Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls kliknite ovdje do 2. dijela

I-Fang Wang,1,2 Yihan Wang,2 Yi-Hua Yang,1,3,4 Guo-Jen Huang,5,6 Kuen-Jer Tsai,3,4,* i Che-Kun James Shen1,2,7,*

1. Diplomski institut za neuronsku regenerativnu medicinu, Visoka škola medicinskih znanosti i tehnologija, Medicinsko sveučilište Taipei, Taipei 11031, Tajvan

2Institute molekularne biologije, Akademska zajednica Sinica, Taipei 11529, Tajvan

3Institute of Clinical Medicine, Medicinski fakultet, Nacionalno sveučilište Cheng Kung, Tainan 70403, Tajvan

4Research Centar za kliničku medicinu, Nacionalna sveučilišna bolnica Cheng Kung, Medicinski fakultet, Nacionalno sveučilište Cheng Kung, Tainan 70403, Tajvan

5Department i Diplomski institut za biomedicinske znanosti, Medicinski fakultet, Sveučilište Chang Gung, Taoyuan 33302, Tajvan

6 Istraživački centar za pogoršanje, Memorijalna bolnica Chang Gung, Linkou 33302, Tajvan

7Lead kontakt

*Korespondencija: kjtsai@mail.ncku.edu.tw (K.-J.T.), ckshen@tmu.edu.tw (C.-K.J.S.)

https://doi.org/10.1016/j.celrep.2021.109477

Cistanche može poboljšati pamćenje

SAŽETAK

Fenotipska varijacija temeljni je preduvjet za evoluciju stanica i organizama prirodnom selekcijom. Dok je uloga ekspresije stohastičkih gena u fenotipskoj raznolikosti genetski identičnih stanica dobro proučena, nije mnogo poznato u odnosu između ekspresije stohastičkih gena i pojedinačnih varijacija u ponašanju kod životinja. Pokazujemo da je specifična miRNA (miR-466f-3p) upregulirana u hipokampusu dijela pojedinačnih inbred miševa na zadatku Morrisovog vodenog labirinta. Značajno je da miR- 466f-3p pozitivno regulira morfologiju neurona, funkciju i prostorno učenje, imemorijasposobnost miševa. Mehanistički, miR-466f-3p potiskuje prijevod MEF2A, negativnog regulatora učenja /memorija. Konačno, pokazujemo da je raznolika upregulacija hipokampalnog miR-466f-3p rezultat randomizirane fosforilacije hipokampalne cikličke AMP (cAMP) -vezanje elementa odgovora (CREB) u pojedinaca. Ovaj nalaz modulacije prostornog učenja imemorijaputem randomizirane hippokampalne signalne osi nakon neuronske stimulacije predstavlja demonstraciju kako varijacije u ekspresiji gena tkiva dovode do različitog ponašanja životinja.

UVOD

Fenotipska varijacija među pojedincima daje evolucijsku prednost jer pruža populacijskoj raznolikosti na kojoj djeluje prirodna selekcija (Pavlicev i sur., 2011). Genetska pozadina i okolišni čimbenici doprinose stvaranju takvih prirodnih varijacija (Bendesky i Bargmann, 2011). Eksperimentalno, urođeni miševi često se koriste za proučavanje molekularne i stanične osnove prosječnih fenotipova i ponašanja kako bi se smanjili učinci genetskih razlika među testiranim osobama (Casellas, 2011). Međutim, između pojedinih izogenih miševa prikazana je varijacija obilja transkripta tkiva. Geni koji pokazuju vrlo promjenjive razine ekspresije često su povezani s imunološkom funkcijom, odgovorima na stres i hormonskom regulacijom, tj. procesima osjetljivim na znakove okoliša (Vedell i sur., 2011). Neke od tih studija također su pokazale da razlike u ekspresiji gena ili staničnoj signalizaciji, sa ili bez utjecaja okolišnih čimbenika kao što su lizanje majke, pružanje hranjivih tvari u maternici ili otpornost izazvana stresom u odnosu na osjetljivost (Bale, 2015; Danchin i dr., 2011; Lorsch

et al., 2019; Pedersen i sur., 2011), može dovesti do razlika u fenotipovima i ponašanjima (Casellas, 2011; Locke et al., 2015; Loos et al., 2015; Oey et al., 2015).

Prostorno učenje imemorijaformacija koju kontrolira mozak može se odvojiti u dva sustava: (1) egocentrična navigacija koja koristi samo-kretanje i unutarnje znakove i (2) alocentričnu navigaciju prvenstveno uključujući hipokampus i obližnje moždane strukture koje se stimuliraju distalnim znakovima izvan organizama (Ekstrom i sur., 2014). Sposobnost prostornog učenja imemorijaomogućuje većini životinjskih vrsta da postupno prilagode svoje ponašanje kako bi se prilagodile u prostorno i vremenski promjenjivim okruženjima, što je ključno za njihov opstanak. To se može procijeniti kod laboratorijskih životinja primjenom paradigmi ponašanja kao što je Morris vodeni labirint (MWM) (Vorhees i Williams, 2014). Značajno je da genetski identični urođeni glodavci pokazuju fenotipske varijacije u prostornom učenju imemorija(Tsai et al., 2002), ali temeljni mehanizmi ove varijacije ponašanja ostali su nepoznati.

Formiranje novih sjećanja složen je proces koji zahtijeva prepisivanje ovisno o aktivnostima, novu sintezu proteina i

Slika 1. Korelacija između varijacije prostornog učenja imemorijasposobnost i indukcija miR-466f-3p

(A) MWM zadatak miševa C57BL/6J divljeg tipa. Lijeva ploča: MWM izvedbe GLN miševa (točkica) i PLN miševa (kvadrata). Od ukupno 289 testiranih miševa, 180 je testirano, 180 jecategorizedasGLNand109asPLN.Rightpanel:probetestoftheMWMtask(n=47and30ineachgroup). Meandurationsspentineachofthefourquadrants i regija platforme uspoređuju se u histogramu. P, mjesto nestale platforme; T, ciljna zona bez P; R, desna zona; O, suprotna zona; L, lijeva zona. (B) RT-qPCR analiza miRNA izraza. Relativne razine ekspresije od šest miRNA smještenih unutar klastera miR-466-669 i miR-132-3p, kao pozitivne kontrole bogate mozgom, analizirane su i normalizirane unutarnjom kontrolom U6 snRNA iz GLN i PLN mišjeg hipokampusa (n = 9–18 po skupini). Ja, miR-466f- 3p; II, miR-466g; III, miR-466i-3p; IV, miR-467b-3p; V, miR-467f; VI, miR-669f; VII, miR-132-3p.

fino podešeno specifično neuronsko umrežavanje kaomemorijaengrami za stvaranje novih neuronskih veza i trajne plastičnosti (Asok i sur., 2019). Hipokampalni engrami, koji su rijetke populacije neurona u dentate gyrusu (DG), predstavljaju ansamble neurona koji pokazuju povećanu aktivnost nakonmemorijaformacija. Dok DG engram neuroni pokazuju vrlo različit uzorak ekspresije gena (Rao-Ruiz i sur., 2019), molekularni mehanizmi specifični za engram na kojima se temeljimemorijakonsolidacija je i dalje uglavnom nepoznata. Poznato je da različiti čimbenici i signalni putovi pozitivno ili negativno reguliraju učenje imemorijaidentificirani su procesi (Abraham i sur., 2019.; Humeau i Choquet, 2019.). Među njima, aktivirani oblik proteina koji veže ciklički AMP (cAMP) -odgovor na element (CREB) potiče transkripciju gena kao odgovor na in-nabore unutarstaničnog Ca2+ ovisnog o aktivnostima u neuronima (Kandel, 2012). S druge strane, transkripcijska aktivnost kampa/PKApathwayrepressesmyocyteenhancer faktora 2 (MEF2) sprečavanjem nuklearnog izvoza njegove supresora HDAC5 i nuklearnog uvoza koaktivatorskog NFAT-a (Belfield i sur., 2006.). Nadalje, za razliku od CREB-a, ograničene aktivnosti MEF2Amemorijaformacija (Cole et al., 2012). Osim proteinskih čimbenika, mikroRNA (miRNA) su također uključene u reguliranje neuronskih funkcija, uključujući učenje i pamćenje (McNeill i Van Vactor, 2012). miRNA su mali (22 nt)nekodirajućiRNAsthatprimarilyaspost-transkripcijski regulatori ekspresije gena putem osnovnog uparivanja specifičnog za slijed s njihovim mjestima prepoznavanja u 30 neprevedenih regija (30 UTR) određenih mRNA (Daugaard i Hansen, 2017). miRNA-e sudjeluju u nizu signalnih putova u post-mitotičkim neuronima i posreduju stanične procese ovisne o aktivnostima, uključujući dendritični rast i grananje, stvaranje sinapse i sazrijevanje. Reguliranjem ekspresije gena, oni također igraju važnu ulogu u dugotrajnim oblicima sinaptičke plastičnosti koji su temeljmemorijaformiranje, dohvaćanje i konsolidacija (Chen i Shen, 2013.; Wang et al., 2012b).

U nastavku predstavljamo dokaze o uzročnoj vezi između ekspresije gena stohastičkog tkiva i pojedinačnih varijacija ponašanja kod životinja. Konkretno, pokazujemo da stohastička aktivacija hipokampalne OSI CREB-pCREB / miR- 466f-3p-MEF2A modulira individualnu varijaciju prostornog učenja imemorijasposobnost kod urođenih miševa.

REZULTATI

Individualna varijacija prostornog učenja imemorijasposobnost je u korelaciji s indukcijom miR-466f-3p iz određenog miRNA klastera

Identificirati miRNA-e uključene u regulaciju učenja imemorijaformacija, koristili smo MWM zadatak za razlikovanje urođenih miševa C57BL / 6J divljeg tipa s dobrim ili lošim mogućnostima učenja i pamćenja (slika 1A). Miševe koji su dovršili zadatak unutar 30 s u posljednjoj (6. sesiji) definirali smo kao ""dobre učenike" (GLN), dok su se miševi koji nisu mogli pronaći platformu unutar 30 s u posljednjoj sesiji smatrali "siromašnim učenicima" (PLN). Kao što je prikazano na slici 1A (lijeva ploča), 62% miševa pripadalo je skupini GLN (180 od 289 miševa), što pokazuje značajno smanjenje latencije bijega s 98,1 s (1. sesija) na 21,8 s (6. sesija). Nasuprot tome, latencija bijega preostalih 38% miševa, PLN skupine (109 od 289 miševa), bila je samo umjereno smanjena između prve i šeste sesije (sa 111,8 s u 1. na 82,1 s u 6. sesiji). Test sonde, koji ukazuje na to da su miševi doista naučili zadatak tijekom šest sesija, također je pokazao da su GLN miševi ostali duže u regiji platforme od PLN miševa (slika 1A, lijevi par šipki na desnoj ploči).

Zatim smo analizirali RNA iz hipokampusa GLN i PLN miševa hibridizacijom mikroarray miRNA (n = 4 svake skupine). Općenito, uočene su relativno manje razlike u profilima izraza hipokampalnih miRNA od GLN i PLN miševa. Međutim, Sud je utvrdio da je prvih 10 miRNA za koje su razine ekspresije bile veće kod GLN miševa od PLN miševa (podaci nisu prikazani) izvedeno iz istog klastera miRNA specifičnog za glodavce, miR-466-669, koji se nalazi u intronu 10 gena mSfmbt2 (vidi dolje). Na temelju analize lančane reakcije reverzne transkripcije i kvantitativne polimeraze (RT-qPCR) razine ekspresije odabranih miRNA u klasteru, za daljnja istraživanja (slika 1B) odabrali smo miR-466f-3p. Prosječan izraz ove miRNA bio je 1,5 puta veći u hipokampusu GLN miševa u odnosu na PLN miševe. Značajno je da su prosječne razine hipokampalnog miR-466f-3p bile slične među PLN skupinom, kontrolnom skupinom kućnog kaveza (HC) i kontrolnom skupinom za plivanje (slika 1C), čime su isključeni učinci povezani s vježbanjem tijekom plivanja i dodatno podupirući ideju da je miR-466f-3p induciran tijekom prostornog učenja imemorijaformacija.

Na slici 1C podaci otkrivaju da su razine ekspresije hipokampalnog miR-466f-3p od preko 42% GLN miševa bile najmanje 1,5 puta više od prosječne razine ekspresije miševa za kontrolu HC-a, dok su razine na 15% PLN miševa bile upola manje od razine HC miševa. Otprilike 25% GLN miševa i 55% PLN miševa imalo je slične razine miR-466f-3p (0,8 do 1,2 puta u odnosu na HC). Pearson korelacijski raspršivač koji pokazuje pozitivnu korelaciju između razina miR-466f-3p i postotnog trajanja na platformi tijekom ispitivanja sonde prikazan je na slici 1D. Također smo izveli miR-466f-3p i U6 malu nuklearnu RNA (snRNA) in situ hibridizaciju (ISH) moždanih kriški na GLN i PLN miševima (slika 1E). Statistička analiza signala miR-466f-3p putem ISH-a potvrdila je da je indukcija miR-466f-3p doista veća u GUP-u GLN miševa u odnosu na onu GLN miševa

PLN miševi, dok nije pronađena razlika kada su uspoređeni signali U6 snRNA (desni histogram, slika 1E). Iako signali miR-466-3p nisu bili jednaki među pojedinačnim stanicama granula u DG-u, ipak su se značajno i sveprisutno povećali u hipokampusu GLN miševa u usporedbi s PLN miševima. Tamo se indukcija miR-466f-3p nije dogodila samo u malom dijelu stanica, npr. Engram neuronima. Ovi podaci ukazuju na to da je upregulacija miR-466f-3p tijekom MWM zadatka usko povezana s boljim prostornim učenjem imemorijasposobnost među značajnim udjelom GLN miševa.

Također smo analizirali prosječne razine ekspresije nekoliko miRNA specifičnih za mozak od strane RT-qPCR-a. Među njima, miR-132-3p je upreguliran u mišjem hipokampusu nakon MWM zadatka, ali nismo primijetili značajne razlike između GLN i PLN skupina (bar par VII, slika 1B). Razine ekspresije miR-335-5p i miR-22 bile su slične među skupinama GLN, PLN i HC (slika S1A). Dakle, za razliku od miR-466f-3p, hipokampalni izraz ovih miRNA tijekom MWM treninga nije u korelaciji s prostornim učenjem imemorijasposobnost miševa.

miR-466f-3p upregulacija potiče neuritni izdanak i stvaranje dendritske kralježnice

Kako bismo potvrdili da je miR-466f-3p doista izražen u neuronima, proveli smo miRNA ISH u kombinaciji s imunofluorescencijom (IF) bojenjem NeuN-a i MAP2 u primarnim hipokampalnim neuronima. Rezultati su pokazali da je slično drugim miRNA (Cohen i sur., 2011; Thomas et al., 2017), miR-466f-3p uglavnom je izražen u neuronskoj regiji some, s nekim dodatnim signalima u dendritima (slika S2A). Razumjeti molekularnu i staničnu osnovu povezanosti upreguliranog miR-466f-3p s učenjem imemorijaformacija, prvo smo prolazno prenapresirani miR-466f-3p zajedno s dsRed fuzijskim polipeptidom pod kontrolom promotora ubikvitina iz pFUGW-miR-466f-3p-dsRed plazmida u DIV10 primarne hipokampalne neurone (slika S2B). Kroz miRNA ISH potvrdili smo da je signal miR-466f-3p jači u skupini preekspresije miR-466f-3p u odnosu na vektorsku kontrolu ili mutantsku miR-466f-3p skupinu (strelice, slika S2B). Paralelno s tim, uspostavili smo i platformu za ispitivanje učinka miR-466f-3p gubitka funkcije inhibicijom miR-466f-3p pomoću miR-spužve smještene u 30 UTR EGFP mRNA izražen iz pFUGW-miR-spužve- EGFP plazmida (slika S2C). Izvjestitelj EGFP-a u spužvastom plazmidu služio je i kao pokazatelj učinkovitosti transfekcije i kao senzor stanične miRNA aktivnosti (Kluiver i sur., 2012). U značajnom dijelu transfektiranih HEK293T stanica, EGFP signal se smanjio nakon suizražavanja s divljim miR-466f-3p, ali ne s mutantnim miR-466f-3p, zbog inhibicije EGFP mRNA prijevoda vezanjem miR-466f-3p na miR- spužvu u 30 UTR (usporedite lijeve četiri slike i dva njegova programa, Slika S2C). Nasuprot tome, nismo primijetili smanjeni EGFP signal nakon suizražavanja upravljačke spužve koja kodira osam primjeraka kodirane sekvence iz pFUGW-SCR-spužve-EGFP plazmida s miR-466f-3p ili njegovim mutantom (usporedite desne četiri slike i dva histograma).

Kao što je prikazano na slici 2A, ektopična ekspresija miR-466f-3p ponovno je rezultirala morfološkim promjenama neurona, ponajviše poboljšanim izrastanjem neurita u odnosu na kontrolne neurone transfektirane s dsRed-ekspresnim vektorom pFUGW-dsRed ili mutantskim miR-466f-3p-ekspresnim plazmidom pFUGW-mut-miR-466f-3p-dsRed. Podaci o kvantifikaciji pokazali su da se prosječni broj dendritske grane po neuronu ne razlikuje značajno između miR-466f-3p-overexpressing skupine (traka II) i vektorske ili mutantske kontrole (šipke I i III) (desni gornji histogram, slika 2A). Međutim, srednja ukupna duljina dendrita i srednja duljina primarnih dendrita povećali su se nakon prekomjerne ekspresije miR-466f-3p (usporedite traku II s trakama I i III, desno donjim histogramom slike 2A). Paralelno smo inhibirali endogeni miR-466f-3p pomoću miR-spužve. Kao što je vidljivo, nije bilo značajne razlike u broju dendritske grane između miR-466f-3p-inhibicija i kontrolnih skupina (usporedite traku IV s šipkama I i V, desni gornji histo-gram, slika 2A), ali miR-466f-3p-inhibicija skupine pokazala je značajno smanjenje srednje ukupne duljine dendrita, kao i srednje duljine primarnih i sekundarnih dendrita u odnosu na druge skupine (usporedite traku IV s šipkama I i V, desni donji histogram slike 2A). Nadalje, IF bojenje pokazalo je da je preekspresija miR- 466f-3p, ali ne i inhibicija, također povećala gustoću dendritskih bodlji (slika 2B, gornje ploče i donji lijevi histogram). Također smo izvršili ko-bojenje za protein postsinaptičke gustoće 95 (PSD-95) i izbrojali gustoću kolokaliziranih dendritskih bodlji kako bismo utvrdili točan broj ekscitatornih sinapsi (slika 2B, donji desni histogram), što je otkrilo da je prekomjerna ekspresija miR-466f-3p povećala gustoću psd-95 pozitivnih bodlji u usporedbi s drugim kontrolnim skupinama. Kako- ikad, inhibicija miR-466f-3p nije značajno promijenila gustoću PSD-95 pozitivnih bodlji u odnosu na gustoću kontrolnih skupina (slika 2B, donji desni histogram). Zajedno, ovi podaci ukazuju na to da u nedostatku neuronske stimulacije, sama inhibicija miR-466f-3p ne utječe na gustoću ekscitatornih sinapsi ili ukupnih dendritskih bodlji.