhibira proliferaciju tumorskih stanica i vaskularnu proizvodnju i potiče apoptozu tumorskih stanica. Sorafenib značajno produljuje vrijeme preživljenja bolesnika za 3 do 5 mjeseci, ali ima ozbiljne nuspojave i usko je povezan s pojavom rezistencije na lijekove.6 Stoga je hitno potrebno razviti nove lijekove ili strategije za HCC.
Tradicionalna kineska medicina (TCM) sama ili u kombinaciji s drugim strategijama korištena je za liječenje HCC-a i pokazala je kliničke prednosti uključujući produljeno vrijeme preživljavanja, poboljšanu kvalitetu života, smanjene nuspojave i tako dalje.7,8Cistancheje TCM koji sadrži feniletanoidne glikozide (PhGs), iridoide, lignin i polisaharide koji imaju različite biološke funkcije, kao što su antioksidacija, protuupalna funkcija, usporavanje starenja, poboljšanje pamćenja i jačanje imunološkog sustava.9 PhGs se smatraju kao glavne aktivne komponente Cistanchea i imaju višestruke funkcije uključujući antioksidaciju, protuupalu, anti-apoptozu, hepatoprotekciju i neuroprotekciju.10-12 Naša grupa je izvijestila daCistanchetubulosa feniletanoidni glikozidi(CTPG) bi mogao inhibirati rast stanica melanoma B16-F10, stanica karcinoma jednjaka Eca-109 i stanica HCC H22 putem vanjskih ili unutarnjih signalnih putova in vitro ili in vivo; osim toga, CTPG je imao imunostimulirajući učinak.13-15
U ovoj smo studiji istražili antitumorski učinak i mehanizam CTPG-a na HepG2 i BEL-7404 stanice in vitro, analizirali imunomodulacijsku funkciju CTPG-a in vitro i in vivo te dodatno procijenili terapijski učinak CTPG-a u kombinaciji s kemoterapijom. lijek cisplatin na HCC H22 tumorskim miševima in vivo. Otkrili smo da CTPG može inhibirati rast HepG2 i BEL-7404 stanica putem apoptoze ovisne o mitohondrijima i MAPK signalnog puta. CTPG je značajno inhibirao migraciju stanica HepG2 smanjenjem razine matrične metaloproteinaze-2 (MMP-2) i faktora rasta vaskularnog endotela (VEGF). Osim toga, CTPG je pospješio proliferaciju i aktivaciju imunoloških stanica i poboljšao imunitet miševa. Važno je da CTPG u kombinaciji s cisplatinom može dodatno inhibirati rast H22 stanica in vivo i smanjiti nuspojave cisplatina.
Cistanche jača imunitet.
Materijali i metode
Životinje
Otprilike 6 do 8 tjedana stari mužjaci BALB/c, Kunming miševa i ženke C57BL/6 miševa kupljeni su od Animal Laboratory Center, Xinjiang Medical University (Urumqi, Xinjiang, Kina) i smješteni u životinjski pogon Sveučilišta Xinjiang na sobnoj temperaturi (RT) od 25±3 stupnja i 12/12 sati svjetlo-mračno razdoblje.
Stanične linije i kultura stanica
Mišje H22 stanice kupljene su od Procell Life Science & Technology Co., Ltd. (Wuhan, Hubei, Kina), a ljudske HCC HepG2 i BEL-7404 stanice dobivene su od Xinjiang Key Laboratory of Biological Resources and Genetic Engineering, Sveučilište Xinjiang (Urumqi, Xinjiang, Kina) i uzgojeno u mediju RPMI 1640 (Gibco, SAD) ili Dulbecco modificiranom Eagleovom mediju (DMEM) (Gibco) koji sadrži 10 posto toplinski inaktiviranog fetalnog goveđeg seruma (MRC, Kina), 1 posto L- glutamin (100 mM), 100 U/mL penicilina i 100 ug/mL streptomicina na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2.
Tekuća kromatografija visoke učinkovitosti (HPLC)
Glavni spojevi CTPG (Upbio Tech Co., Ltd., Šangaj, Kina) kvalificirani su i kvantificirani HPLC-om kao što je prethodno objavljeno.13 Upotrijebljena je kolona ZORBAX SB-C18 (250×4,6 mm; 5 μm). a mobilna faza sastojala se od 0,2 posto otopine mravlje kiseline i metanola s gradijentom od 23 posto do 31 posto. Ubrizgano je ukupno 10 μL uzorka i detektirano na 330 nm. Za analizu komponenti CTPG korišteni su standardi ehinakozid i akteozid (Yuanye, Shanghai, Kina).
ehinakozid
Analiza vitalnosti stanica
Antitumorski učinci CTPG na HepG2 i BEL-7404 stanice procijenjeni su pomoću MTT (3-(4, 5-dimetil-2-tiazolil)-2, {{7 }}difenil-2-H-tetrazolijev bromid). Stanice HepG2 i BEL-7404 stavljene su u 96-pločice s jažicama (5 × 104 stanice po jažici) i tretirane s 0, 200, 400, odnosno 600 ug/mL CTPG tijekom 24 odnosno 48 sati, nakon 24 sata inkubacije na 37 stupnjeva. Oko 35 ug/mL cisplatina (Yuanye) korišteno je kao pozitivna kontrola. Zatim je u svaku jažicu dodano 100 μL MTT (0,5 mg/mL, razrijeđeno medijem bez FBS medija) i uzgajano 3 sata na 37 stupnjeva i 5 posto CO2. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane na 1200 okretaja u minuti tijekom 7 minuta, medij je uklonjen i u svaku jažicu je dodano 200 ug/mL DMSO da se otope formirani kristali formazana. Vrijednosti OD490 izmjerene su čitačem 96-jažica mikropločica (Bio-Rad Laboratories, CA, SAD). Kako bi se procijenili učinci CTPG-a na splenocite, stanice su izolirane iz C57BL/6 miševa i stavljene u 96-pločice s jažicom u gustoći od 1 × 105 stanica/jažici. Splenociti su tretirani s 0, 200, 400 i 600 ug/mL tijekom 24, 48 i 72 sata. Preživljavanje stanica izračunato je prema sljedećoj formuli: Preživljavanje stanica (postotak)=(ODtretirano/ODneliječeno) × 100 posto.
Otkrivanje Ki-67
Detekcija Ki{{0}} učinjena je prema našoj prethodnoj studiji.16 Ukratko, BEL-7404 stanice tretirane su različitim koncentracijama (0, 200, 400 i 600 ug/mL) CTPG-a ili cisplatin (35 ug/mL). Nakon 24 sata, stanice su sakupljene i isprane s PBS-om, zatim fiksirane i permeabilizirane s Foxp3 Staining Buffer Set (eBioscience, SAD) prema uputama proizvođača. Intracelularno bojenje provedeno je pomoću FITC konjugiranog Ki-67 antitijela (BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) tijekom 15 minuta na sobnoj temperaturi. Uzorci su analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur, CA, SAD).
Analiza stanične apoptoze i staničnog ciklusa
Stanice HepG2 i BEL-7404 nasađene su u gustoći od 2,5×105 stanica/posudi i inkubirane na 37 stupnjeva preko noći. Stanice su tripsinizirane i sakupljene centrifugiranjem nakon tretmana različitim koncentracijama CTPG-a ili prethodno tretiranih inhibitorom kaspaze (Z-VAD-FMK) ili inhibitorom kaspaze-3 (Ac-DEVD-CHO) (Beyotime, Kina) 2 sata prije CTPG liječenje. Nakon 24 sata, apoptoza je otkrivena protočnom citometrijom. Ukratko, sakupljene stanice isprane su hladnim PBS-om (Gibco) i resuspendirane u puferu za vezanje aneksina s 2,5 μL aneksina V-FITC i 5 μL otopine za bojenje PI-PE (Solarbio, Peking, Kina), a zatim su stanice inkubirane na sobnoj temperaturi u mraku 15 minuta. Za analizu distribucije staničnog ciklusa, stanice su sakupljene nakon tretmana CTPG-om i fiksirane u hladnom 70 postotnom etanolu na 4 stupnja tijekom 30 minuta. Stanice su obojene PI (BD Biosciences) u mraku 30 minuta. Uzorci su analizirani protočnim citometrom (BD FACSCalibur). Razine ekspresije stanične apoptoze i proteina povezanih s ciklusom detektirane su Western blotom.
Western Blot
Western blot je učinjen prema našoj prethodnoj studiji. 17HCC su tretirane CTPG-om 24 sata. Nakon dvaput ispiranja s ledeno hladnim PBS-om, sve prianjajuće i plutajuće stanice su sakupljene i lizirane u RIPA puferu za lizu (Beijing ComWin Biotech Co., Ltd) 2 0 minute na ledu. Nakon centrifugiranja na 12000 okretaja u minuti 4 stupnja tijekom 10 minuta, koncentracija proteina određena je korištenjem Bicinchoninic Acid Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, SAD) prema uputama proizvođača. Ista koncentracija proteina je odvojena s 12 posto SDS-PAGE i prebačena na PVDF membrane. Nakon ispiranja s PBST puferom (PBS s 0,05 posto Tween-20), membrane su blokirane s 5 posto nemasnog mlijeka na 37 stupnjeva tijekom 1 sata i zatim inkubirane s primarnim antitijelima (Cell Signaling Technology, MA, SAD) u odgovarajućim razrjeđenjima preko noći na 4 stupnja. Nakon ispiranja 3 puta s PBST, membrana je inkubirana s odgovarajućim HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima (eBioscience) 2 sata na 37 stupnjeva. Ciljani proteini detektirani su pomoću kompleta ECL testa (Beyotime). Podaci skeniranja sivih tonova dobiveni su pomoću Image J.
Analiza potencijala mitohondrijske membrane (Δψm)
Δψm je određen membranski propusnom bojom JC-1 (Beyotime). Ukratko, stanice HepG2 i BEL-7404 tretirane su različitim koncentracijama CTPG (0, 200, 400 i 600 ug/mL) tijekom 24 sata. Sve stanice su sakupljene i isprane s JC-1 puferom za pranje. Stanice su obojene JC-1 fluorescentnom sondom prema uputama proizvođača 20 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon dva puta ispiranja PBS-om, svi su uzorci analizirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Hoechst 33342 Bojenje
Bojanje Hoechst 33342 učinjeno je u skladu s našim prethodnim istraživanjem.16 Morfološke promjene jezgri ispitane su korištenjem membranski permeabilne boje za vezanje DNA Hoechst 33342 (Beyotime). Ukratko, stanice su inokulirane u 6-pločicu s jažicom u koncentraciji od 1×105 stanica/jažici u mediju od 2 mL. Kada se dosegne 70 do 80 posto konfluencije, stanice su tretirane s 200, 400 i 600 ug/mL CTPG-a ili cisplatina tijekom 24 sata. Stanice su isprane s PBS-om i fiksirane s 4 posto ledeno hladnim paraformaldehidom na 4 stupnja tijekom 10 minuta. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su obojene s Hoechst 33342 na 4 stupnja tijekom 10 minuta. Uzorci su promatrani fluorescentnim invertnim mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E, Japan).
ekstrakt cistanke
Ispitivanje migracije
Migracija HCC stanica otkrivena je testom zacjeljivanja rana. Ukratko, HepG2 stanice (2×104/jažici) posađene su u 24-ploču s jažicom. Nakon postizanja konfluencije od 80 posto, središte svake jažice jednom je izgrebano vrhom pipete od 20 μL. Nakon ispiranja s PBS-om, stanice su tretirane cisplatinom (35 ug/mL) ili različitim koncentracijama (0, 200, 400 i 600 ug/mL) CTPG-a na 37 stupnjeva. Nakon 24 sata, slike svakog uzorka su snimljene pod mikroskopom (Nikon Eclipse Ti-E). Prosječne udaljenosti migracije stanica analizirane su slikom J. Postotak zacjeljivanja rana izračunat je jednadžbom: zacjeljivanje rana ( postoci )=(1−područje ogrebotine u naznačenoj vremenskoj točki/područje ogrebotine u 0 sati)×100 postotak . Razine ekspresije proteina MMP-2 i VEGF povezanih s migracijom stanica otkrivene su Western blotom.
Proliferacija i apoptoza splenocita
Za analizu proliferacije, splenociti su izolirani iz 3 C57BL/6 miša i obojeni s CFSE (eBioscience). CFSE obilježene stanice inokulirane su u 24-pločice s jažicama u gustoći od 2 × 106 stanica u 1 mL medija po jažici i tretirane različitim koncentracijama CTPG (200, 400 i 600 ug/mL) ili u kombinaciji s 35 ug /mL cisplatina tijekom 72 sata. Analiza protočne citometrije provedena je nakon bojenja s CD3-APC i CD19-PE (BD Biosciences). Za analizu apoptoze, splenociti su inokulirani u 24-pločice s jažicama u gustoći od 2 × 106 stanica u 1 mL medija po jažici i tretirani različitim koncentracijama CTPG (200, 400 i 600 ug/mL) ili u kombinaciji s cisplatinom tijekom 24 sata. Analiza protočne citometrije provedena je nakon bojenja s 2,5 μL Annexin V-FITC i 5 μL PI-PE otopine.
Procjena sigurnosti i imunostimulirajuće aktivnosti CTPG in vivo
Za procjenu in vivo imunostimulirajuće aktivnosti CTPG-a, mužjaci miševa Kunming stari 6 do 8 tjedana nasumično su podijeljeni u 7 skupina (5 miševa po skupini). Subkutana injekcija (sc, 200, 400 mg/kg), intraperitonealna injekcija (ip, 200, 400 mg/kg) i intragastrična primjena (ig, 200, 400 mg/kg) primjenjivane su svaka 2 dana ukupno 7 puta , dok kontrolna skupina nije primila nikakav tretman. Miševi su vagani svaki drugi dan i status miševa je promatran svaki dan. Nakon tretmana CTPG-om, organi miševa su odvojeni i izvagani. Indeksi organa izračunati su prema formuli: indeks organa=težina organa (mg)/tjelesna težina (g). Splenociti su sakupljeni, izbrojani i obojeni s anti-CD3-APC, anti-CD19-PE, anti-CD49b FITC ili anti-CD4-APC, anti-CD{{ 22}}PE, anti-CD8-FITC (BD Biosciences). Uzorci su detektirani protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Antitumorska učinkovitost CTPG-a u kombinaciji s cisplatinom u miševa s tumorom H22 Muškim BALB/c miševima starim oko 6 do 8 tjedana supkutano su ubrizgane H22 stanice (1.0 × 106 po mišu u 100 µL PBS). Kada je volumen tumora dosegao približno 60 mm3, miševi s tumorom nasumično su podijeljeni u 4 skupine (6 miševa po skupini) i tretirani cisplatinom (4 mg/kg), CTPG (400 mg/kg), cisplatinom (4 mg/kg) plus CTPG ( 400 mg/kg), odnosno bez liječenja (kontrolna skupina). Tumorskim miševima intraperitonealno je ubrizgan CTPG 5., 7., 9., 11. odnosno 13. dana. Cisplatin je intravenozno injiciran 7. i 11. dana. Volumen tumora i tjelesna težina mjereni su svaki drugi dan. Volumen tumora izračunat je na sljedeći način: Volumen tumora (V)=a × b2/2, u kojem a i b predstavljaju najdulji i najkraći promjer tumora izmjeren pomičnom čeljusti. Dvadesetog dana, organi i tumori su izolirani i izvagani. Splenociti su sakupljeni, izbrojani i obojeni s anti-CD3-APC i anti-CD19-PE ili anti-CD4-FITC i anti-CD8-APC ili anti-CD11b-PE i anti-Gr{42}}APC ili anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC i anti-Foxp3-PE (BD Biosciences) . Nakon toga, učestalost i broj stanica analizirani su protočnom citometrijom (BD FACSCalibur).
Cistanche pojačava antitumorsko djelovanje i jača imunitet.
Za više informacija kliknite na sliku.
Statistička analiza
Svi podaci su izraženi kao srednja vrijednost±standardna pogreška srednje vrijednosti (SEM). Statistička analiza provedena je pomoću jednosmjerne/dvosmjerne analize varijance (ANOVA) pomoću softvera Prism5.0. P<.05 was="" considered="" statistically="">
