Metabolomska analiza temeljena na NMR-u za učinke suplementacije -ketoglutarata na mioblaste C2C12 u različitim energetskim stanjima

Kliknite ovdje da biste dobili Cistanche dodatke protiv starenja i umora

1. Uvod

Skeletni mišić je najveći organ u ljudskom tijelu i održava normalne životne aktivnosti.Dugotrajno vježbanjeili patologijal procesi bolesti uzrokuju oštećenje mišićailinedovoljna opskrba mišića energijom, u ovom je trenutku osobito važna obnova mišićne snage i funkcije. Različiti dodaci prehrani korišteni su za promicanje hipertrofije skeletnih mišića i poboljšanje sportske izvedbe [1]. Kao sjecište metabolizma organskog ugljika i dušika i istovremeno kritični intermedijer u TCA ciklusu, -ketoglutarat (AKG) je pokazao pleiotropne učinke za poboljšanje mišićne izvedbe u kliničkim eksperimentima i eksperimentima na životinjama [2-9]. Na primjer, AKG može smanjiti oštećenje crijevne sluznice [8] i upalu [9], ublažitirazvoj kolorektalnog karcinoma[4] i fibroze jetre [5], potiču rast [6] i smanjuju morbiditet iodgoditi starenje[7]. Prethodni radovi su pokazali da suplementacija AKG-om može ublažiti gubitak mišićne mase parenteralnom primjenom u traumatskom modelu pacijenata koji su podvrgnuti totalnoj zamjeni kuka [2], te pospješiti mišićnu hipertrofiju i sintezu proteina kroz Akt/mTOR signalne putove [10,11]. U slučaju Duchenneove mišićne distrofije, suplementacija AKG-om može spriječiti atrofiju i disfunkciju mišića putem PHD3/ADRB2-posredovanog puta [12]. Naš prethodni rad također je pokazao da dodatak AKG-a može značajno olakšati proliferaciju C2C12 mioblasta i ublažiti atrofiju C2C12 miotuba uzgojenih u mediju bez glukoze [13]. S obzirom da je glukoza glavni izvor energije za održavanje normalnih fizioloških funkcija skeletnih mišića, učinci suplementacije AKG-a za poboljšanje mišićne izvedbe uvelike ovise o razini glukoze u skeletnim mišićima. Razlike učinaka izazvanih AKG-om u skeletnim mišićima između različitih energetskih stanja nisu jasne.

AKG sudjeluje u sintezi aminokiselina, vitamina iorganske kiselineienergetski metabolizamu tijelu, što uključuje pretvorbu AKG u glutamat pomoću glutamat dehidrogenaze i naknadnu amidaciju glutamata s amonijakom pomoću glutamin sintetaze. AKG osigurava energiju za rast stanica putem TCA ciklusa i oksidativne fosforilacije te potiče metabolizam stanica i signalizaciju interakcijom sa svojim receptorom OXGR (receptor povezan s G proteinom) na staničnoj membrani [14,15]. Štoviše, AKG može regulirati oksidativni metabolizam mitohondrija i promicati permisivno epigenetsko stanje posredovanjem prijelaza ranog stanja embrionalne stanice i razvoja zametnih stanica [16]. Nadalje, AKG izazvan vježbanjem može stimulirati svoj receptor OXGR1 u nadbubrežnim žlijezdama da kontrolira termogenezu i razgradnju triglicerida u masnom tkivu i proizvede korisne učinke na metabolizam [17].

Međutim, malo je studija provedeno kako bi se otkrile metaboličke promjene skeletnih mišića izazvane AKG-om u različitim energetskim stanjima i temeljnim metaboličkim mehanizmima. Nedavno je korištena metabolomička analiza kako bi se sustavno razjasnili molekularni mehanizmi koji leže u osnovi blagotvornih učinaka dodataka prehrani. Izmjene metabolita koji djeluju kao nizvodni produkti transkripcije gena mogu intuitivno odražavati ukupne metaboličke promjene. Kao posebno prikladne tehnike za kvantitativno otkrivanje promjena razina metabolita u biotekućinama, tkivima i stanicama, spektroskopija visoke rezolucije 1H nuklearne magnetske rezonancije (NMR) opsežno se primjenjuje u metaboličkim analizama. Značajno je da metabolomičko profiliranje temeljeno na NMR-u ima nekoliko prednosti kao što su visoka ponovljivost, kvantitativno mjerenje bez predrasuda i prikladna priprema uzorka [18,19]. Prethodno smo proveli metabolomičke analize temeljene na NMR-u za razjašnjavanje učinaka suplementacije kreatina na mioblaste C2C12 [20] i učinaka suplementacije alanil-glutamina na mioblaste oštećene nedostatkom energije [21].

2. Rezultati

2.1. Proliferacija i diferencijacija mioblasta C2C12 uz dodatak AKG-a

Stanice mioblasta C2C12 uzgojene u normalnom mediju za rast sa i bez dodatka AKG grupirane su kao Nor-A i Nor, dok su one u mediju za rast s niskim sadržajem glukoze sa ili bez dodatka AKG grupirane kao Low-A i Low. U skladu s prethodnim istraživanjem [10], Nor-A stanice s dodatkom AKG-a u koncentraciji od 2 mm pokazale su značajno povećanu vitalnost stanica u odnosu na Nor stanice (Slika S1).

Stoga je koncentracija AKG-a od 2 mm korištena u pokusima za procjenu AKG-induciranih promjena u proliferaciji i diferencijaciji mioblasta. U usporedbi s Nor stanicama, Low stanice pokazale su znatno smanjenu stopu proliferacije zbog manjka energije (Slika 1A). Iako suplementacija AKG-om nije uzrokovala značajno različitu morfologiju mioblasta u dva energetska stanja, ne samo da je povećala stopu proliferacije Low stanica uzgojenih u mediju s niskim sadržajem glukoze, već je također poboljšala stopu proliferacije Nor stanica uzgojenih u normalnom mediju u skladu s prethodne studije [10,12]. Broj stanica po određenom području izbrojan je za četiri skupine mioblasta (n=4 za skupinu): Nor, 563,8 ± 10,4; Nor-A, 624,0 ± 10,8; Nisko, 493,8 ± 14,5; Niska A, 547,0 ± 11,7 (Slika 1B). Vrijedno je napomenuti da Low-A stanice nisu pokazivale statistički različite brojeve stanica od Nor stanica, što ukazuje da bi dodatak AKG-a mogao vratiti broj stanica za mioblaste u uvjetima kulture niske glukoze (Slika 1B).

Slika 1, Sposobnosti proliferacije i diferencijacije mioblasta C2C12 u uvjetima normalne i niske kulture. kulture glukoze. (A) Morfologija mioblasta. (B) Brojevi ćelija koji odgovaraju ploči A (n=4). (C) Stanična vijabilnost u odnosu na Nor stanice analizirana testom MTS stanične proliferacije (n=5). (D) Ekspresija MyoD1 u mioblastima analizirana Western blotom. Anti-GAPDH antitijelo korišteno je za standardizaciju količine proteina u svakoj stazi. (E) Statistička analiza koja odgovara pločama (D) (n=4). * p < 0.{{10}}5,** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.

Osim toga, proveden je MTS test da se kvantitativno usporedi stopa proliferacije četiri skupine stanica (Slika 1C). Stanice s niskim sadržajem glukoze imale su izrazito smanjenu stopu proliferacije u usporedbi s stanicama Nor, što ukazuje da medij s niskim sadržajem glukoze nije pogodovao proliferaciji stanica. Značajno je da je dodatak AKG-a povećao stopu proliferacije Nor-A i Low-A stanica u odnosu na Nor odnosno Low stanice. Imajte na umu da su Low-A stanice pokazale nižu sposobnost proliferacije od Nor stanica, što implicira da je dodatak AKG-a samo djelomično obnovio proliferaciju stanica uzgojenih u mediju s niskim sadržajem glukoze.

Ekspresija proteina miogene diferencijacije 1 (MyoD1) obično se koristi za karakterizaciju sposobnosti diferencijacije stanica. Stoga smo kvantitativno usporedili ekspresiju MyoD1 između četiri skupine stanica (Slika 1D). Niske stanice pokazale su znatno smanjenu sposobnost diferencijacije u usporedbi s Nor stanicama. Značajno je da je nadopuna AKG-om unaprijed regulirala sposobnosti diferencijacije stanica uzgojenih u normalnom mediju i u mediju s niskim sadržajem glukoze, kao što je naznačeno povećanjem ekspresije MyoD1 od oko 30 posto u stanicama Nor-A i Low-A. Značajno, Low-A stanice nisu pokazale statistički značajno različitu ekspresiju MyoD1 od Nor stanica, što ukazuje na visoku učinkovitost dodatka AKG za obnavljanje sposobnosti diferencijacije stanica uzgojenih u mediju s niskim sadržajem glukoze.

Nadalje, analizirali smo sposobnosti diferencijacije miotuba za četiri skupine mioblasta C2C12. Miotube su nastale fuzijom mioblasta uzgojenih u mediju za diferencijaciju s normalnim i niskim sadržajem glukoze sa ili bez dodatka AKG-a (Slika S3). Morfologije miotubusa C2C12 pokazale su da kultura s niskim sadržajem glukoze oslabljuje sposobnost stanica za diferencijaciju miotuba, a dodatak AKG-a mogao bi pospješiti diferencijaciju miotuba mioblasta uzgojenih u normalnom mediju iu mediju s niskim sadržajem glukoze.

2.2. NMR spektri vodenih ekstrakata C2C12 mioblasta

Tipični 1H NMR spektri od 850 MHz snimljeni su na vodenim ekstraktima dobivenim iz skupina Nor, Nor-A, Low i Low-A mioblasta C2C12 (Slika 2A). Ukupno 34 metabolita su dodijeljena i sažeta u tablici S1. Dodjeljivanje rezonancije metabolita potvrđeno je upotrebom 2D 1H-13C HSOC i 1H-H TOCSY spektara (slike S4 i S5). Vizualna inspekcija NMR spektra pokazala je da je uzgoj mioblasta s dodatkom AKG rezultirao značajnim nakupljanjem intracelularnog AKG u Nor-A i Low-A stanicama (Slika 2B).

Slika 2, prosječni spektri lH nuklearne magnetske rezonancije (NMR) od 850 MHz snimljeni na vodenim ekstraktima izvedenim iz skupina Nor, Nor-A, Low i Low-A mioblasta C2C12. (A) Usporedba prosječnih NMR spektara četiri skupine. Okomite ljestvice su održavane konstantnim u svim lH NMR spektrima. Vodeno područje (4.7-5.2 ppm) je uklonjeno (B) Lokalno pojačana područja vrhova a-ketoglutarata (AKG). Plava/zelena/žuta/crvena linija: spektralna područja iz skupina Nor/Nor-A/Low/Low-A. AKG, a-ketoglutarat; PC, O-fosfokolin; GPC, sn-glicero-3-fosfokolinUDP-glukoza, uridin difosfat glukoza: CTP, sn-glicero-3-fosfokolin; NAD plus, nikotinamid adenin dinukleotid AXP adenin mono/di/trifosfat.

2.3. Multivarijatna analiza podataka za istraživanje staničnih metaboličkih profila

Nadalje smo izvršili multivarijantnu analizu podataka o NMR spektralnim podacima za metaboličko profiliranje četiriju skupina mioblasta C2C12. Najprije smo uspostavili tri nenadzirana modela PCA s prve dvije komponente (PC1, PC2) kako bismo pregledali trendove grupiranja i otkrili metaboličke razlike između skupina mioblasta. Dijagrami rezultata ThePCA pokazuju da se metabolički profil stanica uzgojenih u mediju s niskim sadržajem glukoze jasno razlikuje od profila uzgojenih u normalnom mediju (Slika 3A), a suplementacija AKC-om značajno je promijenila metaboličke obrasce stanica uzgojenih u normalnom mediju i u mediju s niskim sadržajem glukoze (Slika 3B,C). Međutim, metabolička razlika između skupina Nor-A i Nor bila je veća od one između skupina Low-A i Low, što implicira da učinci dodavanja AKG-a na metabolički profil mioblasta uvelike ovise o energetskom stanju stanica.

Slika 3. Multivarijantne analize za HNMR spektre snimljene su na vodenim ekstraktima dobivenim iz C2C12 mioblasta Nor, Nor-A, Low i Low-A skupina. (AC) PCA bodovi za skupine Low i Nor, skupine Low-A i Low, skupine Nor-A i Nor; (DF) OPIS-DA ocjenjuje grafikone niskih i niskih skupina (R2: 0.999, 02: 0.996), niskih A i niskih skupina (R2: 0.918: 02: 0.761), skupine Nor-A i Nor (R2: 0,927: 02: 0,838). Elipse označavaju granicu pouzdanosti od 95 posto.

Nadalje, uspostavili smo tri nadzirana OPLS-DA modela za ilustraciju metaboličkih odvajanja između četiri skupine mioblasta (Slika 3D-F). Kao što se i očekivalo, OPLSDA modeli maksimizirali su metaboličke razlike između četiri skupine rezerviranjem koreliranih informacija o ortogonalnim varijablama i filtriranjem informacija o nekoreliranim ortogonalnim varijablama. Nadalje, proveli smo nasumične testove permutacije (n=200) kako bismo procijenili pouzdanost OPLS-DA modela (Slika S6), koji ukazuju na valjanost uspostavljenih OPLS-DA modela.

2.4. Identifikacije diferencijalnih i važnih metabolita

Kako bismo kvantitativno usporedili razine metabolita između četiri skupine mioblasta C2C12, izračunali smo relativne razine identificiranih metabolita na temelju njihovih relativnih integrala (Tablica S2). Dodatak AKG-a dramatično je povećao unutarstanične razine AKG-a u Nor-A i Low-A skupinama, ali nije značajno promijenio one u Nor i Low skupini. Proveli smo Studentov t-test za identifikaciju različitih metabolita s kriterijem p < 0.05 (Slika 4). Usporedba Nora i Lowa identificirala je 29 različitih metabolita (Slika 4A), uključujući 18 poboljšanih metabolita (leucin, izoleucin, valin, acetat, glutamat, glutamin, metionin, aspartat, lizin, kreatin, PC (O-fosfokolin)taurin, tirozin , fenilalanin, histidin, NAD plus, format, AXP), a 11 je odbilo Metabo. lite (glutation, piroglutamat, fosfokreatin, beta-alanin, GPC, glukoza, glicin, acetat, treonin, GTP, UDP-glukoza). Usporedba niskog A u odnosu na nisko identificirane diferencijalne metabolite (Slika 4B), uključujući 7 povišenih metabolita (etanol, AKGbeta-alanin, PC, taurin, glicin i GTP) i 3 smanjena metabolita (glutamin, lizin i mioinozitol). Usporedba Nor-A naspram Nora identificirala je 18 različitih metabolita (Slika 4C), uključujući 6 metabolita koji su regulirani prema gore (AKG, piroglutamat, glutamin, lizin, glukoza, laktat) i 12 metabolita koji su regulirani prema gore (alanin, acetat, glutation metionin, fosfokreatin, PC, mioinozitol, glicin, treonin, GTP, UDP-glukoza i AXP).

Slika 4. Relativni intenziteti različitih metabolita identificirani su usporedbom po parovima između četiri skupine mioblasta C2C12. (A) Nisko u odnosu na Nisko; (B) Low-A naspram Low; (C) Nor-A protiv Nor. * p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0,001, **** p < 0,0001.n { {13}} za svaku grupu.

Nadalje, upotrijebili smo OPLS-DA modele za identifikaciju važnih metabolita s kriterijem VIP > 1 (Slika 5). Ukupno je identificirano 12, 10 i 10 važnih metabolita iz OPLS-DA modela Nor-A naspram Nor, Nor naspram Low, Low-A naspram Low.

Slika 5. VIP rezultati važnih metabolita identificirani su iz parnih usporedbi između četiri skupine C2C12mioblasta. (A) Nisko u odnosu na Nisko; (B) Low-A naspram Low; (C) Nor-A protiv Nor. Crveni/plavi font označava povećane/snižene razine metabolita.

Kombinacija identificiranih važnih metabolita i diferencijalnih metabolita dala je karakteristične metabolite (Tablica 1). Usporedbe parova Low naspram Nora, Low-A naspram Lowa i Nor-A naspram Nora identificirale su 10, 6 odnosno 10 karakterističnih metabolita, što ukazuje da su učinci suplementacije AKG-a na mioblaste usko povezani s energijom stanje stanica.

2.5. Identifikacija značajno promijenjenog metabolizma

Putovi Proveli smo analizu metaboličkih putova kako bismo identificirali značajno izmijenjene metaboličke putove (značajne putove) na temelju razina metabolita identificiranih iz parnih usporedbi između četiri skupine mioblasta C1C12 (Slika S7; Tablica 2 i Tablica S3). Analiza Nor vs. Low identificirala je 11 značajnih puteva: (1) metabolizam alanina, aspartata i glutamata; (2) metabolizam glicina, serina i treonina; (3) Metabolizam glutationa; (4) metabolizam D-glutamina i D-glutamata; (5) Metabolizam škroba i saharoze; (6) metabolizam beta-alanina; (7) Metabolizam taurina i hipotaurina; (8) Metabolizam fenilalanina; (9) Biosinteza fenilalanina, tirozina i triptofana; (10) Metabolizam nikotinata i nikotinamida; (11) Metabolizam histidina. Ovaj značajan put bio je povezan s energetskim metabolizmom, oksidativnim stresom i anaplerotskim protokom TCA ciklusa.

Analiza Nor-A u odnosu na Nor identificirala je samo prvih pet značajnih putova 1-5 isključujući ostalih šest putova 6-11. S druge strane, analiza Low-A naspram Low-a identificirala je samo šest značajnih putova: prva četiri puta 1-4 podijeljena usporedbama Low-A naspram Nor, Nor-A naspram Nor; dva puta 6–7 zajednička usporedbom Low naspram Nor. Imajte na umu da dodatak AKG-a nije značajno promijenio put 5 (metabolizam škroba i saharoze) u stanicama uzgojenim u mediju s niskim sadržajem glukoze, ali je ometao dva druga puta (metabolizam beta-alanina i metabolizam taurina i hipotaurina). Kako bismo vizualizirali promjene karakterističnih metabolita izazvane AKG-om, projicirali smo te metabolite na metaboličku kartu temeljenu na bazi podataka Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) (Slika 6). KEGG se opsežno koristi kao jedan od glavnih izvora podataka za rekonstrukciju metaboličkih mreža i naglašava značajne metaboličke putove. I promijenjeni karakteristični metaboliti i značajno promijenjeni metabolički putovi pružaju nove uvide u molekularne mehanizme koji leže u pozadini učinaka suplementacije AKG-a na mioblaste C2C12.