Brojni terapeutski spojevi izolirani su iz prirodno bogatih organskih izvora

Molimo kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Brojni terapeutski spojevi izolirani su iz prirodno bogatih organskih izvora, koji mogu ponuditi ekonomične i održive izvore spojeva sa sigurnim i učinkovitim biološkim djelovanjem. U kozmetičkoj industriji željno se traže prirodni spojevi koji djeluju protiv starenja. Stoga smo pripremili različite ekstrakte iz lišća Rubusfraxinifolius i upotrijebili testove inhibicije enzima kako bismo izolirali spojeve sa zaštitnim učincima protiv starenja kože. Iz Rubus fraxinifolius Poir izolirana su dva triterpenoida. ostavlja. Strukture su karakterizirane spektroskopskim analizama (LC-ESI-MS,1D/2D NMR) i usporedbom s prijavljenim podacima. Spoj 1 i 2 određeni su kao 2,3-O-etilen glikol,19-hidroksiurs-12-en-23,28-dioična kiselina i 2,{{15} }O-propandiol,19-hidroksiurs-12-en-28-oična kiselina. Ekstrakt metanola i izolati procijenjeni su na inhibicijski učinak na elastazu i tirozinazu. Spojevi 1 i 2 inhibirali su elastazu s ICso 122,199 ug/mL i 98,22 ug/mL, a također su inhibirali tirozinazu s ICso 207,79 ug/army odnosno 221,51 ug/mL. Molekularno spajanje pokazalo je da oba spoja imaju afinitete prema enzimima.

KSL09

Kliknite ovdje da saznate više

Iako ih je teško postići, prirodne tvari protiv starenja koje su sigurne za ljude mogu se ekonomično i održivo prikupiti iz bogatih prirodnih resursa. Oko 700 vrsta Rubus (Rosaceae) rasprostranjeno je diljem svijeta, iako se nekoliko vrsta nalazi u tropima. Ovaj rod sadrži hranjive tvari (šećer, vitamine itd.), sekundarne metabolite (triterpenoide, flavonoide, polifenole itd.) i ima mnoga svojstva protiv starenja (antioksidans, ant elastaza, ant tirozinaza, anti-kolagenaza, anti-UV, protuupalno, zacjeljivanje rana itd.)1. Osim toga, vrste Rubus također su izvijestile da sadrže različite triterpene s različitim biološkim aktivnostima -'.

U Indoneziji, R. fraxinifolius Poir. (Rosaceae) rasprostranjen je na Javi, Borneu itd., a popularno poznat kao 'urbani'.što je cistancheŠtoviše, neki lokalni poljoprivrednici beru te biljke, a bobičasto voće obično se konzumira ili svježe ili smrznuto. Naša prethodna studija pokazala je da ekstrakt stabljike R. frascinifolius ima aktivnost inhibicije elastaze, tirozinaze i kao antioksidans8. Neka druga istraživanja također su pokazala da list i plod R. fraxinifolius imaju snažno antioksidativno djelovanje? 10. Međutim, istraživanje R. fraxinifolius je malo istraženo, a nisu objavljena nikakva istraživanja kemijskih komponenti.

KSL10

Cistanche može spriječiti starenje

Elastase je enzim serin proteaze, koji ima ključnu ulogu u boranju ili opuštanju kože kroz razgradnju dermalnih elastičnih vlakana (elastina) i uzrokuje gubitak elastičnosti kože. Jedan od njih je elastaza dobivena iz fibroblasta kože. Stoga, kao moderatori razgradnje elastinskih vlakana koja uzrokuju starenje kože, inhibitori elastaze su privukli pozornost kao sredstva za kozmetičke pripravke,12. Melanogeneza je posredovana tirozinazom i regulira biosintezu melanina kroz reakciju u dva stupnja. U početnom koraku, L-tirozin se hidroksilira u L-3,4-dihidroksifenilalanin (L-DOPA). U drugom koraku, L-DOPA se oksidira u odgovarajući O-kinon. Stoga se prirodni spojevi s inhibicijskim djelovanjem na tirozinazu obično koriste u kozmetici koji inhibiraju hiperpigmentaciju melaninom i stoga pogoduju izbjeljivanju kože.Cistanche protiv starenjaInhibitori enzima elastaze i tirozinaze mogli bi se razviti kao sredstva za izbjeljivanje kože, sprječavanje starenja ili bora za liječenje dermatoloških poremećaja44.

Ova studija izolirala je ursanske triterpenoide iz listova R.fraxinifolius i razjasnila njihove strukture u spektroskopskim analizama pomoću elektrosprej ionizacijske masene spektroskopije (ESI-MS) i 'H NMR, |3CNMR i 2D NMR (DEPT, HSQC, HMQC i HMBC). Zatim smo proveli testove inhibitornih aktivnosti elastaze i tirozinaze sirovih ekstrakata, frakcija i izoliranih spojeva.

U ovom istraživanju djelovanje dvaju odabranih spojeva promatrano je i in silico metodom. Pristup molekularnog spajanja proveden je s DockThorl516. Makromolekule korištene u ovom istraživanju dobivene su iz banke podataka o proteinima (RCSB PDB, 2000.) s identitetima 2y9x i 3hgp za tirozinazu i elastazu, odnosno 1718. Makromolekule su optimizirane u UCSF Chimera i rezultatima molekularnog spajanja primijećeni su s PyMOL1920.

Rezultati i rasprava

The ethyl acetate and methanolic extracts of R. fraxinifolius leaves showed potential as elastase inhibitors with percent inhibitory>40 posto u 100 ug/mL, dok ekstrakt n-heksana nije imao nikakvu aktivnost (slika 1). Neki Rubus također su pokazali aktivnost inhibicije elastaze kao R. Sanctus（ postotak inhibicije 14.68-49.20 u 100 ug/mL）, R.compactus,R. robustus i dr.221. Stoga smo frakcionirali aktivne ekstrakte pomoću vakuumske tekućinske kromatografije/VLC i sakupili ll frakcija iz svakog. Frakcije iz ekstrakta etilnog acetata pokazale su slabu aktivnost inhibicije elastaze (<20% in="" 100="" ug/ml),but="" some="" methanol="" fractions="" showed="" potential="" activity="" in="" these="" assays.="" we="" choose="" metha-nol="" fraction="" 8(m8)for="" further="" isolation="" because="" it="" hadthe="" largest="" yield(57%)="" and="" also="" have="" elastase="" inhibitory="" activity(44.82%).m8="" was="" further="" partitioned="" and="" purified="" over="" silica="" gel="" and="" through="" a="" sephadex="" column,="" and="" two="" amorphous="" powders="" were="">

Izolati su identificirani i karakterizirani pomoću tekućinske kromatografije-masene spektroskopije (LCMS), 'H i 13CNMR, DEPT, heteronuklearne jednostruke kvantne koherencije (HSQC), heteronuklearne višestruke kvantne korelacije (HMQC) i heteronuklearne višestruke korelacije veza (HMBC). Tablica 1 prikazuje NMR spektralne podatke spojeva.

KSL11

Spoj 1: izoliran je kao amorfni bijeli prah. LCMS-ESI spektri za ovaj spoj pokazuju maksimum molekularnog iona na m/z 543,32[MH]t, što upućuje na molekularnu formulu C32H48O- s devet nezasićenih ekvivalenata. IR spektri otkrivaju maksimume apsorpcije koji odgovaraju hidroksilu (3,343,4 cm-l) i olefinske (1,684 cm-1) funkcionalne skupine. Štoviše, 'H NMR spektri spoja I otkrili su metin proton (CH) singletni signal na 2,6, karakterističan signal za H-18 urzanskog tipa triterpeni s 19-O-supstitucijama. Triterpenski tip 19a-hidroksi-ursana također ima tipičan protonski signal u području oko 2,6 ppm. Ovaj nezaštićeni signal može se značajno razlikovati od drugih ordinalnih signala metilenskih protona, s karakterističnim pomakom zbog olefinskog protona (H12) na ili 5,28(t,J=6Hz).cistanche benefíciosPotpuna i nedvosmislena dodjela 'H i l3C kemijskog pomaka potpomognuta je HMQC(13Cx'H) i HMBC(15Cx'H) spektrima. Iz HMBC križnog vrha, potvrđeno je da je proton na ou 2,60 H{ {5}}(Sl.2a). Ostali specifični znakovi pronađeni su za pet metilnih singleta na 1,89,1.02,0,82,1,32,1,20(svaki,H24-27;29), metilni dublet na og 0,92(d, J=6 Hz), a signal olefinskog protona na 5,30(t, J=7 Hz, H-12). Sadašnji13CNMR spektri pokazuju 32 ugljikove rezonancije, a uz DEPT i HMQC spektre, prikazana su dva karbonilna ugljika（δC183.70,C-28 i 8-178.96,C-23）, olefinski ugljik na oc 127.23, C-12, olefinski kvarterni ugljik (oc139.49, C-13), kvarterni ugljik koji nosi kisik （o-72.7, C-19 ）, deset alifatskih metilena i šest metilnih ugljika. Dva olefinska ugljika na δ-127.23（C-12） i 139.49(C-13) bili su karakteristični za ursan-triterpenoidni tip. Drugi signal koji je ukazivao na prisutnost etilen glikola （-OCH-CH-O-） prikazan je na signalima na δ4.62（d, J=11.5 Hz）,4.05（d, J=11. 5 Hz）,3.52（d, J=11.5Hz）i 4.06（d, J=11.5Hz）i podržan s δ61.27（t）i 63.20（t）. Nalazio se na C-2iC-3 na temelju prisutnosti dugotrajne korelacije u HMBC spektru. Stoga je spoj 1 identificiran kao 2,3-O-etilen glikol,19-hidroksiurs-12-en-23,28-dioična kiselina (Slika 3a).

Spoj 2: dobiven je kao bijeli amorfni prah. MS-ESI m/z 527,33 [MH]t (izračunato za 528,3815). U LCMS-ESI spektrima, molekularni ionski pik prisutan je na m/z 527,33 [MH]t, što ukazuje na molekularnu formulu CH Os, koja je zahtijevala 8 stupnjeva nezasićenosti." IR spektar je sadržavao maksimume apsorpcije koji odgovaraju hidroksilu (2927,8 cm{ {15}}) i olefinske (1,686 cm-1) funkcionalne skupine. Štoviše, 'HNMR spektri za spoj 2 pokazali su singlet na 2,42, što je karakteristično za H18 triterpena urzanskog tipa s {{24 }}O-supstitucija.Ekstrakt Cistanche protiv zračenjaOstali specifični karakteristični spektri uključivali su prisutnost šest metilnih singleta na og1.22 0.76,0.97,0.69,1.30i 1.17(svaki,H -24-28,H-30), metilni dublet na 0,91 (d,J=7Hz), i signal olefinskog protona na 5,37 (d, J=7 Hz, H-12). Odgovarajući l3(CNMR i DEPT spektri pokazuju 33 ugljikove rezonancije, a HSQC i HMQC spektri ukazuju na prisutnost karbonilnog ugljika (oc 182.23, C-28), olefinskog ugljika （δ-129.36, C -12）, olefinski kvarterni ugljik （δ-140.24, C-13）, kvarterarni ugljik koji nosi kisik (oc73.68, C-19), jedanaest alifatskih metilen i sedam metil ugljika. Ovi podaci pokazuju da spoj 2 nosi ursan-triterpenoidni kostur. Ostali signali ukazuju na prisutnost 1,3-propandiol funkcionalne skupine, na og 3,22(d,J=11 ,5 Hz), 3,42 (d, J=10,5 Hz), 1,38 (m), 1,51 (m) i 4,02 (d, J=11,5 Hz) i 3,36 (t, J{ {57}}.5Hz). Njegova funkcionalna skupina ima dugotrajnu korelaciju s C2-C3. Na temelju ovih rezultata, spoj 2 je stoga identificiran kao 2,3-O-propandiol,{{ 66}}hidroksiurs-12-en-28-oična kiselina (Slike 2b i 3b). Sličan spoj je 2,3-O-izopropiliden tormentna kiselina, izolirana iz Rubus xanthocarpus.7

KSL12

U tablici 1, svi 'H i 'C NMR spektri uspoređeni su s tormentovom kiselinom (TA/2a,3a,19-trihidroksi-12-ursen-28-oična kiselina）², koja je ursan triterpenoid koji je pronađen u nekoliko Rubus vrsta-p Tormentinska kiselina imala je velike sličnosti sa spojevima 1 i 2, osim što su se kemijski pomaci povezani s C-23 i C31-33 razlikovali. Ovaj je dio također potvrđen u Eksperimenti DEPT, HMQC i HMBC (slika 2).

Triterpenoidna kiselina je široko rasprostranjena u prirodnoj biljnoj hrani. Ima različite bioaktivnosti: hipoglikemijske učinke, protuupalna i antiaterogena svojstva, smanjenu proliferaciju stanica glatkih mišića krvnih žila i antiproliferativne aktivnosti u staničnim linijama raka bubrega, prostate i melanoma2426. Stoga, budući da ovi spojevi imaju isti kostur, oni nemaju moguće odgovarajuće potencijalne aktivnosti.

Slika 4 predstavlja inhibitornu aktivnost izolata elastaze i tirozinaze. Podaci dobiveni in vitro testovima inhibicije enzima izraženi su kao standardna devijacija (SD). Spojevi 1 i 2 inhibirali su elastazu s ICso 122,199 i 98,22 ug/mL, a također su inhibirali tirozinazu s ICso 207,79 odnosno 221,51 ug/mL. Neki pentaciklički triterpenoidi (ursolična kiselina i oleanolna kiselina) su prijavili aktivnost inhibicije elastaze2728. Također, vrijednost inhibicije elastaze spoja 2 niža je od one spoja 1. Oba spoja su bila manja inhibicijska aktivnost od pozitivne kontrole oleanolne kiseline, koja je imala ICso vrijednost od 90,39 ug/mL. Sukladno tome, prethodne studije pokazale su ICso za oleanolnu kiselinu od 76,5 ug/mL i ICso vrijednost od 31,0 ug/ml za ursolnu kiselinu28. Prethodno objavljene kinetičke analize pentacikličkih triterpena pokazale su da ti spojevi kompetitivno i reverzibilno inhibiraju neutrofilnu elastazu. U istoj studiji, eksperimenti s molekularnim spajanjem pokazali su da su molekularna skela 28-COOH i dvostruke veze u pentacikličkim triterpenima bitne za njihove inhibitorne aktivnosti

Jedan od problema koji se javlja s godinama je hiperpigmentacija.cistanche herbaStoga je u tijeku potraga za sredstvima za posvjetljivanje kože ili novim sredstvima za depigmentaciju. Supresija tirozinaze može djelovati protiv melanogeneze". Kao što je prikazano na slici 4, metanolni ekstrakt i spojevi I i 2 pokazali su umjerenu aktivnost kao inhibitori tirozinaze.

U ovom je istraživanju također korišteno molekularno spajanje za analizu aktivnosti vezanja odabranih spojeva na tirozinazu i elastazu kao njihove mete. Korištene kristalne strukture bile su 2Y9X, kristalna struktura tirozinaze iz Agaricus bisporusa s inhibitorom tropolonom; i BHGP, kristalna struktura elastaze svinjske gušterače u kompleksu sa snažnim peptidil inhibitorom FR130180. Oba su odabrana jer su dobivena iz istog organizma korištenog za in vitro test ovog istraživanja. Makromolekule su također vezane na svoje odgovarajuće inhibitore kako bi se moglo dobiti aktivno stanje konformacija enzima. Kokristali su korišteni kao središte molekularne mete za spajanje kako bi se suzile vjerojatnosti vezanja spoja tako da proces bodovanja postane učinkovitiji.

Iz molekularnog spajanja dobiveni su prosječni afiniteti vezanja za oba spoja kao što je prikazano na slikama 5 i 6. Predviđanje afiniteta koristi se za rangiranje različitih liganada s obzirom na najviši energetski položaj svakog spoja, predviđanje boljeg energetskog položaja prikazano je pomoću niži rezultati afiniteta vezanja16. Ponovno spajanje označenog inhibitora tropolona učinjeno je s prosječnim afinitetima vezanja od -7.41 kcal/mol. Prosječni afiniteti vezanja spojeva 1 i 2 na tirozinazu bili su -7.84 kcal/mol odnosno -8.37 kcal/mol (Tablica 2). Predviđeno je da oba spoja imaju bolji afinitet od inhibitora.

U međuvremenu, prosječni afiniteti vezivanja elastaseredockinga bili su-7.84 kcal/mol. Prosječni afiniteti vezanja spojeva 1 i 2 na elastazu bili su -7.58 kcal/mol odnosno -8.06 kcal/mol. Iako je rezultat pokazao da spoj 1 ima niže afinitete od kokristala, malo je drugačiji (<0.5 kcal/mol)compared="" to="" the="" inhibitor="" used="" hence="" the="" scores="" may="" ovelrlap31.="" these="" scores="" showed="" that="" both="" compounds="" were="" predicted="" to="" have="" affinities="" toward="" the="" enzymes,="" which="" is="" in="" conjunction="" with="" the="" in="" vitro="" assay="">

Metode

Opći eksperimentalni postupci. 'H i ' NMR spektri su snimljeni na 500 MHz pomoću instrumenta JEOL JNM-ECZ500R/S1. Infracrveni (IR) spektri mjereni su FTIR, IRPrestige-21, Shimadzu. Ostale analize provedene su korištenjem instrumenta Waters UPLC-MIS XEVO G2-XS QTof, čitača mikropločica VersaMax i čitača mikropločica BioTek ELX800, aluminijskih listova obloženih loreom TLC-Silica gel 60 GF254 (Merck, Darmstadt, Njemačka) , kromatografija na stupcu (CC) provedena je pomoću silika gela 60 (Merck, Darmstadt, Njemačka) s 70-230 mrežicom za otvorenu kromatografiju i 230-400 mrežom za vakuumsku kromatografiju. Biljni materijali. Lišće R. fraxinifolius prikupljeno je s područja plantaže u planini Pangrango, Zapadna Java, na visini od 4343 stope, u prosincu 2018. Uzorak je identificirao botaničar (dr. Joni Setijo) u Istraživačkom centru za biologiju, Indonezijski institut za Sciences, Indonezija, s brojem uzorka 033/IPH.1.01/If.07. Sakupljanje biljnog materijala dobilo je dopuštenje od farmera i bilo je u skladu s institucionalnim propisima i smjernicama.

Ekstrakcija i izolacija. Listovi u prahu osušeni na zraku (2300 g) ekstrahirani su korištenjem Soxhlet aparata s gradijentom otapala (n-heksan, EtOAc i MeOH) kako bi se dobili odgovarajući ekstrakti, zatim ispareni pomoću rotacijskog isparivača i vakuumsku pećnicu. Ekstrakt metanola (291 g) i ekstrakt etil acetata (65 g) adsorbirani su na silika gelu i provedena je vakuumska tekućinska kromatografija/VLC, eluiranjem s postupnim gradijentom EtOAc:MeOH (od 1:0 do 0:1) do proizvesti frakcije za svaki ekstrakt (Eal-Hall i M1-Mill i). Kombinirane su slične frakcije koje su imale pozitivne reakcije s vanilin sumpornim reagensima u TLC. Prinos frakcije: Eal-3 (2,27 g);Ea4-6(8,47 g);Ea7-8(12,9 g);Ea9-11 (22,3 g); i M1-3 (4,89 g);M4-5 (5,1 g);M6-7 (6,02g);M8(166,42g);M9(10,53g);M{{38 }} (2,9 g). Sve frakcije su podvrgnute ispitivanju aktivnosti inhibitora elastaze, Fr. M8 je dao najveći prinos i imao jaku aktivnost. Fr. M8 uzastopno daljnje raspodjele pomoću CC preko silika gela (eluens CH2Cl2/MeOH s postupnim gradijentom) i pročišćen upotrebom kolone Sephadex LH-20 (eluiranje s CHCl3-MeOH 100:10, v/v. Dvije frakcije pokazali su čvrstu prirodu i kristalizirani su s kloroformom i metanolom kako bi se dobila dva izolata: spoj 1 (18 mg) i: 2 (31 mg). Čistoća svih izolata procijenjena je dvodimenzionalnom TLC i vizualizacijom točke korištenjem 5 posto sumporne kiseline. kiseline u metanolu, nakon čega slijedi zagrijavanje ploča na 110 stupnjeva 5 minuta.

Kristali su identificirani i karakterizirani korištenjem tekućinske kromatografije-masene spektroskopije (LCMS), LH i '3C distorzije pojačane polarizacijskim prijenosom (DEPT) NMR, heteronuklearnom jednostrukom kvantnom koherencijom (HSQC), heteronuklearnom višestrukom kvantnom korelacijom (HMQC) i heteronuklearnom višestrukom korelacija veza (HMBC).

Ispitivanje inhibicije elastaze. Test inhibicije elastaze proveden je kao što je prethodno opisano uz neke modifikacije32. Ukratko, u Nunc-96 jažičnim mikrotitarskim pločama,20-μL alikvoti 0.8-jedinica/mL PPE u Trizma stupnju osnovnog pufera （pH 8.0 ） pomiješani su s 20-μL uzorcima, a smjese su zatim razrijeđene do 180 μL u baznom puferu Trizma stupnja. Ispitivani ekstrakti prethodno su inkubirani s enzimom 15 minuta, te su dodani 20-µL alikvoti supstrata N-sukcinil-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilida (A3PVN; 2,9 mM) i inkubirani još 15 minuta. Pozitivna kontrola i slijepe jažice sadržavale su oleanolnu kiselinu i vodu. Eksperimenti su provedeni u tri primjerka, a stope inhibicije su određene prema apsorbiranju; na 401 nm pomoću VersaMax čitača mikropločica. Postotak inhibicije izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

gdje je E apsorbancija enzimske reakcije, Eb je apsorbancija slijepe probe enzima, T je apsorbancija ispitnog uzorka, a Tb je apsorbancija slijepe probe. također su vrijednosti određene iz linearnog grafikona postotka inhibicije elastaze u odnosu na koncentraciju (50,75,100,125,150 ug/mL). Test inhibicije tirozinaze. Inhibicija tirozinaze određena je metodom formiranja DOPA-kroma kao što je prethodno opisano uz male modifikacije13. Ukratko, u 96-pločicama s jažicama, alikvoti od 20 μL DMSO （kontrola） ili ispitivanih spojeva u različitim koncentracijama pomiješani su s alikvotima od 40 μL 30 U/mL tirozinaze gljive （Sigma Aldrich） i 100-μL 0.1-M fosfatni pufer （pH 6,8）. Prethodno su inkubirani 10 minuta na sobnoj temperaturi. Reakcije su započete dodavanjem 4 μL alikvota 10 mML-DOPA u svaku jažicu i inkubiranjem na 37 stupnjeva 20 minuta. Aktivnost tirozinaze je zatim određena mjerenjem apsorbancije na 475 nm. Kojična kiselina korištena je kao pozitivna kontrola. Eksperimenti su izvedeni u tri primjerka. Postotak inhibicije tirozinaze izračunat je pomoću sljedeće jednadžbe:

Molekularno spajanje. U ovom istraživanju, in silico farmakološka aktivnost je predviđena s molekularnim spajanjem pomoću liječnika. Ciljano molekularno spajanje učinjeno je korištenjem kokristaliziranog liganda kao središta aktivnog mjesta. Struktura 2Y9X korištena je za molekularno spajanje tirozinaze s tropolonom, inhibitorom tirozinaze gljiva, kao svojim kokristalom. Središte mjesta molekularnog spajanja definirano je na -10.032;-28.769 i -43.467 kao dimenzije X, Y i Z. Lanac A je odvojen za upotrebu i atom Holmija je uklonjen iz strukture pomoću UCSF Chimera.

Struktura 3HGP, svinjske elastaze također je korištena u ovom istraživanju.FR130180, budući da je kokristal korišten kao središte mjesta molekularnog spajanja. Koordinate su bile 12.453, 9.237 i 1.199 za dimenzije X, Y, Z. Afinitet vezanja je analiziran iz deset najboljih konformera svakog izračuna molekularnog spajanja.

Ovaj je članak izvađen iz Znanstvenih izvješća|(2021) 11: 20452|https://doi.org/10.1038/s41598-021-99970-x