Dio 1: Karbamilirani sortilin povezan s kardiovaskularnom kalcifikacijom u bolesnika s kroničnom bolešću bubrega

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Dio 1: Karbamilirani sortilin povezan s kardiovaskularnom kalcifikacijom u bolesnika s kroničnom bolešću bubrega

Ključne riječi: kronična bolest bubrega, kardiovaskularni, bubrežni

Prijevodna izjava

Bolesnici skronična bolest bubregavrlo su osjetljivi na razvojkardio-vaskularnibolest.Kronična bolest bubrega-specifičnokardio-vaskularničimbenici rizika do sada su uglavnom nepoznati. Pokazali smo da je cirkulirajući sortilin post-translacijsko modificiran karbamilacijom u pacijenata sa smanjenimbubregfunkcija. Karbamilacija sortilina dovodi do većeg afiniteta vezanja za interleukin-6 i potiče arterijsku kalcifikaciju ex vivo. Štoviše, karbamilirani sortilin je faktor rizika za prisutnost i progresiju kalcifikacije koronarne arterije. Naši rezultati ukazuju na karbamilirani sortilin kao potencijalni terapeutski cilj za ometanjekardio-vaskularnikalcifikaciju u bolesnika skronična bolest bubrega.

Uvod

Sortilin, unutarstanični receptor za razvrstavanje, identificiran je kao akardio-vaskularnifaktor rizika u općoj populaciji. Bolesnici skroničnibubregbolestvrlo su osjetljivi na razvoj kardiovaskularnih komplikacija kao što je kalcifikacija. Međutim, specifičnakroničnibubregbolest-inducirane posttranslacijske proteinske modifikacije sortilina i njihova veza skardio-vaskularnikalcifikacije ostaju nepoznate. Kako bismo to istražili, ispitali smo dva neovisnakroničnibubregbolestkohorte za karbamilaciju cirkulirajućeg sortilina i otkriveni povećani ostaci lizina karbamiliranog sortilina u izvanstaničnoj domeni sortilina sbubregopadanje funkcije pomoću ciljane masene spektrometrije. Analiza strukture predvidjela je promijenjeno vezanje liganda karbamiliranim sortilinom, što je potvrđeno studijama vezanja pomoću mjerenja rezonancije površinskog plazmona, pokazujući povećani afinitet interleukina 6 prema in vitro karbamiliranom sortilinu. Nadalje, karbamilirani sortilin povećao je vaskularnu kalcifikaciju in vitro i ex vivo koju je ubrzao interleukin 6. Oslikavanje masenom spektrometrijom ljudskih kalcificiranih arterija otkrilo je in situ karbamilirani sortilin. U bolesnika skroničnibubregbolest, karbamilacija sortilina bila je povezana s kalcifikacijom koronarne arterije, neovisno o dobi ibubregfunkcija. Štoviše, pacijenti s karbamiliranim sortilinom pokazali su znatno bržu progresiju kalcifikacije koronarne arterije od pacijenata bez karbamilacije sortilina. Stoga karbamilirani sortilin može biti faktor rizika zakardio-vaskularnikalcifikaciju i može pridonijeti povišenomkardio-vaskularnikomplikacije kod bolesnika skroničnibubregbolest.

Cistanchemože izbjećikroničnibubregbolest.

Otprilike 1 od 10 ljudi diljem svijeta iskusikroničnibubregbolest.1 Oštećenbubregfunkcija je glavni neovisni faktor rizika zakardio-vaskularnimorbiditet i mortalitet i mortalitet iz svih uzroka.1,2 Zapravo, pacijenti skroničnibubregbolestimaju mnogo veću vjerojatnost da će umrijeti odkardio-vaskularnidogađaja nego razviti završni stadij bubrežne Q14 bolesti koja zahtijeva dijalizu.3 Prekomjerno taloženje kalcijumskih minerala unutar vaskularnog tkiva uočeno ukroničnibubregbolestpacijenata pridonosi uglavnom povećanomkardio-vaskularnirizik.4kroničnibubregbolestolakšava post-translacijsku modifikaciju (PTM) proteina.5 PTM-ovi su pak povezani skardio-vaskularnikalcifikaciju,6 što sugerira da bolje razumijevanje PTM-a ukroničnibubregbolest-inducirani procesi kalcifikacije mogli bi otkriti nove terapijske ciljeve. Međutim, dosad specifičnakroničnibubregbolest-povezane modifikacije proteina povezane skardio-vaskularnikalcifikacija je nepoznata.

Sortilin je posvuda eksprimirani član vakuolarne obitelji proteina za razvrstavanje 10 unutarstaničnih receptora za razvrstavanje.7 To je jednoprolazni transmembranski protein tipa I s različitim ulogama u razvrstavanju proteina, prometu i staničnoj signalizaciji. Kao receptor endocitoze, sortilin može potaknuti internalizaciju liganada sa površine stanice putem endocitoze i sortirati ligande između unutarstaničnih odjeljaka, kao što su trans-Golgijeva mreža, endosom, lizosom i sekretorni put.8 Pretklinički in vivo dokazi upućuju na važnu ulogu sortilin u patogenezi vaskularnih i metaboličkih poremećaja kroz doprinose upali i kalcifikaciji arterijske stijenke, nereguliranom metabolizmu lipoproteina i dijabetes melitusu tipa 2, svekardio-vaskularnirisk factors.7 In human vascular smooth muscle cells (hSMCs), intracellular sortilin regulates the loading of the procalcific protein tissue nonspecific alkaline phosphatase (TNAP) into extracellular vesicles, thereby conferring the calcification potential that contributes to microcalcification formation.9 The ectodomain of plasma membrane-bound sortilin can be shed and secreted into the circulation.7 In a community-dwelling cohort of men aged >50 godina, izvijestili smo o povezanosti visokih razina sortilina u serumu s kalcifikacijom aorte ikardio-vaskularnidogađaja, što sugerira sortilin kaokardio-vaskularnifaktor rizika u općoj populaciji.10 A role of sortilin inkroničnibubregbolest, populacija pacijenata s izraženim porastomkardio-vaskularnikalcifikaciju, nastavlja prkositi razjašnjavanju. Većina studija usmjerena je na funkciju staničnog sortilina, a ne na istraživanje biološke funkcije cirkulirajućeg topljivog oblika.7 Stoga, postizanje boljeg razumijevanja mehaničkog odnosa između cirkulirajućeg sortilina i regulatornog utjecaja PTM-a ukroničnibubregbolestproširit će znanje o sortilinu ukardio-vaskularnikalcifikacija.

Ova studija preispituje hipotezu da je PTM cirkulirajućeg sortilina uključen u razvojkardio-vaskularnikalcifikaciju u bolesnika skroničnibubregbolest.

korist od Cistanche: liječi bolesti bubrega

METODE

Kardio-vaskularnii Renalni ishod ukroničnibubregbolest2–4 pacijenta–kohorta četvrte homburške evaluacije (CARE FOR HOMe)

Studija CARE FOR HOME prethodno je detaljno opisana.11 Podskupina od 97 pacijenata korištena je za analizu.

Dan-NICAD 1 kohorta

The study design of the Danish study of noninvasive testing in coronary artery disease (Dan-NICAD 1) trial has been described previously.12 For the analysis, we identified a subset of 97 enrolled patients with estimated glomerular filtration rate (eGFR) >60 ml/min i provedeno usklađivanje frekvencije na temelju dobi, spola, indeksa tjelesne mase, statusa pušenja, šećerne bolesti ikardio-vaskularnibolest. Identifikacija je provedena slijepo za razine sortilina.Kardio-vaskularniKohorta dubinske procjene (CARVIDA) CARVIDA je podstudija njemačkogKroničnoBubregBolest13 Korišteni su samo uzorci pacijenata s CARVIDA-om uključenih u ispitivanje u Aachenu, Njemačka (n=78). Kompjuterizirana tomografija izvedena je na CT skeneru s dva izvora (SOMATOM Definition Flash ili Force; Siemens), kao što je prethodno opisano.14 Uz medijan vremena praćenja od 4,4 godine, 41 od 78 pacijenata pristao je ili je bio dostupan za drugu kompjutorsku tomografiju skeniranje tijekom drugog posjeta CARVIDA-e u 2019/ Q15 2020.

Statistička analiza

Podaci eksperimentalne studije prikazani su kao srednja SD; n označava broj neovisnih eksperimenata ili broj pacijenata. Normalnost je ispitana pomoću Shapiro-Wilkovog testa, a heterogenost kvantilnog dijagrama i varijance testirana je pomoću Brown-Forsytheovog testa. Upareni ili neupareni 2-repni Studentov t-test s jednakim ili nejednakim varijancama proveden je za usporedbu 2 grupe. Za usporedbu između 3 tretirane skupine, 1- ili 2-way analiza varijance praćena Tukey post hoc provedena je za podatke s normalnom distribucijom i jednakom varijancom. Podaci s iskrivljenom distribucijom procijenjeni su Kruskal-Wallisovim testom praćenim Dunnovim post hoc testom. Podaci s nejednakim varijancama testirani su Welchovom analizom varijance nakon koje je slijedio Dunnettov T3 post hoc test.

U kliničkim studijama kontinuirani podaci prikazani su kao srednja SD kada su normalno raspodijeljeni ili kao medijan i interkvartilni raspon za varijable s iskrivljenom distribucijom. Podaci o kategorijama prikazani su u postocima. Pearson/Fisher c2 test korišten je za proučavanje povezanosti između kategoričkih varijabli i neuparenog Student t-testa ili Mann-Whitney U testa za kontinuirane varijable. Razlike između 3 skupine uspoređene su pomoću 1-analize varijance praćene Sidakovim post hoc testom. Srednje vrijednosti najmanjeg kvadrata prilagođene multivarijantnim brojevima karbamiliranih sortilinskih ostataka izračunate su korištenjem generaliziranih linearnih modela, kao što je prethodno opisano.

Volumen kalcifikacije koronarne arterije (CAC) je logaritamski transformiran (tj. prirodni logaritam, ln; ln[CAC plus 1]) kako bi se smanjila zakrivljenost. Bivarijatna korelacija procijenjena je pomoću Eta (1 nominalna varijabla i 1 metrička varijabla) ili Pearsonovih korelacijskih koeficijenata (ako su obje varijable bile metričke). Promjena volumena CAC-a po godini izračunata je na sljedeći način: [(praćenje CAC-a – početna vrijednost CAC-a) / vrijeme praćenja u mjesecima] * 12. Analiza varijance s promjenom volumena CAC-a kao ovisnom varijablom i terminom s fiksnim učinkom za karbamilaciju (da naspram ne) korišten je za analizu progresije CAC. Osim toga, ovaj je model prilagođen upotrebom analize kovarijance za kovarijable CAC na početnoj razini Q18 i varijable. P < 0.05="" smatra="" se="" statistički="" značajnim.="" statističke="" analize="" provedene="" su="" pomoću="" programa="" graphpad="" prism="" (prism="" software="" inc.,="" verzija="" 9)="" ili="" spss="" (verzija="">

Cistanchemože poboljšatibubregfunkcije ikroničnibubregbolest.

REZULTATI

Karbamilirani sortilin povećava sabubregopadanje funkcije

U početku smo procijenili razine sortilina u serumu u bolesnika skroničnibubregbolestiz studije CARE FOR HOMe11 i otkrili povećane razine sortilina u usporedbi s odgovarajućom kontrolnom skupinom s normalnimbubregfunkcija iz pokusa Dan-NICAD 1 (Tablica 1). Cirkulirajući proteini skloni su PTM-u u bolesnika skroničnibubregbolestQ20 .5 Stoga smo izvršili detaljno mapiranje PTM ostataka cirkulirajućeg sortilina kod sudionika studije CARE FOR HOMe i zdravih kontrolnih subjekata (dodatna tablica S1) koristeći MALDI-TOF/TOF MS. U usporedbi s kontrolnim subjektima,kroničnibubregbolestpacijenti su imali 8 od 30 rezidua lizina koji su bili pretežno karbamilirani u izvanstaničnoj domeni sortilina (dodatna tablica S3 Q21 i dopunska slika S1). Reprezentativni MS spektri kontrolnog subjekta i pacijenta skroničnibubregbolestilustrirani su na slikama 1a i b. Specifičnost signala potkrijepljena je spektrima MALDI-TOF/TOF-MS/MS (dodatna slika S2A). Kvantifikacija je otkrila akroničnibubregboleststadiju ovisan porast broja karbamiliranih ostataka (Slika 1c) i intenziteta karbamiliranih sortilinskih peptida (Slika 1d). Ostatak lizina 205 bio je jednako modificiran u svimakroničnibubregboleststadijima, dok su ostaci 95, 260 i 294 češće modificirani u naprednomkroničnibubregbolestfaze (slika 1e).

Zatim smo procijenili povezanost između karbamilacije sortilina i osnovnih karakteristika (dodatna tablica S2) u studiji CARE FOR HOME. Uočili smo povećanje karbamilacijskih ostataka sortilina ovisno o dobi (Tablica 2). Niža funkcija bubrega, na temelju eGFR-a na temelju serumskog cistatina c i kreatinina (eGFRcys-područje), te više razine uree i N-terminalnog pro-moždanog natriuretskog peptida (NT-proBNP) bile su povezane s višim reziduama karbamiliranog sortilina (Tablica 2). Povezanosti su ostale značajne nakon prilagodbe za dob i spol (Tablica 2).kroničnibubregbolestpacijenti pod lijekovima koji su bili antagonisti aldosterona Q22 pokazali su smanjenu karbamilaciju sortilina (tablica 2), dok nije bilo razlike u eGFRcys-području (ne, 50.6 23.2 ml/min po 1,73 m2; da, 43.{{10}}.9 ml/min po 1,73 m2; P=0,236) i urea (ne, 68.6 40.1 mg/dl; da, 72.{{21 }}.9 mg/dl; P=0,729) između pacijenata sa ili bez antagonista aldosterona. Osim uree, mijeloperoksidaza može posredovati u karbamilaciji proteinakardio-vaskularnibolesti.19 Međutim, nismo pronašli povezanost između ukupnih razina i aktivnosti mijeloperoksidaze i karbamilacije sortilina (dopunske slike S3A i B).

liječenje bolesti bubrega:Cistanche

Nadalje, procijenili smo prisutnost karbamiliranog sortilina u ljudskim femoralnim arterijama korištenjem MS snimanja. Karbamilirani peptid SEDYGK*NFK* (m/z 1172) bio je visoko prisutan u kalcificiranim femoralnim arterijama odkroničnibubregbolestbolesnika i odsutan u nekalcificiranim femoralnim arterijama (Slika 1f). MS/MS spektri podržavaju identifikaciju SEDYGK*NFK* (dodatna slika S2B). SEDYGK*NFK* se nalazi u blizini kalcificiranih područja u tunici mediji (Slika 1g). Nasuprot tome, intenzitet masenog signala ne-post-translacijsko modificiranog peptida SEDYGKNFK (m/z 1086) bio je veći u kontrolnim arterijama (Slika 1f).

Uzeti zajedno, u usporedbi s kontrolama s normalnimbubregfunkcija, pacijenti sakroničnibubregbolestimaju više razine sortilina u serumu i pokazuju posttranslacijski karbamilirani sortilin u cirkulaciji, koji se također može otkriti u vaskulaturi.

Karbamilirani sortilin potiče kalcifikaciju glatkih mišićnih stanica S obzirom na naše otkriće da je karbamilirani sortilin lokaliziran na kalcificiranim područjima, zatim smo procijenili učinak karbamilacije sortilina na vaskularnu kalcifikaciju in vitro i ex vivo. Kako bismo odredili funkcionalnu važnost karbamilacije sortilina, inducirali smo in vitro karbamilaciju rekombinantnog sortilina (SortCarb) ureom i detektirali sličan uzorak ostataka karbamil-lizina kao što je otkriven kod ljudi in vivo (dodatna slika S4A i dopunska tablica S4). In vitro, karbamilacija nije promijenila integritet proteina SortCarba u usporedbi s kontrolnom lažnom modifikacijom (SortCo), kako je procijenjeno gel elektroforezom i Western blotom (dodatna slika S4B i C). Ni SortCo ni SortCarb nisu pokazali citotoksične učinke na hSMC (dodatna slika S5A). SortCo i SortCarb podjednako su preuzeli hSMC (dodatna slika S5B). U kalcificiranju hSMC-a, SortCarb je inducirao proosteogene transkripte ALPL (þ56 posto; P=0.039) i RUNX2 Q23 (þ25 posto; P=0.014; Slika 2a i b ), kao i aktivnost tkivne nespecifične alkalne fosfataze (þ46 posto; P=0,007; Slika 2c), u usporedbi sa SortCo. Na funkcionalnoj razini, SortCarb je značajno povećao kalcifikaciju matriksa (Slika 2d i e). Konačno, u ex vivo modelu kulture organa, SortCarb je povećao kalcifikaciju u aortnim prstenovima štakora (Slika 2f i g).

korist od Cistanche: liječi bolesti bubrega

Za nastavak klikniteovdjeza 2. dio.