Višebojna slika proteina koji vežu kalcij u ljudskim bubrežnim kamencima za razjašnjavanje učinaka proteina na rast kristala
Mar 21, 2022
Bubregkamenac je čest poremećaj koji pogađa 1,7-14,8 posto stanovništva barem jednom u životu1,2. U do 50 posto slučajeva ova se bolest ponavlja unutar 5 godina od prve epizode. Unatoč važnosti ovog zdravstvenog problema, preventivna terapija za stvaranje kamenca je nedostupna. Razumijevanje patogenezebubregstvaranje kamenca bitno je za smanjenje pojave i ponovnog pojavljivanjabubregkamenac bolest3. Otprilike 80 postobubregkamenci su kamenci od kalcijeva oksalata (CaOx)4,5. CaOx kamenje sastojalo se od ~90 posto mineralne faze, tj. CaOx koji se dalje kategorizira u kalcijev oksalat monohidrat [Ca(C2O4)·H2O](COM) i kalcijev oksalat dihidrat [Ca(C2O4)·2H2O](COD), i relativno mali dio organske tvari, koji se smatra Odjel za nefro-urologiju, Fakultet medicinskih znanosti, Sveučilište Nagoya City, 1-Kawasumi, Mizuho-cho, Mizuho-Ku, Nagoya 467-8601, Japan . 2Institut za napredne studije ko-kreacije, Sveučilište Osaka, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan. 3Graduate School of Engineering, Osaka University, 2-1, Yamadaoka, Suita 565-0871, Japan. 4Graduate School of Life and Environmental Sciences, Kyoto Prefectural University, 1‑5, Hangi‑cho, Shimogamo, Sakyo‑ku, Kyoto, Kyoto 606‑8522, Japan. 5Odjel za znanost o Zemlji, Sveučilište Tohoku, 6‑3 Aza‑Aoba, Aramaki, Aoba‑ku, Sendai 980‑8578, Japan. 6Nacionalni muzej prirode i znanosti, 4‑1‑1 Amakubo, Tsukuba 305‑0005, Japan. 7 Institut za zdravstvena i medicinska istraživanja, Nacionalni institut napredne industrijske znanosti i tehnologije (AIST), 2217-14, Hayashi-cho, Takamatsu, Kagawa 761-0395, Japan. 8Tajiri Thin Section Laboratory, 3‑1‑11 Sannose, Higashiosaka, Osaka 577‑0849, Japan. 9Institut za lasersko inženjerstvo, Sveučilište Osaka, 2-6, Yamadaoka, Suita City, Osaka 565-0871, Japan. *E-pošta: maruyama@cryst.eei.eng.osaka-u.ac.jp; a-okada@med.nagoya-cu.ac.jp
Ključne riječi:bubreg; bubrežni kamenac; bolest bubrega; bubrežni; fiziologija bubrega
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
kao proteinska matrica6. Patogeneza odbubregStvaranje kamenca uključuje procese u više koraka koji uključuju složene interakcije između mineralnih komponenti i proteinske matrice7,8. Identificirano je više od 100 vrsta proteinabubregkamenje9–11. Među njima, poznato je da nekoliko proteina, posebno proteini koji vežu kalcij, igraju bitnu ulogu u procesima stvaranja CaOx kamenaca12-16. Specifični učinci ovih proteina intenzivno su istraživani u mnogim koracima formiranja kamenca, uključujući nukleaciju kristala, rast kristala, agregaciju kristala i adheziju kristala, uz brojne in vitro studije kristalizacije17-19. Studije in vitro korisne su za procjenu učinaka specifičnih proteina na specifične korake u formiranju kamenaca. Međutim, u stvarnom okruženju za stvaranje kamenca, broj proteina radi istovremeno, a sastav urina u koncentracijama proteina, iona kalcija i oksalata varira. Ova zabrinutost motivirala nas je da istražimo pravog čovjekabubregkamenja kako bi pronašli stvarne učinke proteina na rast kristala. U većini prethodnih studija, identifikacija proteina ububregkamenja provedena je masenom spektroskopijom nakon drobljenja i ekstrakcije9-11. Time se gubi informacija o prostornom rasporedu proteina u kamenu. U vrlo ograničenim istraživanjima, identifikacija proteina ububregkamenaca provedeno je s narezanim dijelovima bubrežnih kamenaca u kojima su kristali CaOx potpuno uklonjeni dekalcifikacijom20,21. Ovaj pristup je koristan za pronalaženje distribucije proteina ububregkamenaca što potencijalno pomaže u razumijevanju specifičnih učinaka proteina na stvaranje kamenaca. Međutim, ogromna količina podataka o kamenoj formaciji, zabilježena ububregkamenih kristala, gubi se ovom metodom. Važnost mineralnih informacija o bubrežnim kamencima koje se mogu dobiti identifikacijom kristalnih faza i klasifikacijom kristalne teksture provedenom korištenjem presjeka i poliranih tankih presjekabubregkamenja s optičkom mikroskopijom pokazalo je više od 70 godina prethodnih studija22,23.
Nedostatak analize za procjenu distribucije proteina s netaknutim CaOx kristalimabubregkamenja bila je znatna prepreka za razumijevanje nastanka kamena. Koordinirana procjena distribucije proteina i kristalnih faza/morfologija može pružiti značajne informacije o povijesti nastanka kamenaca. Višestruko imunofluorescentno bojenje (multi-IF bojenje) korišteno je za prikaz distribucije dva ili više proteina u mnogim vrstama mekih tkiva bioloških uzoraka24. Primjena tehnike na koštana tkiva, koja se sastoje od poroznih kristala kalcijevog fosfata, također je pružila značajne uvide u dinamičku regulaciju mineralne homeostaze kosti25. Međutim, to nije korišteno za istraživanjebubregkamenje sastavljeno od gustih i tvrdih kristala, iako je korišteno jedno imunofluorescentno bojenje da se pokaže distribucija specifičnog proteina u dekalcificiranombubregkamenje koje ne zadržava informacije o mineralima20,21. Ova studija istraživala je uvjete koji omogućuju višestruko IF bojenjebubreguzorci kamena kako bi se zadržala izvorna informacija o mineralu. Istraživali smo distribuciju triju različitih proteina, osteopontina (OPN),bubrežniprotrombinski fragment 1 (RPTF-1), i kalgranulin A (Cal-A), u tankim presjecima CaOx kamenaca. Ti su proteini uobičajeni u većini CaOx kamenaca i poznati su kao proteini koji vežu kalcij koji potencijalno utječu na stvaranje CaOx kamenaca26-28. Koliko znamo, ovo je prva studija u kojoj se više proteina matriksa ko-vizualizira ububregkamen. Nadalje tumačimo različite in vivo učinke svakog proteina na rast CaOx kristala na temelju njihove distribucije, fizikalno-kemijskih svojstava i složenih promjena fizičkog okruženja svakog proteina tijekom formiranja CaOx kamenca.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREŽNU DIJALIZU
Rezultati
Na temelju mikroskopskog promatranja u kombinaciji s FT-IR analizom, domenebubreguzorci kamena kategorizirani su u tri vrste tekstura koje su u skladu s onom koju su prijavili Schubert i Brien23: nepravilna tekstura sastavljena od euedralnih COD kristala (Tip 1, koji se naziva euedralni COD agregat; sl. 1c), mozaička tekstura sastavljena od nepravilno orijentiranih COM kristali (Tip 2, koji se nazivaju mozaični COM; Slika 1f), i koncentrično laminirani COM kristali (Tip 3, koji se nazivaju koncentrični COM; Slika 1i). Većina promatranih uzoraka CaOx kamena sastojala se od ove tri teksture (Tablica 1). Multi-IF protokol bojenja koji se koristi za biološke uzorke primijenjen je na analizu tankih presjekabubreguzorci kamena pripremljeni tipičnom geološkom metodom. Za primjenu, uvjeti jetkanja tankog presjeka prije bojenja su podešeni i utvrđeno je da je vizualizacija bila uspješna samo kada je polirani tanki dio bio lagano nagrizan (s otopinom citrata pH 6.0 tijekom 1 minute ) prije tipičnog procesa bojenja. Multi-IF bojanje omogućilo je kovizualizaciju triju proteina u različitim bojama (OPN: zelena, RPTF-1: plava i Cal-A: crvena) u tri različite teksture kamena.
Otkrili smo da svaki protein pokazuje karakterističan uzorak distribucije ovisno o njegovom položaju u COM i COD. U 7 od 15 uzoraka pronađeni su euedarski KPK agregati (Tablica 1). Euedarski COD agregati bili su prisutni pretežno na periferiji CaOxbubregkamenje (sl. 1a–c). Poznato je da ovi COD kristali imaju tetragonalni oblik bipiramide sastavljen od {101} lica29. Mnoge od COD bipiramida također imaju {110} lice na vrhu obiju piramida (Slika 2b i Dodatna slika S1). Slika COD kristala s višestrukim IF bojanjem prikazana je na slici 2a, a OPN se povremeno pojavljuje na {110} strani COD-a, kao što je prikazano bijelim strelicama na slici 2c. Ovo lice je isto lice vrha bipiramide koje se ne pojavljuje u tipičnom COD in vitro rastu kristala29. RPTF-1 pojavio se kao paralelni slojevi duž {101} lica, s intervalima na skali od µm, kao što je prikazano žutom strelicom na slici 2d. Ovo kristalno lice karakteristično je za tipični COD rast29. Cal-A je bio prisutan izvan COD kristala, ne pokazujući nikakvu preferencijalnu adsorpciju na određenim stranama (slika 2e). Isti obrasci distribucije viđeni su u drugim uzorcima kamena (dopunska slika S2). Mozaična COM tekstura najzastupljenija je tekstura u CaOx kamenju (Slika 1d–f). Ovakva je tekstura uočena u 12 od 15 uzoraka (Tablica 1). Multi-IF bojanje mozaika COM prikazano je na sl. 3a,b. OPN i RPTF-1 bili su prisutni u svim COM kristalima (sl. 3c,d). Suprotno tome, Cal-A je bio isključivo prisutan duž granica zrna (tj. na površinama COM zrna) (Sl. 3e). Nadalje smo analizirali profil intenziteta linija proteina, kao što je prikazano na slici 3a, kako bismo detaljno procijenili svaki uzorak distribucije proteina (žuta linija na slici 4a). OPN i RPTF-1 pokazali su veći intenzitet u kristalnom području, dok je Cal-A pokazao niži intenzitet u
kristalno područje (slika 4b). Visoki intenzitet Cal-A opažen je isključivo duž granica kristala. Ove distribucije proteina viđene su u mnogim uzorcima, iako su se veličine i oblici COM zrna razlikovali (dopunska slika S3). Koncentrični COM također je tipična tekstura u CaOx kamenju (Sl. 1g–i). Ovu smo teksturu pronašli u 10 uzoraka od 15 (Tablica 1). OPN, RPTF-1 i Cal-A raspoređeni su u koncentričnim slojevima (slika 5a). OPN i RPTF-1 bili su prisutni kao konstantni i pravilni slojevi kroz COM kristale, čineći interval na skali od µm (Slika 5b,c). Nasuprot tome, distribucija Cal-A bila je sastavljena od nepravilnih slojeva s relativno širokim intervalima smještenih na vanjskoj površini kamena (Sl. 5d). SEM promatranje pokazalo je sloj praznine blizu svakog Cal-A sloja (Sl. 6a,b). Obje površine koje stvaraju prazninu bile su zauzete sitnim naslagama koje su se jasno razlikovale od glavnih COM kristala koji sačinjavaju koncentrični COM (sl. 6c,d). Profili intenziteta linija ovih proteina u koncentričnom COM-u pokazali su skokove u profilima svakog proteina (sl. 4c,d). Profili OPN i RPTF-1 bili su slični (tj. 5,58±2,70 µm/sloju OPN-a i 5,99±2,56 µm/sloju RPTF-1) (dodatna tablica S1). Međutim, slojevi Cal-A imali su izrazito velike intervale (tj. 23,17±18,57 µm/sloju) nego OPN i RPTF-1. Slični obrasci distribucije i intervali viđeni su u većini od ostalih 9 uzoraka, iako sloj Cal-A nije viđen u nekoliko uzoraka (dopunska slika S4 i tablica S1).
U ovoj studiji, udjeli triju tekstura u CaOx kamencima i distribucije triju proteina u trima teksturama nisu imali jasnu vezu s dobi i spolom kamenca, iako količina istraživanih kamenaca nije bila dovoljna za analizu korelacije. . Poznato je da su OPN, RPTF-1 i Cal-A prisutni u CaOx kamencima na temelju detekcije iz ekstrakata kamenog praha elektrolizom9-11. Mikrorazdiobe OPN-a u dekalcificirajućim CaOx kamencima imunocitokemijskom tehnikom pokazale su OPN distribucije u koncentričnim lamelama u CaOx kamencima21,30. Sadašnja metoda živopisno je vizualizirala lokacije tri različita proteina u prethodno smatranim "organskim slojevima" (Slika 7a,b). Uzorak distribucije OPN-a koji prikazujemo u ovoj studiji u koncentričnom COM-u u skladu je s prethodnim opažanjima. Nadalje smo otkrili da je distribucijski uzorak RPTF-1 u koncentričnom COM-u gotovo isti kao i kod OPN-a, dok je distribucija RPTF-1 u COD kristalima različita od distribucije OPN-a. Suprotno tome, uzorak distribucije Cal-A potpuno je drugačiji od druga dva proteina. Ove različite distribucije OPN-a, RPTF-1 i Cal-A na mikro skali bilježe povijest formiranja CaOx kamenca.
Rasprava
Primarni kontrolni čimbenik ugradnje proteina u kristale.I OPN i RPTF{{0}} bili su prisutni u euedralnim COD kristalima, mozaičnim COM zrncima i koncentričnim COM (slike 2a, 3a i 5a). Ovo otkriće potvrđuje da su ovi proteini ugrađeni iu kristale COD i COM. Cal-A je bio prisutan na vanjskoj strani euedralnih COD kristala i oko mozaičnih COM zrna (Slike 2e i 3e). U slučaju koncentričnog COM-a, praznina koja se obično nalazi oko slojeva Cal-A sugerira da slojevi Cal-A nisu uključeni u kristale, već su raspoređeni na površini kristala (slike 5d i 6a–d). Ove distribucije pokazuju da se OPN i RPTF-1 ugrađuju u kristale CaOx, dok se Cal-A jedva ugrađuje. Na adsorpciju i ugradnju proteina u kristale CaOx teoretski utječu sila vezivanja njihovih bočnih lanaca aminokiselina i druga specifična svojstva odgovarajućih proteina kao što je elektrostatički negativni naboj31,32. Neto naboj pokazuje da su OPN i RPTF-1 negativnije nabijeni od Cal-A, s izoelektričnim točkama OPN, RPTF-1 i Cal-A od 3,5, 2,5–3.{{28} }, odnosno 6,5–7,033–35. Poznato je da OPN, RPTF-1 i Cal-A imaju domene koje vežu kalcij36-38. Ove domene mogu dodatno djelovati kao lokalna mjesta vezanja na rastuće kristalne površine. Domene za vezanje kalcija OPN, RPTF-1 i Cal-A mogu vezati 10, 7, odnosno 2 iona kalcija36-38. Dakle, skupni i lokalni afiniteti ovih proteina prema pozitivno nabijenom Ca na površini CaOx uzrokuju različitu učinkovitost inkorporacije ovih proteina u CaOx, rast kristala nastavlja se ugradnjom jedinica rasta u stepenice i mjesta savijanja koja se pojavljuju na kristalnim površinama39,40 . Odredit će trodimenzionalne kompatibilnosti između proteina i rastućih kristalnih površina
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA
opseg inkorporacije proteina u površinu kristala. Proteini sa snažnom sposobnošću vezanja na rastuća mjesta i korake pregiba imaju tendenciju da se učinkovitije ugrade u rastući kristal41-43. Trenutno objavljene distribucije i afiniteti triju proteina prema kalciju sugeriraju da jaki afinitet OPN i RPTF-1 olakšava vezanje i ugradnju u COD i COM kristale. Nasuprot tome, Cal-A, koji ima niži afinitet, samo prianja uz površinu kristala, ali nije ugrađen u kristal. Prethodno istraživanje koje je pokazalo veće stope ugradnje peptida u COM s više fosforiliranih peptida podupire ovo objašnjenje43. Ove bi nam rasprave omogućile predviđanje distribucije mnogih drugih proteina na temelju njihovih svojstava vezanja kalcija.
In vivo selektivna apsorpcija i inhibitorni učinci OPN i RPTF‑1 na rast kristala CaOx.Za euedarske COD kristale koji su pretežno prisutni na periferiji CaOx kamena smatra se da rastu s karakterističnom laminiranom teksturom u kojoj se takozvani "sloj organske tvari" i "mineralni sloj" izmjenjuju tijekom rasta kristala44,45. Iako točni razlozi koji leže u pozadini pomaka slojeva ostaju nejasni, potencijalna objašnjenja uključuju promjene okoliša u ljudskom domaćinu,bubregfiziologije i biokemijskih promjena urina te kinetičkih povratnih mehanizama koji tvore oscilatorne zonske strukture koje se nalaze u mineralima8. Trenutačni rezultati pokazuju da OPN i RPTF-1 konstruiraju laminiranu teksturu koja odgovara {110} i {101} stranama COD kao unutarkristalni proteini, dok Cal-A nije uključen u laminiranu teksturu (Sl. 2c –e). Ovaj in vivo dokaz površinske selektivne adsorpcije/inkorporacije proteina na/ububregkamenih kristala ukazuje da distribucije proteina nisu identične tradicionalnom "sloju organske tvari" promatranom optičkom mikroskopijom (Sl. 7a). In vitro dokaze o selektivnoj adsorpciji OPN na COD kristalu izvijestili su Chien et al. (2009. i 2018.)46,47. Prema tim izvješćima, OPN se veže na tipično kristalografsko {110} lice COD-a i ugrađuje se u mineralnu fazu, što je u skladu s našim rezultatima (Sl. 7b). Površinska selektivna adsorpcija/inkorporacija vjerojatno je rezultat sposobnosti vezanja kalcija svakog proteina i/ili različitih molekularnih kompatibilnosti između funkcionalnih skupina na molekulama proteina i rasporeda iona rešetke na svakoj površini kristala.
Većina proteina navodno inhibira rast CaOx kristala tijekom formiranja kamenca48,49. Inhibicija rasta kristala peptidima smatra se kroz postupno pričvršćivanje i/ili blokiranje kink-a41-43. U prethodnim in vitro studijama poznato je da su OPN i RPTF-1 inhibitori rasta kristala CaOx48,49. Međutim, opseg inhibicije ububregformiranje kamena ostaje nejasno.
Sadašnje opažanje pokazuje da većina COD kristala bubrežnog kamenca ima tipičnu strukturu kristala s {101} stranama (slika 2b). Kristalne površine koje imaju relativno spore stope rasta općenito su dobro razvijene40. Ovo financiranje ukazuje na to da je stopa rasta {101} lica COD-a spora u usporedbi s drugim površinama (npr. {110}). Preferencijalna adsorpcija RPTF-1 koja je potencijalno usporila rast kristala ugrađenom u COD pronađena je kao laminirana struktura zajedno s {101} stranama (Sl. 2d). S druge strane, pronašli smo {110} lica kao OPN laminirane strukture unutar COD kristala (Sl. 2c). Površine {110} pojavile su se jer je laminirana struktura OPN-a razvijenija od površina {110} COD kristala bez OPN-a dobivenih in vitro studijom46. Lice {110} COD-a s preferencijalnom adsorpcijom OPN-a nije kristalno lice koje se pojavljuje na COD-u tipične kristalne navike47. Dakle, apsorpcija OPN-a na {110} izuzetno bi usporila relativnu stopu rasta površine, a usporavanje je bilo dovoljno sporo da se pojave lica {110}. Pojava {110} lica, drugim riječima, mijenja opću naviku kristala u mnogim uzorcima bubrežnih kamenaca. Kristali COM pojavljuju se ili kao mozaična tekstura ili kao koncentrična tekstura (sl. 3a i 5a). I OPN i RPTF-1 su homogeno prisutni u COM zrncima u teksturi mozaika (Sl. 3c,d). Dakle, učinci ovih proteina na stopu rasta ove vrste COM nisu jasni. U koncentričnom COM-u, kristali nalik letvicama radijalno poredani od središta prema van50. Lica kristala kristala poput letvica nisu jasna, ali vanjska površina sferičnog COM-a koji je izložen urinu trebala bi imati ista kristalografska lica. Sadašnji rezultati jasno pokazuju da OPN i RPTF-1 imaju slične profile distribucijskih linija u kojima se periodički distribuiraju u koncentričnom COM kao slojevi intervala na skali od približno 4 do 6 µm (slike 4c,d, 5b,c i Dodatna tablica S1). To ukazuje da OPN i RPTF-1 imaju zanemarivu razliku u adsorpciji i inkorporaciji na specifičnim kristalnim stranama COM izloženog urinu. Prethodni in vitro radovi pokazali su da OPN ima inhibicijski učinak na rast COM {100}, {121} i {010} lica 51. Kada se ovaj inhibicijski učinak uzme u obzir, sadašnji rezultat pokazuje da je koncentrični rast COM bio inhibiran OPN-om a moguće i pomoću RPTF-1 jer RPTF-1 ima sličan kapacitet vezanja kalcija i stoga ima sličnu učinkovitost ugradnje kao COM.
Slika 7. Shema distribucije proteina u tri glavne teksture u CaOx. (a) Distribucija proteinske matrice razmatrana je u prethodnim studijama (bijela boja: mineralna faza crna boja: organska tvar). (b) Specifična distribucija proteina pronađena u ovoj studiji (zeleno: osteopontin (OPN), plavo: bubrežni protrombinski fragment 1 (RPTF-1) i crveno: kalgranulin A (Cal-A). Tip1 idiomorfni COD, tip2 mozaik COM, i Tip3 koncentrično laminirani COM.
In vivo inhibicijski učinci Cal-A na rast kristala CaOx.Adsorpcija Cal-A na specifičnim stranama kristala COM i COD kristala nije vidljiva u ovom rezultatu (slike 2a i 3a). Cal-A ima manji kapacitet vezanja kalcija od OPN i RPTF-1 i bio je prisutan na vanjskoj strani euedralnih COD kristala i oko mozaičnih COM zrnaca bez laminirane strukture (slike 2a,e i 3a,e). Međutim, poznato je da Cal-A inhibira rast kristala CaOx in vitro studija28. Dakle, Cal-A je možda djelovao kao molekula surfaktanta koja utječe na morfologiju i brzinu rasta kristala bez ugradnje u kristal39,40,52. U normalnim uvjetima urina (tj. bez nepravilno visoke koncentracije Cal-A), Cal-A može imati manji inhibitorni učinak od OPN i RPTF-1 na rast kristala COM i COD od OPN i RPTF{{17} } inhibiraju razvoj stepenica na plohama kristala pričvršćivanjem i/ili blokiranjem ugradnjom u kristale. Stoga bi kapacitet proteina u bubrežnim kamencima za vezanje kalcija pomogao u procjeni opsega njihovih inhibicijskih učinaka na rast CaOx. U koncentričnom COM-u, Cal-A je pokazao neperiodične slojeve koji su imali udaljenosti od 20 do 50 µm (slike 4c,d). , 5d i dodatna tablica S1). Cal-A je identificiran u urinu onih koji stvaraju kamenac28. Stoga bi se prirodno trebale pojaviti fluktuacije u njegovoj koncentraciji u mokraći. Međutim, zbog nižeg afiniteta prema ionima kalcija, male fluktuacije u koncentraciji Cal-A možda neće biti zabilježene u COM teksturi. Cal-A se izlučuje u urinu nepovremeno kao protuupalni proteini kao odgovor na upalu53,54. Dakle, neperiodični slojevi Cal-A mogu zabilježiti povremene visoke koncentracije Cal-A u urinu zbog nepravilnih promjena u okolišu, kao što su infekcija, ozljeda i krvarenje. Njegov inhibitorni učinak na rast COM-a uvelike bi ovisio o njegovoj koncentraciji oko rastućih kristala jer nekoliko peptida ima takvu ovisnost o rastu kristala kalcita42. Cal-A može slabo usporiti rast COM djelomičnim zauzimanjem rastuće površine kada je njegova koncentracija oko kristala niska jer protein nije sklon ugradnji u CaOx. U koncentričnom COM-u, prazni slojevi okruženi sitnim naslagama pronađenim SEM promatranjem predstavljaju gotovo identična mjesta kao slojevi Cal-A pronađeni multi-IF snimanjem (sl. 6a-d). Stoga, kada sloj Cal-A postane debeo zbog svoje nepravilno visoke koncentracije zbog nekih bioloških promjena, Cal-A može djelovati kao snažan inhibitor rasta CaOx zauzimajući široku površinu rastuće površine. Upala, koja je okidač izlučivanja Cal-A, također može utjecati na različite korake stvaranja kamenca jer je vrsta bijelih krvnih stanica (tj. makrofaga) koja ima pospješujući i inhibicijski učinak na stvaranje bubrežnih kamenaca pronađena u eksperimentima koji koriste model bubrežnog kamenca miš16.
Moguća primjena multi-IF snimanja na cjelokupno stvaranje bubrežnih kamenaca.Ovaj rad proširio je primjenu multi-IF snimanja proteina na tvrđe biomineralne uzorke, tj. bubrežne kamence. Nukleacija kristala, rast kristala, agregacija kristala i adhezija kristala smatraju se važnim koracima u stvaranju bubrežnih kamenaca. OPN, RPTF-1 i Cal-A navedeni su kao inhibitori nukleacije, rasta i agregacije CaOx u in vitro studijama48,49. Sadašnja proširena primjena multi-IF snimanja pruža in vivo dokaz o inhibicijskom učinku rasta CaOx proteina koji je impliciran prethodnim in vitro studijama. Istraživanja učinaka proteina u svakom koraku provedena su in vivo studijama na miševima, kao i brojnim in vitro studijama14,15,26. Na primjer, kritična renoprotektivna uloga OPN-a kao inhibitora stvaranja kristala i inhibitora adhezije kristala objavljena je na temelju in vivo pokusa na miševima26, dok je poticanje adhezije kristala na tubularne epitelne stanice putem OPN-a i povećanje CaOx kamenca zabilježeno je na temelju novijih in vivo eksperimenata upotrebom OPN-nokautiranih miševa14,15. Potpuno drugačija kristalna morfologija pronađena u bubrežnim kamencima OPN-nokaut miša također podržava učinke OPN-a u više koraka stvaranja bubrežnih kamenaca. Sadašnja metoda vizualizacije bila bi korisna u procjeni učinaka proteina u ovim in vitro studijama na miševima, pa čak i korisna u procjeni različitih koraka stvaranja bubrežnih kamenaca kod ljudi. Ova bi nam nova analiza omogućila tumačenje in vivo učinaka različitih proteina na formiranje CaOx kamenaca, što može otvoriti put za patološki pregled i personaliziranu medicinu za liječenje bolesti bubrežnih kamenaca kod ljudi.
Metode
Etička izjava. Istraživački projekt predstavljen u ovom radu odobrio je institucionalni revizijski odbor diplomskog medicinskog fakulteta Sveučilišta Nagoya City. Sve metode provedene su u skladu s relevantnim smjernicama i propisima. Pisani informirani pristanak svih subjekata dobiven je u skladu s postupcima koje je odobrio odbor etičkog povjerenstva.
Sakupljanje kamena i priprema kamenih presjeka. Bubrežni kamenci prikupljeni su od pacijenata i analizirani na gradskom sveučilištu Nagoya u Japanu. Petnaest CaOx uzoraka bubrežnih kamenaca odabrano je iz naših tisuća kolekcija ljudskih bubrežnih kamenaca na temelju podataka skupne infracrvene spektroskopije (IR) i pripremljeni su tanki rezovi. Masivni mineraloški sastav kamena procijenjen je IR analizom. Petrološka metodologija tankog presjeka, izvorno dizajnirana za geološka istraživanja, primijenjena je na ovo istraživanje bubrežnih kamenaca55. Uzorci bubrežnih kamenaca u cijelosti su ugrađeni u epoksidnu smolu i izrezani. Poprečni presjek je brušen abrazivima (SiC i Al2O3), a zatim je polirana strana pričvršćena na predmetno staklo pomoću epoksidne smole. Izveden je drugi rez kako bi se napravio uzorak debljine 1- mm paralelan s predmetnim stakalcem. Uzorak je zatim ispoliran do debljine od 20-30 µm i dovršen s poliranjem dijamantnom kašom.
Polarizirana mikroskopija i infracrvena spektrofotometrija s Fourierovom transformacijom.Optičke značajke svakog kristala koji sačinjava bubrežne kamence promatrane su polariziranom mikroskopijom s dijelovima kamenca debljine 20-30 µm. Površinski indeks svake ravnine COD određen je usporedbom opažanja s tipičnim oblikom kristala COD izračunatim pomoću VESTA56. Na temelju optičkih značajki, kristali su klasificirani, zatim analizirani infracrvenim spektrofotometrom s Fourierovom transformacijom (FT/IR6100, JASCO). Raspon valnog broja mjerenja bio je 7800–350 cm-1. Sva mjerenja su provedena na sobnoj temperaturi. Veličina mjerne točke postavljena je na 20×20 µm2. Kristalne faze identificirane su na temelju dobivenog IR spektra s RRUFF bazom podataka.
Višebojno imunofluorescentno bojenje proteinske matrice.Sekcije kamena korištene za analizu mineralnih faza također su korištene za analizu distribucije proteina s Multi-IF bojanjem. Tanke sekcije tretirane su otopinom citrata (pH 6.0) 1 minutu za minimalno jetkanje. Sekcija je isprana fiziološkom otopinom puferiranom fosfatom (PBS), zatim blokirana 60 min u 1-postotnom albuminu goveđeg seruma u slanoj otopini puferiranoj fosfatom s Tweenom 20 (PBST). Nakon blokiranja, sekcija je inkubirana s primarnim antitijelima preko noći na sobnoj temperaturi. Primarna korištena protutijela bila su mišji monoklonski anti-kalgranulin A (1:100 razrjeđenje, Santa Cruz Biotechnology, sc-48352), zečji poliklonalni anti-osteopontin (1:100 razrjeđenje, Santa Cruz Biotechnology, sc-20631 ), i ovčji monoklonski anti-humani protrombinski fragment 1 (1:500 razrjeđenje, Cedarlane Ontario, Kanada, CL20111AP). Sekcija je zatim isprana 3 puta s PBS-om tijekom 10 minuta prije inkubacije s fluorescentno konjugiranim sekundarnim protutijelima tijekom 1 sata, zaštićena od svjetlosti. Korištena fluorescentno konjugirana sekundarna antitijela bila su anti-zečji IgG (H plus L) unakrsno adsorbirani konjugirani na Alexa Fluor 488, anti-mišji IgG (H plus L) unakrsno adsorbirani konjugirani na Alexa Fluor 546 i anti-ovčji IgG (H plus L) Cross Adsorbirano konjugirano na Alexa Fluor 647. Nakon ekstenzivnog 3 puta ispiranja s PBS-om tijekom 10 minuta, fluorescencija je detektirana pomoću konfokalne auto-fluorescentne mikroskopije (Nikon A1R). Prikupljene valne duljine ekscitacije i emisije uključivale su ekscitaciju od 487 nm (emisija prikupljena između 500 i 550 nm), ekscitaciju 561 nm (emisija prikupljena između 570 i 620 nm) i 639 nm (emisija prikupljena između 663 i 738 nm) za OPN, RPTF{{ 46}}, odnosno Cal-A. Uočena je autofluorescencija (AF) u dijelu uzoraka, ali je intenzitet signala bio daleko niži od proteinskih signala o kojima se raspravljalo u ovoj studiji. Također je procijenjeno vezanje protutijela koja nisu specifična za ciljne proteine. Potvrđeno je odsustvo IF signala iz nespecifičnog antitijela. Provedeni su negativni kontrolni testovi za procjenu odsutnosti lažno pozitivnih signala (dodatna slika S5). Za bojenje protutijela, izotipske kontrole su korištene za otkrivanje bilo kakvog nespecifičnog vezanja. Konkretno, primarna protutijela korištena za kontrole bila su zečja (DA1E) izotipska kontrola mAb IgG XP (1:100 razrjeđenje stanične signalizacije), mišje (G3A1) kontrola izotipa mAb IgG1 (1:100 razrijeđeno stanično signaliziranje) i ovčje mAb IgG izotip (1 :100 razrjeđenje Novus) koristeći ista fluorescentno obilježena sekundarna protutijela kao gore. Profili linija konstruirani su pomoću ImageJ, pokazujući najvišu i najnižu točku kontrasta kao 100 posto odnosno 0 posto za svaki protein.