CD4D T-stanice reaktivne na nuklearni antigen šire se u aktivnom sistemskom eritematoznom lupusu, proizvode efektorske citokine i napadaju bubrege
Mar 16, 2022
Kontakt: ali.ma@wecistanche.com
Dimas Abdirama i sur
Cistanche DHT za bolest bubrega, kliknite ovdje da biste dobili uzorak
Sistemski lupuseritematozusje sustavan i kroničanautoimunibolestkarakteriziran gubitkom tolerancije prema nuklearnim antigenima s autoreaktivnimCD4DT stanice uključene u patogenezu bolesti. Međutim, vrlo malo se zna o njihovoj specifičnosti receptora od otkrivanja specifičnih za ljudski autoantigenCD4DT-stanice bio je iznimno izazovan. Ovdje predstavljamo analizuCD4DT-stanice reaktivne na nuklearne antigene korištenjem dvije komplementarne metode: knjižnice T-stanica i obogaćivanje T-stanica reaktivnih na antigen. Učestalosti nuklearnih antigen-specifičnihCD4DT stanice u korelaciji s težinom bolesti. Ove autoreaktivne T-stanice proizvode efektorske citokine kao što su interferon-g, interleukin-17 i interleukin-10. U usporedbi s krvlju, te su stanice bile obogaćene u urinu pacijenata s aktivnim lupusnim nefritisom, što ukazuje na infiltraciju upaljenogbubrega. Prema tome, ove prethodno neprepoznate karakteristike podupiru ulogu nuklearnih antigen-specifičnih CD4D T stanica u sistemskom lupusu eritematodesu.
Sistemski lupuseritematozus(SLE) je sustavna i kronična autoimuna bolest koju karakterizira gubitak tolerancije prema nuklearnim antigenima zbog neispravnog odlaganja biološkog otpada kao što je apoptotski materijal koji sadrži ribonukleoproteine i nukleosome.1 Autoantitijela usmjerena protiv nuklearnih antigena karakteristična su za SLE i obično se javljaju prije očigledne bolest.2Osim toga, autoreaktivne CD4þ T stanice uključene su u patogenezu SLE promicanjem proizvodnje autoantitijela u B stanicama i izravnim širenjem oštećenja organa u upaljenim ciljnim organima.3Iako je ranije prijavljeno otkrivanje nuklearnih antigen-reaktivnih T-stanica, dokazi o njihovom postojanju sve do sada ostaju periferni i trenutačno je nejasno kako one međusobno djeluju u patogenezi.4–9Razumijevanje načina na koji te stanice sudjeluju u autoimunosti bit će ključno za dizajn učinkovitog liječenja.
Otkrivanje T-stanica specifičnih za autoantigen ometa njihova izuzetno niska frekvencija u cirkulirajućoj krvi. 10 Prethodne studije ljudskih naivnih CD4þ repertoara T-stanica koristile su tehnologiju temeljenu na tetramerima za učinkovito pružanje preciznih informacija o odgovorima T-stanica na specifične epitope antigena ; međutim, ova metoda zahtijeva prethodno poznavanje tipova humanih leukocitnih antigena davatelja.11–13Alternativne tehnike za istovremeno otkrivanje i popisivanje rijetkih populacija T-stanica s reaktivnošću na različite antigene bez prethodnog znanja o tipovima antigena ljudskih leukocita razvijene su korištenjem biblioteka amplificiranih poliklonalnih T-stanica14i obogaćivanjem T-stanica koje eksprimiraju CD154- nakon stimulacije antigenom nazvanim ARTE (antigen-reactive T-cell enrichment).15
CD4þ T stanice uglavnom ostvaruju svoju funkciju lučenjem citokina nakon antigene aktivacije16i širenjem upale tkiva kao što je lupus nefritis (LN) koji predstavlja jednu od najozbiljnijih komplikacija SLE.17,18
Analiza repertoara T-stanica prisutnog u biopsijama bubrega pacijenata s LN-om otkrila je oligoklonalnostbubreg-infiltrirajuće CD4þ T stanice, što ukazuje na nakupljanje antigen-specifičnih T stanica u upaljenimbubrega.19Naša prethodna studija otkrila je mokraćne T-stanice u pacijenata s aktivnim LN-om kao precizan biomarker koji nalikuje fenotipu intrarenalnih stanica.20,21Iako su ove stanice obogaćene za CXC kemokinski receptor 3 i CC kemokinski receptor 5 koji eksprimiraju T stanice koje ukazuju na populaciju stanica T pomoćnih stanica 1 (Th1) i sadrže CD154þ T stanice koje ukazuju na nedavni susret s antigenom,22,23njihova antigenska specifičnost prema nuklearnim antigenima ostaje nejasna. U ovoj studiji predstavljamo analizu CD4þ T stanica reaktivnih na nuklearne antigene u ukupno 17 zdravih pojedinaca,12 ispitanika s neaktivnim SLE, te 20 ispitanika s aktivnim SLE korištenjem biblioteka T-stanica i ARTE tehnika za analizu učestalosti autoreaktivnih CD4þ T stanica u perifernoj krvi i urinu bolesnika s LN-om kao i proizvodnju citokina.
REZULTATI
Nuklearni antigen-reaktivne CD4D T stanice su ekspandirane neaktivne SLE kako je utvrđeno korištenjem biblioteke T-stanica i ARTE
S obzirom na visoku teoretsku osjetljivost za otkrivanje rijetkih antigen-specifičnih T stanica, biblioteke umnoženih CD4þ T stanica su generirane i ispitivane na reaktivnost protiv nuklearnih antigena. Proširene biblioteke T-stanica od 12 pacijenata sa SLE i 6 zdravih kontrola stimulirane su kanonskim nuklearnim antigenima SmD1, RNP70, histonom, Ro i La u prisutnosti stanica koje predstavljaju antigen, nakon čega je uslijedilo mjerenje staničnih proliferacija kao odgovor na antigensku stimulaciju (dodatna slika S1A). Budući da su pojačani blasti T-stanica različito reagirali na antigene, z rezultat specifičan za davatelja korišten je kao prag proliferacije i stupanj indeksa stimulacije (odgovor stimuliranih stanica u odnosu na nestimulirane stanice) na superantigen Staphylococcus enterotoksin B (SEB ) služio je kao kriterij uključivanja (dodatna slika S1B–D). Uz nuklearne antigene, uključili smo transtiretin kao irelevantni kontrolni autoantigen (n=8 pacijenata sa SLE; n=5 zdravih kontrola) (Slika 1a). Detekcija stanica specifičnih za antigen potvrđena je izazivanjem niza pozitivno ocijenjenih mikrokultura s odgovarajućim antigenom i analizom ekspresije antigen-specifičnih markera aktivacije T-stanica CD154 i interferona (IFN)-g korištenjem druge citometrije24 (dopunska slika S1E). Pomoću Poissonove distribucije14 pobrojane su učestalosti antigen-specifičnih T stanica. Značajno je da su srednje učestalosti nekih nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica bile povećane u bolesnika s aktivnim SLE u usporedbi sa zdravim subjektima (SmD1: P=1; RNP70: P=0.{{ 35}}4; histon: P=0.35; Ro: P=0.02; La: P=0.04 ) i bolesnika s neaktivnim SLE (SmD1: P=0,79; RNP70: P=0,04; histon: P=0,23; Ro: P=0,04; La: P=0,006) (Slika 1b). Ukupan broj autoreaktivnih CD4þ T stanica povezanih sa SLE-om varirao je među pojedincima u rasponu od 0 do 185,5 stanica na 1 milijun stanica, s najvećim učestalostima u bolesnika s aktivnim SLE-om (Slika 1c). Nuklearni antigen-reaktivne CD4þ T stanice bile su detektirane u svih bolesnika s aktivnim SLE. Ove su se stanice također mogle otkriti u 5 od 6 pacijenata s neaktivnim SLE, dok su samo 3 od 6 zdravih kontrolnih ispitanika imale cirkulirajuće autoreaktivne T stanice. Zanimljivo je da su pacijenti s aktivnim SLE također pokazali širi raspon autoreaktivnih T-staničnih odgovora, pri čemu je svaki pacijent imao reaktivne T-stanice protiv najmanje 3 nuklearna antigena. Za usporedbu, ciljni portfelj bio je manje varijabilan u bolesnika s neaktivnim SLE-om i zdravih kontrolnih ispitanika. Uzeti zajedno, cirkulirajuće nuklearne antigen-reaktivne T stanice nisu isključive za SLE, ali su neaktivne SLE, njihov broj je veći i njihove ciljne strukture su varijabilnije.
Budući da autoreaktivne T-stanice igraju ulogu u širenju autoimunih odgovora, usporedili smo broj autoreaktivnih T-stanica s težinom bolesti, procijenjenom indeksom aktivnosti SLE bolesti (SLEDAI). Samo su učestalosti CD4þ T stanica reaktivnih na RNP70, Ro i La pozitivno korelirale sa SLEDAI (RNP70: P ¼ 0.04, r ¼ { {11}}.4865; Ro: P=0.005, r=0,6299; La: P=0,01, r=0,5651) (Slika 1d). Nasuprot tome, učestalost T stanica reaktivnih na transtiretin nađena je na prilično sličnoj razini u sve 3 skupine (Slika 1e), čime se odbacuje moguća eksperimentalna pristranost zbog opće ne-antigen-specifične hiperreaktivnosti T-stanica neaktivnog SLE.
Knjižnice T-stanica nude niz prednosti uključujući visoku osjetljivost za otkrivanje vrlo rijetkih stanica unutar malog broja ulaznih ćelija. Međutim, ova se tehnika oslanja na širenje stanica, što može promijeniti stanični sastav i pruža samo ograničenu mogućnost fenotipske karakterizacije reaktivnih stanica. Stoga smo svoja opažanja potvrdili metodom ARTE. ARTE protokol zahtijeva veće količine ulaznih stanica, što je posebno izazovno kod bolesnika sa SLE koji se često javljaju s limfopenijom i anemijom. Zbog ovog ograničenja i također kako bismo povećali očekivano očitavanje reaktivnih stanica, skupili smo svih 5 kanonskih nuklearnih antigena i upotrijebili taj skup za stimulaciju mononuklearnih stanica periferne krvi (PBMC) prije obogaćivanja stanica koje eksprimiraju CD154- (n=15 bolesnika sa SLE; n=6 zdravih kontrola). Korištenjem kombinacije površinskih markera CD154 i CD69, T stanice reaktivne na nuklearne antigene povezane sa SLE mogu se identificirati unutar pozadinske populacije (Slika 1f). Iako je pozadinska ekspresija CD154 i CD69 obilno primijećena kod svih pojedinaca, pacijenti s aktivnim SLE imali su značajno povećanu učestalost CD154þCD69þ T stanica kada su stimulirane nuklearnim antigenima u usporedbi s pozadinskom stimulacijom (P ¼ 0.0{ {18}}8), dok su zdrave osobe i bolesnici s neaktivnim SLE-om imale slične učestalosti između antigenom stimuliranih i nestimuliranih stanica (zdrave osobe: P=0.44; bolesnici s neaktivnim SLE: P={{23} }.56) (Slika 1g). Nadalje, oduzimanjem pozadinskih frekvencija, učestalosti nuklearnih antigen-reaktivnih T stanica bile su veće u pacijenata s aktivnom bolešću nego u zdravih pojedinaca i pacijenata s neaktivnom bolešću (P=0.02 i P ¼ 0,11, redom) (Slika 1h). Učestalost pozadinski oduzetih nuklearnih antigen-reaktivnih T-stanica stoga je pozitivno korelirala s aktivnošću bolesti (P = 0,004, r=0,5978), što ukazuje na njihovu potencijalnu ulogu u patogenezi SLE (Slika 1i). Štoviše, CD4þ T stanice reaktivne na opozivni antigen Candida albicans MP65 pokazale su slične učestalosti među donorima (Slika 1j), isključujući mogućnost opće pristranosti prema višim učestalostima antigen-reaktivnih T stanica u bolesnika s aktivnim SLE.
Zajedno, naši podaci generirani pomoću biblioteke T-stanica i ARTE metoda pokazuju ekspanziju autoantigen-specifičnih CD4þ T stanica u bolesnika s aktivnim SLE. Obje su tehnike usporedive kao što pokazuju slične srednje vrijednosti indeksa stimulacije između antigenom stimuliranih i nestimuliranih odgovora T-stanica (srednji indeks stimulacije—biblioteka T-stanica: 1,857; ARTE: 1,614; P=0.33), iako tehnika ARTE otkrila je veće učestalosti nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica nego tehnika knjižnice T-stanica (Slika 1k).
Nuklearne antigen-reaktivne T stanice u zdravih pojedinaca su bona fife autoreaktivne CD4D T stanice
I biblioteka T-stanica i ARTE tehnike pokazale su detekciju autoreaktivnih T stanica kod zdravih pojedinaca, koje predstavljaju moguće izvorište razvoja ljudske autoimunosti.25Međutim, njihov se broj nije značajno razlikovao od pozadinskih frekvencija, ostavljajući neizvjesnim moraju li zdravi subjekti doista cirkulirati nuklearne antigen-reaktivne CD4þ T stanice. Kako bismo razotkrili antigensku specifičnost autoreaktivnih T stanica u zdravih subjekata, generirali smo pojedinačne T-stanične klonove iz CD154þCD69þ CD4þ T-stanica prekursora izoliranih iz zdravih pojedinaca nakon stimulacije PBMC-a s pojedinačnim nuklearnim antigenima i kontrolnim antigenom izvedenim iz lizata Aspergillus fumigatus. Značajan broj klonova T-stanica povezanih s autoantigenom koji su specifični za SLE odgovorio je na svoje odgovarajuće antigene nakon restimulacije antigenom, što je istaknuto koekspresijom IFN-g s CD154 (broj specifičnih klonova — Aspergillus fumigatus: 5 od 5; SmD1: 4 od 8; RNP70: 3 od 11; histon: 5 od 5; Ro: 4 od 9; La: 5 od 7) (dodatna slika S2A i B). Štoviše, antigenski odgovor (reprezentativno prikazan za SmD1) bio je ovisan o dozi, naglašavajući da su nuklearne T-stanice reaktivne na antigen u zdravih osoba bona fife autoreaktivne CD4þ T-stanice (dodatna slika S2C). Tako smo potvrdili postojanje nuklearnih antigen-reaktivnih T stanica u zdravih ispitanika unutar pozadinskog signala primijenjenih metoda detekcije.
Proizvodnja citokina nuklearnih antigen-reaktivnih CD4D T stanica
Zatim smo ispitali proizvodnju citokina nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica. Stanice koje eksprimiraju CD154- obojene su intracelularno na efektorske citokine kao što su IFN-g, interleukin (IL)-17, IL-4 i IL-10 nakon stimulacije skupom Nuklearni antigeni povezani sa SLE (Slika 2a). Učestalosti CD154þCD4þ T stanica koje proizvode IFN-g–, IL-17– i IL{{10}}– koje proizvode CD154þCD4þ T stanice bile su značajno povećane u bolesnika s aktivnim SLE (svi citokini: P ¼ {{16} }.004), dok je učestalost autoreaktivnih T stanica koje proizvode IL-4 ostala nerazlučiva od pozadinske frekvencije (P=0.125) (Slika 2b ). Štoviše, apsolutni broj autoreaktivnih T stanica koje proizvode IFN-g– i IL{{20}} bio je viši u bolesnika s aktivnim SLE nego u zdravih pojedinaca i bolesnika s neaktivnim SLE (Slika 2b). Oduzimanjem pozadinskih frekvencija, bolesnici s aktivnim SLE-om imali su značajno veće učestalosti autoreaktivnih T stanica koje proizvode IFN-g– i IL-10 nego zdravi pojedinci (IFN-g: P={{40 }}.003; IL-10: P ¼ 0.004) kao i IFN-g– IL-17– i IL-10– koje proizvode autoreaktivne T-stanice nego kod pacijenata s neaktivnim SLE (IFN-g: P=0.002; IL{{ 36}}: P=0,002; IL-10: P=0,005) (Slika 2c). Osim toga, učestalost IFN-g– i IL-10– ali ne i IL-17– i IL-4–reaktivnih T stanica koje proizvode nuklearni antigen korelirala je s aktivnošću bolesti. Međutim, samo je učestalost stanica koje proizvode IL-4 pokazala manju korelaciju s aktivnošću bolesti (IFN-g: P < 0,0001,="" r="0,7574;" il-17:="" p="0,005," r="0,5889;" il="" -4:="" p="0,14," r="0,3717;" il-="" 10:="" p="0,0004," r="0,6977)" (slika="" 2d).="" sudeći="" prema="" učestalosti="" proizvođača="" ifn-g,="" antigen-reaktivne="" cd4þ="" t="" stanice="" bile="" su="" uglavnom="" th1="" loze.="" nasuprot="" tome,="" il-17,="" kao="" i="" proizvođači="" il-10,="" otkriveni="" su="" samo="" pri="" nižim="" učestalostima.26="" u="" usporedbi="" s="" razinama="" autoantitijela,="" učestalosti="" cd4þ="" t="" stanica="" koje="" proizvode="" citokine="" nisu="" bile="" u="" korelaciji="" s="" koncentracijom="" anti-dvolančane="" dna="" i="" sa="" serumskim="" titrom="" antinuklearnih="" protutijela="" (dodatna="" slika="" s3a="" i="" b).="" nije="" primijećena="" nikakva="" druga="" korelacija="" između="" nuklearnih="" antigen-reaktivnih="" cd4þ="" t="" stanica="" i="" autoantitijela="" osim="" za="" la-reaktivne="" cd4þ="" t="" stanice="" prema="" la="" autoantitijelima="" (dodatna="" slika="">
Detection of nuclear antigen–reactive CD4D T cells in the urine of patients with active SLE and LN The population of nuclear antigen–reactive Th1 cells is suspected to invade the renal tissue, where they might encounter their almost omnipresent cognate antigen.27 By investigating the T-cell receptor (TCR)-b repertoire of CD4þ T cells isolated from peripheral blood compared with those isolated from the urine of 5 patients with SLE and active LN, we observed oligoclonal skewed TCR repertoires of urine-derived cells (Figure 3a). The cumulative frequency of the 20 most abundant T-cell clones was significantly higher in urine corresponding to a lower diversity index (Supplementary Figure S4A). To test whether these cells also demonstrate reactivity to a set of SLE-associated nuclear antigens, we generated libraries consisting of urinary CD4þ T cells isolated from 3 patients with SLE and active LN (Supplementary Figure S4B). Urinary CD4þ T cells were metabolically and functionally active cells indicated by the ability to proliferate upon stimulation with SEB but with signs of exhaustion shown by a reduced proliferation capacity after polyclonal activation (Supplementary Figure S4C and D). Because of these circumstances, only microcultures with a SEB stimulation index of >4 su uključene za brojanje urinarnih CD4þ T stanica specifičnih za pojedinačni nuklearni antigen. Paralelno s CD4þ T stanicama u urinu, određena je učestalost nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica u perifernoj krvi, što je omogućilo izravnu usporedbu odgovarajućih učestalosti unutar istih pojedinaca (Slika 3b). Otkrili smo da su neaktivne LN, učestalosti urinarnih nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica bile veće od onih u perifernoj krvi. Kako bismo potvrdili ovo opažanje, označili smo urinarne stanice izolirane od 4 aktivna donora LN s karboksifluorescein sukcinimidil esterom i pomiješali obilježene stanice s PBMC-ima podudarnim s donorom kako bismo omogućili izravnu usporedbu antigen-reaktivnih stanica u 1 testu koristeći ARTE tehniku. Učestalost CD154þCD69þ T stanica u stimuliranim i nestimuliranim uzorcima stanica urinarnih i perifernih krvnih stanica podudarnih davatelja korištena je za procjenu jesu li nuklearne antigen-reaktivne T stanice obogaćene u urinu kao zamjena zabubregizračunavanjem indeksa stimulacije (slika 3c). Iako su se metode urinarnih T-stanica i ARTE razlikovale u srednjem indeksu stimulacije nuklearnih antigena (indeks stimulacije—urinarna biblioteka T-stanica: 17; ARTE: 2,79; P=0.4) (Slika 3d) , analiza autoreaktivnosti u perifernim i urinarnim CD4þ T stanicama iz obje metode (ukupno n=7) pokazala je povećani indeks stimulacije nuklearnog antigena u urinu (P=0.0156) (Slika 3e). Ova opažanja sugeriraju da CD4þ T stanice reaktivne na nuklearni antigen napadaju i nakupljaju se u upaljenombubrega. Stoga bi lokalna upala tkiva kod SLE mogla biti fenomen specifičan za antigen i izravno moduliran infiltrirajućim autoreaktivnim T stanicama.
RASPRAVA
Kršenje tolerancije na nuklearne antigene obilježje je SLE-a, a osim B-stanica, autoreaktivne T-stanice za koje se smatra da igraju središnju ulogu u njegovoj patogenezi. Međutim, budući da otkrivanje (auto)antigen-specifičnih, CD4þ T stanica još uvijek predstavlja veliki izazov u istraživanju autoimunosti, do danas se zapravo malo zna o nuklearnim antigen-reaktivnim CD4þ T stanicama u SLE.
Nedavno su razvijene nove metode za otkrivanje i brojanje antigen-specifičnih CD4þ T stanica. Pristup biblioteke T-stanica iskorištava prethodno poliklonalno širenje T-stanica kako bi se omogućilo otkrivanje rijetkih klonova T-stanica specifičnih za antigen.14 Ova strategija nudi visoku osjetljivost i omogućuje rad s ograničenom količinom stanica. Koristeći ovu tehniku, uspjeli smo dokazati reaktivne T stanice protiv 5 kanoničkih nuklearnih antigena u bolesnika s aktivnim SLE. Nedostaci detekcije temeljene na knjižnici su, osim što je zahtjevna za rad, to što se ne može isključiti prerastanje ili gubitak određenih klonova tijekom faze ekspanzije i ograničene mogućnosti za fenotipsku analizu stanica.
Standardna druga citometrija ograničena je brojem detektabilnih događaja, što obično ograničava analizu uzoraka na populaciju s učestalostima iznad {{0}}.01 posto. Naše promatranje korištenjem biblioteke T-stanica otkrilo je da je učestalost cirkulirajućih autoreaktivnih CD4þ T stanica za određeni autoantigen kod pacijenata s pogoršanjem bolesti bila w20 stanica u milijun stanica, što predstavlja učestalost od 0,002 posto; stoga je otkrivanje CD4þ T stanica specifičnih za autoantigen korištenjem standardne, nemanipulirane citometrije gotovo nemoguće. Bacher i sur. uveli su prethodno obogaćivanje CD4þ T stanica koje su reaktivne na određene antigene prije akvizicije na drugoj citometriji, poznato kao ARTE metoda.15 Prilagodbom ovog pristupa za otkrivanje nuklearnih antigen-specifičnih CD4þ T stanica, uspjeli smo potvrditi naše nalaze i pokazuju ekspanziju nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica u aktivnom SLE. Značajno, učestalost T stanica reaktivnih na transtiretin i C. Albicans bila je indiferentna između zdravih kontrolnih osoba i pacijenata sa SLE s različitim aktivnostima bolesti. Stoga, opažena ekspanzija autoreaktivnih T stanica vjerojatno nije rezultat opće hiperreaktivnosti neaktivnog SLE, već ekspanzije antigen-specifičnih T stanica.
Prethodni izvještaji već su pokazali postojanje autoreaktivnih T stanica u SLE-u, primarno korištenjem proliferacije, proizvodnje citokina ili pojačane regulacije aktivacijskih markera, iako bez mogućnosti kvantificiranja jasne populacije tih stanica.4–6,8 Najbolji dokaz o Učestalost T stanica specifičnih za nuklearni antigen postoji za reaktivnost protiv malog ribonukleoproteina U1, karakteristične mete autoantigena u mješovitoj bolesti vezivnog tkiva i pronađenog samo u frakciji bolesnika sa SLE. U1 male nuklearne ribonukleoprotein-reaktivne CD4þ T stanice određene su korištenjem ograničavajućeg razrjeđenja i enzimski vezanog imunološkog testa (ELISPOT) i prijavljeno je da se pojavljuju na učestalosti (40 do 250) - 106 T stanica i (20 do 60 ) 106 PBMC-a,7,9 što je slične veličine kao učestalost autoreaktivnih stanica u našem istraživanju. U našem radu istraživali smo reaktivnost na nekoliko karakterističnih nuklearnih antigena povezanih sa SLE. Zanimljivo, iako su svi pacijenti s aktivnim LN-om pokazali povećanu učestalost anti-nuklearnih antigen-reaktivnih CD4þ T stanica, pacijenti su se razlikovali u svom ciljanom portfelju, a reaktivnost je bila usmjerena protiv šireg skupa antigena u usporedbi s pacijentima s neaktivnim SLE. Biološki značaj ovoga trenutno nije poznat. Različite reaktivnosti CD4þ T stanica mogu se povezati s određenim kliničkim manifestacijama različitih reaktivnosti koje mogu biti suvišne za patogenezu bolesti.
Slično drugim autoimunim bolestima, također smo bili u mogućnosti dokazati postojanje autoreaktivnih CD4þ T stanica u zdravih osoba,28,29 iako s mnogo nižim učestalostima u usporedbi s pacijentima s aktivnim SLE. Ove stanice nisu bile detektirane usporedbom broja aktiviranih stanica sa ili bez stimulacije antigenom, čak i s tako visoko osjetljivim tehnikama kao što su knjižnice T-stanica ili ARTE metode. Međutim, kloniranjem jedne stanice, uspjeli smo pokazati da "pozadinski" signal doista sadrži autoantigen-specifične CD4þ T stanice. Koji specifični događaji dovode do prekida tolerancije i povećanja učestalosti autoreaktivnih T stanica ostaje nagađanje; usprkos tome, naši podaci pokazuju da ekspanzija autoreaktivnih klonova igra ulogu u patogenezi SLE.
Cirkulirajuće nuklearne antigen-reaktivne CD4þ T stanice uglavnom proizvode IFN-g i, u manjoj mjeri, IL-17 i IL-10. Ovaj profil citokina zajedno sa slabom/nikakvom korelacijom s proizvodnjom autoantitijela sugerira da uloga CD4þ T stanica reaktivnih na nuklearni antigen možda nije isključivi pružatelj pomoći B stanicama. Pokazalo se da je IFN-g neophodan u patogenezi LN-a.30,31 Pokazalo se da se Th1 stanice regrutiraju u upaljeno bubrežno tkivo kod SLE-a,20,32 čineći nuklearne antigen-reaktivne T-stanice glavnim kandidatima za invaziju nabubrega, gdje bi se susreli sa svojim sveprisutnim srodnim autoantigenom. Prethodno je opisano da urinarne T-stanice odražavaju aktivnost bolesti i odražavaju fenotip intrarenalnih stanica u LN20,33; stoga smo koristili mokraćne T stanice kao zamjenu za bubrežne T stanice. T-stanice u mokraći otkrile su ograničenu varijabilnost TCR-a, što je u skladu s opažanjima ububregbiopsije,19,34 koje ukazuju na obogaćivanje određenih klonova T-stanica u upaljenom tkivu bubrega. Među urinarnim T-stanicama, uspjeli smo detektirati nuklearne antigen-reaktivne T-stanice, a njihova je učestalost bila obogaćena u usporedbi s T-stanicama cirkulacije. Posljedično, čini se vjerojatnim da nuklearne antigen-reaktivne stanice izravno sudjeluju u širenju oštećenja lokalnog organa.
Ukratko, ovdje pokazujemo da su nuklearne antigen-reaktivne CD4þ T stanice ekspandirani neaktivni SLE; oni su fenotipski uglavnom Th1 T stanice koje proizvode IFN-g i napadaju upaljene ciljne organe kao što je bubreg.
METODE
Detaljne metode dane su u Dodatnom materijalu.
Ispitanici i uzorci krvi i urina
Uzorci krvi uzeti su od 17 zdravih osoba, 12 pacijenata s neaktivnim SLE (SLEDAI rezultat<10), and="" 20="" patients="" with="" active="" sle="" (sledai="" score="">10). Osim toga, uzeti su uzorci urina od 12 bolesnika s aktivnim SLE i LN. Svi ispitanici dali su svoj informirani pristanak na temelju etičkog odobrenja dobivenog od strane institucionalnog odbora za reviziju i etičkih tijela na Charité – Universitätsmedizin Berlin (EA 1/342/12, EA 1/098/07 i 1/036/16). PBMC i urinarne stanice pripremljene su korištenjem Ficoll-Hypaque gradijenta gustoće.
Antitijela i kolega citometrija
Ovisno o pokusima, nekoliko površinskih molekula obojeno je na antigenom stimuliranim stanicama u različitim kombinacijama sljedećih monoklonskih protutijela: anti-CD3, -CD4, -CD8, -CD14, -CD20, -CD69 i -CD154; za razlikovanje živih i mrtvih stanica korišten je komplet LIVE/DEAD Aqua (Life Technologies Ltd., Paisley, UK). Kako bi se obojio intracelularni stanični odjeljak, stanice su fiksirane s 2 posto (v/v) paraformaldehida 15 minuta na sobnoj temperaturi i permeabilizirane s BD FACS Permeabilizing Solution 2 (BD Biosciences, San Jose, CA); sljedeći antigeni su obojeni intracelularno korištenjem standardnog protokola: CD154, IFN-g, IL-2, IL-4, IL-10 i IL-17. Uzorci su prikupljeni na drugim citometrima BD FACSCanto II i BD LSRFortessa (BD Biosciences) u Flow Cytometry Core Facility Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin korištenjem softvera BDFACSDiva (BD Biosciences). Podaci protočne citometrije analizirani su pomoću softvera FlowJo (FlowJo v10, Three Star, Ashland, VA).
Antigen i priprema antigenskog pula
Koristili smo sljedeće antigene za stimulaciju CD4þ T stanica u testu biblioteke T-stanica: 0.5 mg/ml humanog SNRPD1 (SmD1) rekombinantnog proteina (Biorbyt Ltd., Cambridge, UK), 5{{9 }} ng/ml humanog SNRP70 (RNP70) rekombinantnog proteina (Abcam Plc., Cambridge, UK), 0.5 mg/ml prirodnog humanog histonskog proteina (Abcam Plc .), 0,5 mg/ml ljudskog SS-A/Ro rekombinantnog proteina (ljubazno ustupio Euroimmun AG, Lübeck, Njemačka), 0,5 mg/ml ljudskog SS-B/Larekombinantnog proteina (ustupio Orgentec DiagnostikaGmbH, Mainz, Njemačka) , 1 mg/ml SEB-a (Sigma-Aldrich ChemieGmbH, Steinheim, Njemačka), 1 mg/ml PepTivator Candidaalbicans MP65 (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Njemačka) i 0,5 mg/ml humanog transtiretin rekombinantnog proteina (ATGen, Seongnam, Južna Koreja).
Periferne i urinarne knjižnice T-stanica
The protocol to generate amplified peripheral and urinary T-cell libraries was adopted and adapted as previously described.14 Brieflfly, 200,000 peripheral CD4þ T cells or 500 to 2000 urinary CD4þ T cells were isolated using anti-human CD4 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) according to manufacturer's instructions. The purity of CD4þ T-cell fraction was routinely checked using fellow cytometry on the basis of CD3þCD4þ expression, where the purity always reached >99 posto, odnosno 70 do 75 posto za uzorke periferne krvi i urina. Paralelno, stanice koje prezentiraju antigen pripremljene su skupljanjem CD3 stanica iz PBMC nakon iscrpljivanja s anti-humanim CD3 MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH) i kriokonzervirane. Nakon 1 do 2 tjedna kulture, frakcije umnoženih CD4þ T stanica raspoređene su u 96-pločice s jažicama, ovisno o broju antigena koji se analiziraju. Prije stimulacije antigenima, stanice su se odmarale najmanje 4 dana. Na dan stimulacije, stanice koje predstavljaju antigen su odmrznute i raspodijeljene u kulturu T-stanica u omjeru od najmanje 1 stanice koja predstavlja antigen na 100 CD4þ T stanica. Knjižnice CD4þ T-stanica za negativnu kontrolu (nestimulirane stanice) i pozitivnu kontrolu (stanice stimulirane SEB-om) uvijek su bile uključene u pokuse. CD4þ T stanice su stimulirane antigenom 4 dana, a proliferacija je određena korištenjem standardnog [3H]-timidinskog protokola.
Pojačani blasti T-stanica različito su reagirali na antigene prikazane visoko heterogenim scintilacijskim CPM-om; stoga je bila potrebna normalizacija praga proliferacije određenog kao z rezultat specifičan za davatelja. Z rezultat je izračunat kao 5 razlika od 75. i 25. percentila iznad medijana CPM nestimuliranih mikrokultura. Kao pozitivna kontrola poslužile su stanice u mikrokulturama stimuliranim SEB-om. Treba napomenuti da mikrokulture sa SEB indeksom stimulacije od<5 for="" peripheral="" blood="" samples,="" or="" 4="" for="" urinary="" samples,="" were="" excluded="" because="" it="" indicated="" poor="" cell="" viability.="" enumeration="" of="" the="" precursor="" frequency="" of="" antigen-specific="" cd4þ="" t="" cells="" was="" calculated="" using="" numbers="" of="" negative="" microcultures="" according="" to="" poisson="" distribution="" and="" expressed="" per="" 1="" million="" cells,="" as="" described="" previously.14="" the="" use="" of="" poisson="" distribution="" is="" based="" on="" the="" probability="" that="" at="" least="" 1="" cd4þ="" t="" cell="" is="" present="" in="" a="" single="" microculture="" of="" t-cell="" libraries="" when="" the="" radioactive="" signal="" was="" detected="" after="" antigen-specific="">
Periferne i urinarne ARTE metode
Slijedili smo protokol koji koristi CD154 MicroBead Kit (Mil-tenyi Biotec GmbH).35 Ukratko, stanice su stimulirane 7 sati s antigenima, a zatim obilježene anti-humanim CD154-biotinskim antitijelima i anti-biotinskim mikrozrncima prema prema uputama proizvođača. Označene stanice nanesene su na kalibrirane MS kolone (Miltenyi Biotec GmbH) kako bi se obogatile stanice koje eksprimiraju CD154-. Označavanje stanica s karboksifluorescein diacetat N-sukcinimidil esterom (Sigma Aldrich Chemie GmbH) učinjeno je prema standardnom protokolu.
Stvaranje jednostaničnih klonova
Jednostanični klonovi stvoreni su iz stanica reaktivnih na antigene, koje su obogaćene ekspresijom CD154 prema ARTE protokolu. Stanice s ekspresijom CD154- filtrirane su pomoću 30-mm preparativnog filtera (Miltenyi Biotec GmbH) i resuspendirane u 1 ml 20 posto (v/v) hladne fiziološke otopine puferirane fosfatom, 0,5 posto goveđeg serumskog albumina i 2 mM etilendiamintetraoctene kiseline. Stanice su bile pojedinačne stanice razvrstane prema fenotipu CD154þCD69þ, a pojedinačne razvrstane stanice uzgajane su u pojedinačnim jažicama 96-pločica s jažicama u prisutnosti hranidbenih stanica. Stanične kulture su održavane 3 do 4 dana dok nije postalo vidljivo nekoliko klonova. Jedan dan prije ponovne stimulacije, stanice koje predstavljaju antigen su odmrznute i raspodijeljene u kulturu T-stanica u omjeru od najmanje 1 stanice koja predstavlja antigen na 100 CD4þ T stanica. Stanice su stimulirane s 1 mg/ml antigena, a nestimulirani klonovi su služili kao negativna kontrola.
Analiza repertoara TCR sljedeće generacije temeljena na sekvenciranju
Genomska DNA izolirana je iz perifernih CD4þ T stanica i urinarnih stanica pomoću AllPrep DNA/RNA Micro Kita (Qiagen, Venlo, Nizozemska). Rekombinirani TCR-b lokus umnožen je prema prethodno opisanom protokolu.36 Očitavanja su obrađena pomoću IMSEQ-a,37 a jednaki klonotipovi grupirani su i dalje analizirani.
Statistika
Statistički testovi su provedeni sa softverom GraphPad Prism (Prism 8, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Primijenjena je Bonferronijeva prilagodba za višestruke usporedbe. Mann-Whitney U test i Wil-Coxonov signed-rank test korišteni su u eksperimentima s neovisnim i ovisnim skupom podataka. Nakon Bonferronijeve prilagodbe za višestruke usporedbe, izračun kritičnih P vrijednosti je ispravljen jer se temelji na broju planiranih usporedbi. P vrijednosti<0.01 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.01,="" **p="" <="" 0.005,="" and="" ***p="" <="" 0.0005.="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" spearman="" rank="" correlations="" by="" showing="" the="" absolute="" sledai="" values="" instead="" of="" ranked="" values="" to="" better="" provide="" an="" understanding="" of="" the="" correlation="" between="" the="" number="" of="" cells="" and="" disease="" activity.="" for="" correlation="" analysis,="" p="" values=""><0.5 were="" considered="" statistically="" significant="" with="" the="" following="" indication:="" *p="" <="" 0.05,="" **p="" <="" 0.01,="" and="" ***p="" <="" 0.001.="" when="" background="" frequencies="" were="" higher="" than="" the="" frequencies="" of="" nuclear="" antigen–reactive="" cd4þ="" t="" cells,="" the="" frequencies="" without="" background="" were="" defined="" as="" zero.="" a="" log(x="" þ="" 1)="" transformation="" was="" applied="" to="" the="" data="" set="" when="" it="" included="" zero="" values.="" supplemental="" patient="" data="" and="" statistical="" data="" are="" available="" in="" supplementary="" tables="" s1="" and="">
ZAHVALA
Zahvaljujemo Toralfu Kaiseru i Jenny Kirsch (Flow Cytometry and CellSorting Facility, Deutsches Rheuma-Forschungszentrum Berlin) na pomoći u protočnoj citometriji i sortiranju stanica. Potpora za ove studije osigurana je potporama DeutscheForschungsgemeinschaft u okviru Sonderforschungsbereich 650 toGR i potporama Deutsche Gesellschaft für Nephrologie i Programa kliničkih znanstvenika Charité – Universitätsmedizin Berlin i Berlinskog instituta za zdravlje PE.
