Akutno izlaganje kože ultraljubičastom svjetlu izaziva upalu bubrega posredovanu neutrofilima

Mi i drugi smo pokazali da UV svjetlo izaziva brzu infiltraciju neutrofila u kožu (6, 7). Iako su neutrofili glavni uzročnici upale na mjestima lokalnih ozljeda, nedavno je otkriveno da neutrofili također mogu biti dom organima udaljenim od primarnog mjesta upale (8-10), gdje doprinose ozljedi plućnog tkiva proizvodnjom reaktivnog kisika vrste (ROS) (11) ili aktivirati adaptivni imunološki sustav u limfnim čvorovima i koštanoj srži (9, 12). U SLE-u se smatra da neutrofili imaju važnu ulogu u lokalnim i sustavnim bolestima. Neutrofili su prisutni u kožnim lezijama pacijenata sa SLE (13, 14) iububregtkiva bolesnika s LN (15, 16). Visoka ekspresija neutrofilnog genskog potpisa snažan je prediktor aktivne bolesti, uključujući LN i kožne akne (17, 18). Proupalni granulociti niske gustoće (LDG) povećani su osobito u bolesnika s kožnim bolestima (19). Iako ovi nalazi upućuju na neutrofile u lokalnoj ozljedi tkiva kod SLE, osiguravaju li neutrofili patogenu vezu između upale kože iozljeda bubreganije shvaćeno.

Kako bismo razjasnili kako izlaganje kože UV svjetlu utječe nabubregi ulogu neutrofila u tim procesima, procijenili smo promjenebubrežniekspresija gena u skladu s migracijom neutrofila. Otkrili smo da akutno izlaganje kože UV svjetlu potiče upalne procese u kožibubreg,uključujući ekspresiju endotelnih adhezijskih molekula, upalnih medijatora, markera ozljede i prolazne proteinurije. Naime, otkrili smo da su neutrofili migrirali ububregnakon izlaganja UV svjetlu na način ovisan o IL-17A, lokalizirajući se na tubulointersticijska (TI) područja gdje su pokazivali proupalne fenotipove. Blokiranje trgovine neutrofilima liječenjem anti-G-CSF imunoglobulinom (IgG) ukinutobubrežniupala i spriječena pojačana regulacija markera tubularne ozljede. Zajedno, ovi nalazi pokazuju da izloženost kože UV svjetlu izaziva subkliničke simptomebubrežniupalni i ozljedni procesi posredovani neutrofilima.

Rezultati

Izlaganje kože UV svjetlu uzrokuje subkliničku ozljedu bubrega.Izlaganje sunčevoj svjetlosti povezano je s pogoršanjem sistemskih simptoma i pojavom pogoršanja bolesti u pacijenata sa SLE, uključujući nefritis (2-4). Stoga smo prvo pitali dovodi li akutna sterilna upala kože izazvana jednokratnim izlaganjem ultraljubičastom B (UVB) svjetlu (500 mJ/cm2) kod crnih 6 (B6) miševa do promjena ububreg, uključujući upalu, ozljedu i proteinuriju (slika 1A). Pluća su odabrana kao kontrolni organ, jer nije zabilježena povezanost između fotosenzitivnosti i kliničke bolesti pluća kod SLE. Ukupno 500 mJ/cm2 UVB svjetla u B6 miševa definirano je kao dvije minimalne eritematozne doze (20), referentna doza koja se koristi za prosvjed kod ljudi (21). Analiza ekspresije gena perfuzijebubreg tissues (Fig. 1A) revealed up-regulation in the gene expression of adhesion molecules vcam- 1 and e-selectin on days 1 and 2 after UVB light exposure (Fig. 1 B and C). In contrast, vcam-1 and e-selectin expression demonstrated a downward trend in the lung (SI Appendix, Fig. S1). We also observed a >10-presavijtebubrežniindukcija u s100A9, neutrofilni medijator povezan soštećenje bubrega(22), kao i povećanu ekspresiju s100A6, proteina koji veže kalcij povezan s ozljedom tubula (23) (Sl. 1 D i E). Dok je indukcija s100A9 otkrivena u plućima, ekspresija gena s100A6 ostala je nepromijenjena u plućima (SI dodatak, slika S1). Upalni odgovor ububregtakođer je bila povezana s ranim povećanjem ekspresije il-1 (1. i 2. dan nakon UV), dok je bilo minimalne ili nikakve promjene u tnf-u ili il-6 (slika 1F). Il-1 ekspresija nije otkrivena u plućima do 6 dana nakon izlaganja kože UVB svjetlu (SI dodatak, slika S1). Brza indukcija ekspresije cxcl12, kemokina koji izlučuju glomeruli i tubuli i koji je uključen uozljeda bubrega(24), također je pronađena ububregali ne i pluća (Slika 1G i Dodatak SI, Slika S1). Stoga, ozljede kože izazvane UVB svjetlom brzo izazivajububrežniproinflamatornih procesa, dok se manje promjena uočava na plućima.

Osim proinflamatornog odgovora uočenog ububreg,i proteinurija i omjer albumina/kreatinina u urinu povećali su se u prvih nekoliko dana nakon izlaganja kože UVB svjetlu (sl. 1 H i I). Ovaj brzi učinak narad bubregabio je popraćen pojačanom ekspresijom lipokalina-2 iozljeda bubregamolekula 1 (kim-1) (sl. 1 J i K), markeri cjevastogoštećenje bubregakoji se također uočavaju u LN (25, 26). Unatoč prolaznoj prirodi proteinurije, ekspresija ovihozljeda bubregamarkeri su postojali do 6. dana (sl. 1 J i K), vjerojatno odražavajući popravak tkiva.

Upala kože izazvana UV svjetlom rezultira migracijom neutrofila u bubreg.Kako bismo istražili sudjeluju li neutrofili u sustavnom upalnom odgovoru na UVB svjetlo, ispitali smo kinetiku nakupljanja neutrofila u koži ozračenoj UV svjetlom, kao iu slezeni,bubreg,i pluća C57BL/6 J (B6) miševa, soja koji najbolje oponaša kožne promjene UVB svjetla u ljudskoj koži (Sl. 2A) (27). Nakon akutne izloženosti kože UVB svjetlu, broj neutrofila u koži povećao se sedam puta unutar 24 sata i ostao povišen 6 dana u usporedbi s osnovnim razinama prije UVB (D-1) ​​(Slika 2B). To je bilo popraćeno smanjenjem broja neutrofila u koštanoj srži i peterostrukim povećanjem neutrofila u krvi u danima 1. do 6. (Slika 2 C i D). Intrigantno je da su u istom vremenskom okviru neutrofili porasli u slezeni, plućima ibubreg(Slika 2 E–G i Dodatak SI, slika S2A). Precizna kinetika varirala je između organa, dosegnuvši vrhunac 1. dana u plućima i 2. do 6. dana u plućima.bubregi slezenu (slika 2 E–G). ububrega, neutrofili uglavnom lokalizirani u tubulointersticijskom području, uključujući vaskulaturu, kao što je naznačeno bojanjem neutrofilne elastaze (NE) u blizini, ili kolokalizirani s, adhezijskom molekulom trombocita/endotelnih stanica-1 (PECAM-1/CD31 ) (Slika 2H). Reprezentativne slike na slici 2H prikazuju neutrofile u ili oko intersticijske vaskulature (pune bijele strelice) i u intersticiju (točkaste bijele strelice), s povremenim neutrofilima koji se također nalaze u glomerulima (žute strelice). Slična lokalizacija otkrivena je s anti-Ly6G imunofluorescentnim (IF) bojenjem (SI dodatak, slika S2B).

Kako bismo utvrdili pokazuju li druge urođene imunološke stanice lokalne i sistemske odgovore slične neutrofilima, ispitali smo distribuciju monocita (CD11b plus Ly6C plus Ly6G−) u istim vremenskim točkama nakon izlaganja UVB svjetlu. Iako su monociti također regrutirani u kožu, samo je mali broj infiltriranih monocita otkriven ububreg6. dan nakon izlaganja UVB zračenju (~2-put u odnosu na ~10.5-struko povećanjebubregneutrofili) (Slika 2F i SI Dodatak Slika, S3). Nije otkriveno povećanje broja monocita u plućima ili slezeni (Dodatak SI, slika S3), što sugerira da je sustavni odgovor na UV ozljedu bio relativno selektivan za neutrofile.

Infiltracija neutrofila u kožu bila je popraćena histološkim promjenama, uključujući ranu upalu dermisa i smrt epidermalnih stanica (1. i 2. dan), nakon čega je u nekim slučajevima uslijedio razvoj akantoze i hiperkeratoze s stvaranjem serocelularne kore (6. dan) (SI Dodatak, slika S4). Značajno je da se nakon izlaganja UVB svjetlu nisu pojavile otvorene kožne lezije, što sugerira da se opažena infiltracija imunoloških stanica dogodila u sterilnim uvjetima, iako se doprinos promijenjenog mikrobioma kože ne može isključiti (20).

Zajedno, ovi nalazi pokazuju da izlaganje kože jednoj dozi UVB svjetla mobilizira neutrofile i na lokalno mjesto upale kao i na unutarnje organe, uključujućibubreg,praćen krvnom neutrofilijom. Dok su ukupni migracijski obrasci bili slični i kod mužjaka i kod ženki miševa, infiltracija neutrofila u kožu bila je brža kod ženki u usporedbi s mužjacima (slika 2B). Nasuprot tome, epidermalna ozljeda skidanjem trake nije dovela do migracije neutrofila ububregusprkos sličnim razinama infiltracije neutrofila i upalnog odgovora i ozljede tkiva kao što se vidi pri izlaganju UV svjetlu (Dodatak SI, slika S5), što ukazuje da sustavna diseminacija neutrofila nije zajednička svim oblicima ozljeda sterilne kože.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI

IL-17A potiče regrutiranje neutrofila nakon izlaganja kože UV svjetlu.Istraživanje kemotaktičkih i upalnih medijatora u koži otkrilo je značajnu regulaciju ekspresije gena neutrofilnih kemokina i upalnih citokina cxcl1, cxcl5/6, g-csf i il-1 1 do 2 dana nakon izlaganja UV zračenju (slika 3 A–D). Brzo i postojano povećanje ekspresije s100A9 odgovaralo je kinetici infiltracije neutrofila u kožu (Slika 2B i Dodatak SI, Slika S6), dok su citokini il-6, tnf i il-33 su prolazno povećane i vraćene na početnu ekspresiju do 6. dana (SI dodatak, slika S6). Nasuprot tome, il-36a je bila povišena samo 6. dan (SI dodatak, slika S6), što možda odražava reparativnu funkciju. Prolazna (1 do 2 d) prisutnost monocita u koži (SI Dodatak, Slika S3) bila je usporedna s pojačanom regulacijom kemokina ccl4 i ccl2 specifičnih za monocite (SI Dodatak, Slika S6). Slično nakupljanju neutrofila u koži ženki miševa (Sl. 2B), nakupljanje monocita u koži također se dogodilo ranije kod ženki nego kod mužjaka (SI Dodatak, Slika S3).

UV skin exposure was accompanied by rapid (6 h) 12-fold induction in il-17a gene expression in the skin (Fig. 3E) as well as >1,000-puta kožna indukcija ekspresije g-csf-a tijekom 1. i 2. dana nakon UV (slika 3C). Kako bismo utvrdili je li indukcija ovih citokina relevantna za mobilizaciju neutrofila, prvo smo kvantificirali koncentracije proteina citokina u krvi, što je otkrilo snažno i trajno (10- do 100-puta) povećanje koncentracije u plazmi IL-17A 6 do 24 h nakon izlaganja UV svjetlu (slika 3F), zajedno s prolaznim (vrhunac u 6 h) povećanjem IL-6 i IL-12, citokina koji može biti nizvodno od IL-17A (28) (sl. 3 G i H). Nije primijećeno povećanje koncentracija IFN-a, GM-CSF-a, TNF-a, IL-10, IL-27, IL-23 ili IL1 u plazmi. Kako bismo utvrdili je li IL-17A neophodan za regrutiranje neutrofila izazvano UVB-om, blokirali smo učinak IL-17A neutralizirajućim antitijelom prije izlaganja UV zračenju (Slika 3I). Anti-IL-17A IgG značajno je prigušio neutrofiliju u krvi (Slika 3J) i oslabio priljev neutrofila u izloženo tkivo kože (Slika 3K i SI Dodatak, Slika S7A) ibubreg(Slika 3L i SI Dodatak, Slika S7B). Ovi nalazi pokazuju da je regrutiranje neutrofila kao odgovor na UV svjetlo posredovano, barem djelomično, IL-17A.

Neutrofili posreduju u upali bubrega nakon izlaganja kože UV zračenjuSvjetlo.Kako bi se utvrdilo jesu li neutrofili odgovorni za upalne promjene ububreg following skin UVB light exposure, we blocked neutrophil recruitment prior to UV light exposure. Since cutaneous g-csf expression was up-regulated >1,000-puta nakon izlaganja UV zračenju, što ukazuje na kemotaktičku ulogu G-CSF-a u regrutiranju neutrofila kao odgovor na UV svjetlo, inhibirali smo mobilizaciju neutrofila iz koštane srži blokiranjem G-CSF-a kao što je prikazano na slici 4A. Neutralizirajući G-CSF spriječio je neutrofiliju u krvi kao i regrutiranje neutrofila ububregnakon izlaganja kože UVB svjetlu (sl. 4 B i C). Naime, kao što je ranije objavljeno u različitim modelima (29, 30), blokiranje G-CSF-a nije promijenilo broj monocita ububreg(Slika 4D). Smanjena migracija neutrofila ububregbio je popraćen značajnim smanjenjem ububrežniekspresiju adhezijskih molekula vcam-1 i e-selektina (Slika 4 E i F) kao i upalnih medijatora s100A9 i il-1 1 d nakon izlaganja UVB zračenju (Slika 4 G i H). Nadalje, markeri ozljede tkiva lipokalin-2 i kim-1 ububregbili značajno smanjeni kod miševa izloženih UV svjetlu tretiranih G-CSF blokirajućim protutijelima u odnosu na životinje izložene UV svjetlu tretirane izotipom (Slika 4 I i J). Kao što smo ranije izvijestili (6), akutna izloženost kože UVB svjetlu izazvala je odgovor interferona tipa I ububreg(Slika 4K). Blokiranje G-CSF-a značajno je smanjilo, ali nije potpuno poništilo IFN rezultat (slika 4K). Dok prisutnost neutrofila ububregbila potrebna za akutne upalne i ozljedne reakcije uočene 1 dan nakon izlaganja kože UV svjetlu (Slika 4), u ovom trenutku nisu uočene razlike u proteinuriji, jer se vrhunac proteinurije dogodio oko 4. dana nakon izlaganja UV svjetlu (Slika 1 H i ja). Zajedno, ovi podaci pokazuju da su neutrofili odgovorni za upalni odgovor i, izravno ili neizravno, doprinose indukciji interferona tipa I ububregnakon izlaganja kože UV svjetlu. Slično rezultatima dobivenim s anti-G-CSF IgG, primjena neutralizirajućeg anti-IL-17 protutijela djelomično je potisnula migraciju neutrofila ububregi rezultiralo smanjenom ekspresijom genabubregupalni (vcam-1 i s100A9) i markeri ozljeda (lipokalin-2 i kim-1), iako je samo smanjenje ekspresije kim-1 bilo statistički značajno (SI dodatak, slika . S7 C–F)

Subpopulacija bubrežnih neutrofila je obrnuto migrirala, a fenotip je također otkriven u krvi SLE pacijenata.Dok se dugo pretpostavljalo da neutrofili koji ulaze u mjesta infekcije ili sterilne upale naknadno prolaze kroz apoptozu i da ih makrofagi brzo uklanjaju, brojne studije su otkrile da neki neutrofili prometuju u dvosmjeru, to jest da nakon ulaska u tkivo transmigriraju natrag u krvotok i infiltrirati se na drugo mjesto, proces koji se naziva reverzna transmigracija (rTEM) (8, 10, 11, 31-34). Kako bi se istražilo jesu li neutrofili koji su se smjestili ububregnakon izlaganja kože UVB svjetlu koje prolazi kroz izloženu kožu, proučavali smo migraciju neutrofila u modelu B6 miša koji se može fotoaktivirati (fotoaktivirani ljudskim ubikvitinom C [UBC] [PA] -zeleni fluorescentni protein [GFP]).

Eksperimentalna shema ilustrirana je na slici 5A; 1 dan nakon izlaganja kože jednoj dozi UVB svjetla, koža je bila izložena ljubičastom svjetlu (405 nm) tako da su infiltrirane imunološke stanice fotokonvertirane u GFP-pozitivne stanice. Fotokonvertirani neutrofili (GFP plus Ly6G plus) zatim su kvantificirani u perfuziranombubregasljedeći dan. Analiza protočne citometrije otkrila je da je oko 20 posto neutrofila koji infiltriraju bubreg bilo GFP pozitivno nakon oduzimanja pozadinskog signala (~ 10 posto) (Slika 5B). Za razliku od modela sterilne upale u jetri ili kremaster mišiću (8, 10), nismo otkrili fotokonvertirane neutrofile u plućima, vjerojatno zato što je drugi dan u plućima pronađeno malo neutrofila (slika 2F). Kako bi se ispitalo ima li GFP plus neutrofila ububregekstravazirane iz kožnog tkiva izloženog UV zračenju ili su PA intravaskularno, usporedili smo promjene u broju GFP plus neutrofila dobivene izbubregamiševa kod kojih je ista koža koja je bila izložena UV svjetlu dan kasnije bila PA s ljubičastim svjetlom (Skupina I) u odnosu na miševe kod kojih je koža uz to izlaganje UV svjetlu bila PA s ljubičastim svjetlom dan kasnije (Skupina II, dijagram u SI dodatku, sl. S8A). Iako nije bilo razlika u postocima cirkulirajućih neutrofila između skupina (SI dodatak, slika S8B), veće povećanje GFP plus neutrofila primijećeno je ububregamiševa kod kojih je koža izložena UV zračenju također bila PA (Skupina I) u usporedbi s nedostatkom povećanja GFP plus neutrofila kod miševa kod kojih je koža koja nije bila izložena UV zračenju bila PA (Skupina II) (SI dodatak, slika S7B). U skupini II, brojevi neutrofila bili su slični pozadini GFP pozitivnosti viđenoj na slici 5B (SI dodatak, slika S8B).

Dok niske razine GFP plusbubregneutrofila u skupini II sugeriralo da ljubičasto svjetlo nije PA cirkuliralo u stanicama u koži koja nije izložena UV zračenju, i dalje je moguće da je izlaganje UV svjetlu promijenilo interakcije neutrofila s krvnim žilama u koži, dopuštajući veću fotokonverziju i kasnijebubregpristup. Kako bismo odredili relativne udjele TEM neutrofila, kvantificirali smo ekspresiju površinskih markera koji se koriste za karakterizaciju neutrofila koji su prošli rTEM: CXCR4hi (8) i ICAM1hiCXCR1lo (11, 35). Doista, GFP plusbubregneutrofili izražavaju više razine CXCR4 u usporedbi s GFP plus neutrofilima u koži ili GFP− neutrofilima ububreg(Slika 5C). Od

interes,bubrežniekspresija liganda CXCR4, cxcl12, 1 do 2 dana nakon izlaganja kože UVB svjetlu bila je istodobna s prisutnošću neutrofila CXCR4hi ububreg(Sl. 1G), vjerojatno pružajući kemotaktički stimulans za regrutiranje ovih neutrofila u bubreg. Zanimljivo je da smo detektirali CXCR4hi i ICAM1- hiCXCR1lo neutrofile u koštanoj srži kasno nakon izlaganja UV zračenju (6. dan, SI dodatak, sl. S9 B i C), što sugerira da se neki od tih neutrofila također vraćaju natrag u koštane srži slično onome što je prijavljeno za rTEM nakon ozljede jetre ili virusne infekcije kože (12, 36). U skladu s ovim opažanjima, otkrili smo veću ekspresiju CXCR4 na neutrofilima u krvi 2. dana nakon izlaganja UV zračenju, vjerojatno hvatajući stanice na putu dobubregi koštane srži (SI dodatak, slika S9D). Slično tome, značajno veći postotak ICAM1hiCXCR1lo stanica otkriven je među GFP plus neutrofilima ububregu usporedbi s GFP plus neutrofilima u koži i GFP− neutrofilima ububreg(Slika 5D). Fenotip ICAM1hiCXCR1lo otkriven je na ~20 do 35 posto GFP plus neutrofila ububreg(Sl. 5D), što sugerira da podskup neutrofila koji migriraju ububregpreko kože izložene UV zračenju to čini obrnutom transmigracijom, dok ostatakbubregneutrofili se vjerojatno aktiviraju dok cirkuliraju kroz upaljenu kožu izloženu UV zračenju. Subpopulacija neutrofila ICAM1- hiCXCR1lo također je otkrivena ububreganormalnih B6 miševa izloženih UV svjetlu koji nisu primili PA (SI dodatak, slika S9A).

Dok su oba fenotipa neutrofila CXCR4hi i ICAM1hiCXCR1lo povezani s upalnim funkcijama i ozljedama tkiva u različitim mišjim modelima (11, 31, 37), malo je studija provedeno na ovim staničnim populacijama u ljudskim bolestima. S obzirom na sve veću ulogu neutrofila u SLE (13, 17, 18) i njihovu očitu heterogenost (19), istražili smo jesu li polimorfonuklearne stanice normalne gustoće (PMN) ili LDG kod pacijenata sa SLE

pokazali su obrnute migrirajuće fenotipove: CXCR4hi (37, 38) i ICAM1hiCXCR1lo. Profiliranje PMN-a i LDG-a protočnom citometrijom otkrilo je veću ekspresiju CXCR4 na površini ovih stanica kod pacijenata sa SLE u usporedbi sa zdravim kontrolama (Slika 6 A i C). Štoviše, pronašli smo mali, ali značajno viši postotak ICAM1hiCXCR1lo PMN u SLE krvi (srednja vrijednost, 3,5 posto) u odnosu na zdrave kontrole (srednja vrijednost, 1,4 posto) (Slika 6B). Zanimljivo je da je populacija LDG neutrofila (CD15 plus CD14loCD10 plus u mononuklearnim stanicama periferne krvi [PBMC]) sadržavala veći postotak ICAM1hiCXCR1lo stanica nego PMN u zdravoj (srednja vrijednost, 7,1 posto) i u SLE krvi (srednja vrijednost, 29,4 posto) (Slika 6 B i D). Populacija slična rTEM-u bila je značajno više zastupljena u LDG-ovima pacijenata sa SLE u odnosu na zdrave kontrolne skupine (slika 6D). Ovi podaci identificiraju prisutnost neutrofilnih fenotipova sličnih rTEM-u u PMN-ovima, a posebno LDG-ovima u SLE pacijenata.

Rasprava

Sustavni učinci izlaganja kože UV svjetlu slabo su poznati. Identificiranje tih puteva u normalnim osnovnim uvjetima može informirati mehanizme sistemske zahvaćenosti tkiva nakon izlaganja suncu koje se javlja kod bolesti kao što je SLE (2-4). Ovdje donosimo nekoliko otkrića o tome kako izloženost sunčevoj svjetlosti utječe na bubrege. Prvo smo pokazali da akutna izloženost kože UVB svjetlu izaziva upalne i ozljedne reakcije ububreg,uključujući subkliničku proteinuriju. Intrigantno, ovebubrežnipromjene su bile popraćene infiltracijom neutrofila u bubreg nakon upale kože posredovane UVB svjetlom. Odgovor neutrofila ovisio je o IL-17A i G-CSF. Neutrofili u bubregu imali su proupalne fenotipove, što je dokazano izvanstaničnom lokalizacijom NE, većim udjelom rTEM (CXCR4hi) također poznatih kao "stare" i ICAM1hiCXCR1lo stanica. Neutrofili su bili izravno uključeni u subkliničkiozljeda bubrega,budući da je smanjenje neutrofila rezultiralo značajnim smanjenjem ekspresije adhezijskih molekula, upalnih citokina, IFN-I potpisa i markera oštećenja bubrega nakon izlaganja kože UV zračenju.

Zabilježeno je da druge vrste ozljeda kože, poput skidanja trake i lokalne primjene agonista TLR7, pojačavajuozljeda bubregau određenim modelima lupusa, iako se smatralo da pojačanje bolesti posreduju makrofagi i dendritične stanice, a ne neutrofili (39, 40). Nakon što je pokazao da skidanje trake nije dovelo do regrutiranja neutrofila ububreg, predlažemo da se izlaganje UV svjetlu razlikuje od drugih vrsta sterilnih upala kože. To se može objasniti stvaranjem fotoproizvoda ili jedinstvenih upalnih medijatora nakon UV ozljede koji potiču bubreg za upalu, razlikama u uklanjanju neutrofila nakon UV zračenja u usporedbi sa skidanjem trake ili drugim čimbenicima. Primijetili smo da je UV svjetlo pokrenulo brzu i snažnu indukciju IL-17a messenger RNA (mRNA) u koži zajedno s visokim razinama IL-17A proteina u cirkulaciji (~100-struko povećanje) , koji je bio potreban za regrutiranje neutrofila nakon izlaganja UV svjetlu. Istovremena indukcija od 100- do 1,000-puta u ekspresiji g-csf-a u koži sugerira da je osovina IL-17A/G-CSF vjerojatni mehanizam odgovoran za neutrofiliju i namještanje tkiva neutrofila kao odgovor na UV svjetlo. Uloga IL-17A u regulaciji granulopoeze i regrutiranja neutrofila putem indukcije G-CSF-a dobro je poznata u homeostatskim uvjetima i nekoliko je studija identificiralo IL-17A kao važnog za regrutiranje neutrofila na mjesta sterilna upala (41, 42). Kod lupusa, povišena ekspresija IL-17A nalazi se u kožnim lezijama (43), a povećane razine IL-17A u cirkulaciji povezane su s lošijim manifestacijama bolesti (44), iako je specifičan odnos s neutrofilima, patogena populacija u ovoj bolesti (13, 17, 18), ostaje neistražena. Osim izravnih učinaka na G-CSF-om posredovanu mobilizaciju neutrofila iz koštane srži, IL- 17A također može doprinijeti namještanju neutrofila ububregpoticanjem ekspresije adhezijskih molekula (npr. VCAM-1 i E-Selectin) nabubrežniendotel (45, 46).

Koristeći isti model akutne izloženosti UV zračenju, nedavno smo izvijestili da je jedna doza UV svjetla izazvala lokalni i sistemski IFN-I odgovor, koji je bio potreban za učinkovito regrutiranje neutrofila u kožu (6). Budući da se pokazalo da IFN-I inducira proizvodnju IL-17A (47), moguće je da ovi putovi neovisno ili u dogovoru dovode do regrutiranja i migracije neutrofila posredovanih UV svjetlom, o čemu ovdje izvještavamo. Dok naša otkrića upućuju na upalnu ulogu IL- 17A, supresivni učinci UVB svjetla na signalizaciju IL-17A ranije su prijavljeni u psorijazi, gdje je izloženost psorijazne kože UVB svjetlu eliminirala patogene T stanice i mijeloidne upalne dendričke stanice (48, 49). Budući da je psorijazna koža, za razliku od zdrave, bogata T-stanicama koje proizvode IL-17 i reagiraju na njih, razlika u staničnom sastavu vjerojatno će odrediti odgovor na UVB svjetlo, uključujući opseg supresije IL-a posredovanog UVB svjetlom -17Ekspresija receptora (50). Doziranje UV zraka također može odrediti hoće li se pojaviti upalni ili terapeutski učinak: niske doze povezane su s protuupalnim i imunosupresivnim posljedicama (51), vjerojatno inhibicijom odgovora CD8 T stanica (52).

Neutrofili igraju višestruke uloge tijekom upale tkiva. Kada se aktiviraju molekularnim obrascima povezanim s patogenom i molekularnim uzorcima povezanim s oštećenjem (DAMPS) ili angažmanom receptora, neutrofili izravno pridonose ozljedi tkiva otpuštanjem proteaza, ROS-a i ekstruzijom izvanstaničnih zamki neutrofila (NET) (53, 54). Neutrofili također mogu potaknuti popravak tkiva fagocitozom staničnih ostataka i omogućavanjem revaskularizacije tkiva (8). U SLE-u, genski potpis neutrofila snažan je prediktor aktivne bolesti uključujući LN i kožni lupus (17, 18). Neutrofili se nalaze u kožnim lezijama (13, 14), kao iububreguzorci biopsije (15, 16) pacijenata sa SLE, a njihova upalna svojstva djelomično su pripisana stvaranju NET (16). Ovaj proces uključuje povećanu proizvodnju ROS-a (55), oslobađanje mitohondrijske DNA (55) te oslobađanje i indukciju upalnih proteina, kao što su s100A9 (56), IL-1b (57) i interferoni tipa I (55). , 58). Naša otkrića pokazuju da inhibicija migracije neutrofila u bubreg poništava s100A9 i značajno smanjuje ekspresiju IL-1b ibubregIFN rezultat sugerira da bi slične upalne funkcije mogle biti u igri. Relevantno za bubrežnu bolest kod SLE, neutrofili su uglavnom lokalizirani na TI endotelu, mjestu povećane ekspresijeozljeda bubregamarkeri kim-1 i lipokalin-2 u LN tkivima bubrega (59,60). Proteinurija može nastati zbog prekomjerne propusnosti glomerularne barijere za proteine ​​zbog poremećene reapsorpcije proteina u tubulima ili kombinacijom tih mehanizama (61). Ozljeda TI u bolesnika sa SLE čest je patološki nalaz u LN bubrega, uključujući one s blagim oštećenjem glomerula (61, 62). Pokazalo se da TI ozljeda predviđa ozbiljnost LN-a (63, 64), no mehanizmi koji ga pokreću nisu poznati. Budući da su povišeni kim-1 i lipokalin-2 prepoznati markeri ozljede TI u SLE (26, 65) i blokiraju migraciju neutrofila ububreginhibirali njihovu ekspresiju, predlažemo da je prolazna proteinurija uočena nakon izlaganja UV zračenju posljedica subkliničke upale TI posredovane neutrofilima (65). Povećana ekspresija vcam-1 bubrega, još jedan marker ozljede TI kod SLE (66), dodatno podupire ovaj model.

Osim širenja upale na lokalnim mjestima sterilne ili infektivne ozljede, pokazalo se da neutrofili dolaze do udaljenih organa (8-10), gdje, ovisno o kontekstu, pridonose ozljedi tkiva putem proizvodnje ROS-a (11) ili aktiviraju adaptivni imunološki sustav u limfnim čvorovima i koštanoj srži (9, 12). Upalna priroda ovih neutrofila pripisuje se njihovoj sposobnosti da izađu iz primarnog mjesta ozljede i migriraju na sekundarna mjesta, odnosno da se podvrgnu rTEM (9-11, 31-34). Naša otkrića da je PA stanica koje sadrže GFP u koži nakon izlaganja UV zračenju dovela do otkrivanja GFP plus neutrofila ububregs fenotipom rTEM sugeriraju da subpopulacija odbubrežnineutrofili su migrirali iz kože izložene UV zračenju (GFP plus neutrofili čine ~20 postobubregneutrofili, a od njih 20 do 35 posto su rTEM; dakle, rTEM čine 4 do 7 posto ukupnog brojabubregneutrofili). Ovaj udio rTEM-a usporediv je s udjelom prijavljenim nakon sterilne ozljede jetre (~9 posto) (36) i ishemijsko-reperfuzijske ozljede (~8 posto) (11). rTEM se u drugim okolnostima pokazao proupalnim (10, 11) i oslabio apoptozu (35), što dovodi do mogućnosti da igraju ulogu u UV-induciranomozljeda bubrega.Povišena ekspresija CXCR4 na ovim neutrofilima posebno je relevantna, kao slučajnostbubrežniuočena je ekspresija cxcl12, liganda CXCR4 izraženog u podocitima i tubulima (24), što vjerojatno daje kemotaktički signal za ovu populaciju neutrofila. Povećana ekspresija CXCR4 na imunološkim stanicama u kombinaciji s visokim razinamabubrežniCXCL12 je identificiran u SLE bolesnika s LN (67), a ovaj je put bio uključen u lupus, kao i ishemiju-reperfuzijuozljeda bubregakod miševa (24, 68). Osim što je biljeg rTEM-a, povećana ekspresija CXCR4 također je pokazatelj "starih" neutrofila, koji mogu posredovati u upalnim odgovorima koji oštećuju tkivo (38). Točna uloga CXCR4 u regrutiranju neutrofila ububregmože se istražiti antagonizmom CXCR4 kao što je prethodno učinjeno u drugim modelima sterilne ozljede (38).

Tkivno-specifična migracija neutrofila i mehanizmi odgovorni za različitu ekspresiju adhezijskih molekula u različitim organima nisu dobro shvaćeni (69). Više razine ekspresije kemokina cxcl12 ububregali ne i pluća moglo bi objasniti povlaštenu prisutnost CXCR4hi neutrofila u bubregu. Osim toga, indukcija ekspresije vcam-1 i e-selektina u bubregu, u usporedbi s izostankom ekspresije u plućima, vjerojatno doprinosi preferencijalnom regrutiranju i zadržavanju neutrofila u bubregu. 5- do 6-struko povećanje ekspresije s100A9 u plućima u usporedbi s 30- do 60-strukim povećanjem u bubrezima, kao i 6-struko povećanje ekspresija il-1b u plućima u usporedbi s 16-struko povećanjem u bubrezima dodatno ukazuje na razlike u tkivima u upalnom odgovoru. Smanjenje infiltracije neutrofila u bubreg nakon neutralizacije G-CSF-a može se pripisati smanjenju broja cirkulirajućih neutrofila i aktivaciji neutrofila, kao i smanjenju lokalne ekspresije vcam-1 i e-selektina. Međutim, ne možemo biti sigurni pripisuje li se početna pojačana regulacija ovih adhezijskih molekula nakon izlaganja kože UV zračenju citokinima/DAMPS-ima koji potiču iz kože ili neutrofili, putem otpuštanja serinskih proteaza, izravno doprinose njihovoj ekspresiji kao što je pokazano u drugim konteksti (70). Bez obzira na mehanizme i uz napomenu da nismo izvršili sveobuhvatnu analizu svih tkiva, naše studije pružaju dokaze o određenoj selektivnosti organa u sistemskim učincima posredovanim UV svjetlom. Buduće studije bavit će se tkivno specifičnim funkcionalnim posljedicama sistemske diseminacije neutrofila, na primjer, curenjem vaskularnog albumina i stvaranjem edema u plućima (11, 36).

U bolesnika sa SLE-om teško je nedvosmisleno povezati izloženost kože UV svjetlu s egzacerbacijama sistemske bolesti, budući da postoje značajne varijacije (1 do 3 tjedna) u vidljivim odgovorima fotoosjetljivosti u različitih pojedinaca (21). Osim toga, subkliničkiozljeda bubregamože se lako propustiti dok uzastopno izlaganje UV svjetlu ne pojača učinke. Dok smo otkrili da posreduje neutrofilupala bubregakao odgovor na UV svjetlo ne uzrokuje kliničku bolest kod zdravih miševa, takav mehanizam može pridonijeti izbljescima LN-a u pacijenata s fotoosjetljivim lupusom na više načina. Uključivanje Fc receptora u imunološke komplekse moglo bi pojačati regrutiranje neutrofila, što bi rezultiralo oslobađanjem ROS i proteaze (71); povećana sposobnost lupus neutrofila i LDG-a za proizvodnju NET-a, koji se u bolesnika sa SLE-om ne uklanjaju učinkovito (72), može dovesti do otpuštanja proteaza koje oštećuju tkivo (73), širenja IFN-I odgovora (58) , ili izravno oštećenjebubregendotela stvaranjem vaskularnog oštećenja i propuštanja (16). Štoviše, temeljne razlike u lupusnoj koži, kao što je pojačana signalizacija IFN-I (5, 74) i defekti u zaštitnoj populaciji Langerhansovih stanica (75), mogle bi informirati o opsegu i prirodi sistemskih odgovora posredovanih neutrofilima. Praćenje migracije neutrofila u kombinaciji s ispitivanjem autoantitijela, nakupljanjem apoptotskih stanica i niskim razinama komplementa može se riješiti korištenjem novih modela lupusa, kao što su genetski definirani trostruki mutanti (Sle1.Mfge8−/− C1q−/− i Sle1.Mfge8− /−C3−/−) (76) ili drugi sojevi lupusa nakon izlaganja UV svjetlu.

Na točne mehanizme koji povezuju neutrofile s upalom kod SLE-a mogao bi, dodatno, biti pod utjecajem fenotipa neutrofila/LDG, budući da je heterogenost unutar tih populacija postala očiglednija (77). Naša otkrića o povišenim CXCR4 i ICAM1hiCXCR1lo (rTEM) cirkulirajućim populacijama, posebno u SLE LDG-ovima, dodatno pridonose ovoj heterogenosti i sugeriraju da bi neki od više proupalnih granulocita u krvi mogli imati prethodno "iskustveno tkivo", to jest, prebivalište u zahvaćena tkiva organa, kao što je koža, prije sistemske diseminacije. Fenotipovi rTEM ranije su zabilježeni u sinovijalnoj tekućini i cirkulirajućim neutrofilima pacijenata s reumatoidnim artritisom (35, 78) i kod ozljede pluća povezane s akutnim pankreatitisom (79). Njihova uloga u SLE zahtijeva daljnje istraživanje.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA

Materijali i metode

Miševi.Sve pokuse na životinjama odobrio je Institucionalni odbor za skrb i korištenje životinja Sveučilišta Washington, Seattle. Početni pokusi provedeni su s muškim i ženkama miševa C57BL/6J (Jackson Laboratory, stari 3 do 4 mjeseca, slike 1 i 2). Za sve daljnje pokuse korištene su ženke miševa. PA studije su provedene na B6. Cg-Ptprc Tg(UBC-PA-GFP)1Mnz/J ženke miševa (Jackson Laboratory, stare 3 do 4 mjeseca). Ovi miševi su stvoreni injekcijom transgenog vektora koji nosi PAGFP (T203H varijanta) pod transkripcijskom kontrolom humanog ubikvitin C promotora u C57BL/6 embrije. Životinje su bile smještene u uvjetima bez patogena i održavane u ciklusima svjetlo-tama od 12 sati s ad libitum pristupom hrani i vodi. Pokusi na svim životinjama izvedeni su u isto doba dana kako bi se izbjegao utjecaj cirkadijalnog ritma na migraciju neutrofila (38).

Izlaganje UVB svjetlu i skidanje trake.Dorzalni aspekt mužjaka i ženki miševa C57BL/6 obrijan je najmanje 24 sata prije ozračivanja UVB svjetlom, au pokusima su korišteni samo miševi s nepigmentiranom kožom. Miševi su anestezirani izofluranom i izloženi jednoj dozi UVB svjetla (500 mJ/cm2) pomoću FS40T12/UVB žarulja (National Biological Corporation), s vršnom emisijom između 300 i 315 nm. Energija UVB svjetlosti na dorzalnoj površini mjerena je radiometrom Photo light IL1400A opremljenim SEL240/UVB detektorom (International Light Technologies). Miševi su eutanazirani 1, 2 ili 6 dana nakon izlaganja UVB svjetlu, a neozračeni miševi korišteni su kao kontrola (D-1) (Slika 2A). Skidanje epidermalne vrpce izvedeno je kao što je prethodno opisano (7), a koža ibubregprocijenjeni su 24 sata nakon ozljede

Inhibicija IL-17A i G-CSF.Miševi su intravenski tretirani sa 100 ug pročišćenog štakorskog anti-mišjeg IL-17A IgG (BioLegend) ili izotipske kontrole 3 sata prije izlaganja UV svjetlu (1 × 500 mJ/cm2) (Slika 3I). Prisutnost neutrofila u krvi, koži i perfuziji fiziološke otopinebubregtkivo je procijenjeno protočnom citometrijom 24 sata nakon izlaganja UV zračenju kako je opisano u nastavku. Migracija neutrofila kao odgovor na UV svjetlo inhibirana je tretiranjem miševa intraperitonealno s 50 ug anti-mišjeg G-CSF monoklonskog protutijela ili kontrolom izotipa mišjeg IgG (R&D Systems) 24 h i 3 h prije izlaganja kože UVB svjetlu (1 × 500 mJ). /cm2) (slika 4A). Nakon srčane perfuzije, broj neutrofila i monocita ububregprocijenjeni su protočnom citometrijom i ekspresijom gena qPCR-om, kako je opisano u nastavku. Miševi koji nisu bili izloženi UVB svjetlu korišteni su kao dodatna kontrolna skupina.

Izolacija stanica iz različitih organa.Nakon eutanazije s udisanjem CO2, komad dorzalne kože je uklonjen i čuvan u otopini RPMI (Roswell Park Memorial Institute) na ledu do obrade. Krv je sakupljena srčanom punkcijom u štrcaljke obložene etilendiamintetraoctenom kiselinom. Nakon toga je izvedena srčana perfuzija korištenjem fiziološke otopine puferirane fosfatom (PBS) (~60 mL) kroz lijevu klijetku nakon rezanja desne pretklijetke. Uspješna perfuzija utvrđena je promatranjem kompletnebubregi bljedilo pluća. Pluća, bubrezi, slezena i obje bedrene kosti pažljivo su uklonjeni i stavljeni u RPMI otopinu na ledu do obrade uzorka. Stanice su izolirane iz ekvivalentnih područja kožnog tkiva (~30 mm2) usitnjavanjem i probavom tkiva s 0.28 jedinica/mL Liberase TM (Roche) i 0,1 mg/mL Deoksiribonukleaze I ( Worthington) u PBS s Ca plus 2 i Mg plus 2 tijekom 60 minuta na 37 stupnjeva uz mućkanje. Stanice su izolirane iz jednebubregpo životinji;bubregtkiva su usitnjena i digestirana u 2 mg/mL kolagenaze tipa I (Worthington) 30 minuta na 37 stupnjeva prema objavljenom protokolu. Plućne stanice sakupljene su probavom tkiva u PBS (Ca plus 2 i Mg plus 2) s 1 mg/mL kolagenaze tipa 1 i 60 U deoksiribonukleaze I. Cijele slezene su zdrobljene na 40 μm staničnom cjedilu i isprane otopinom RPMI. Puna krv i stanice iz slezene, koštane srži, bubrega i pluća tretirane su 1X puferom za lizu crvenih krvnih stanica (RBC) (BD Biosciences). Nakon izolacije/digestije, stanice iz svih tkiva su filtrirane (40 μm), isprane s PBS-om i resuspendirane u RPMI otopini prije brojanja.

Bojanje i analiza protočnom citometrijom.Stanice su tretirane s Fc Block TruStain FcX (Biolegend) i obojene bojom Zombie Aqua Viability (Biolegend) prema preporukama dobavljača. Stanice su isprane i površinsko bojenje je izvedeno korištenjem mišjih specifičnih fluorescentnih antitijela kupljenih od Biolegend-a. Različite populacije mijeloidnih stanica analizirane su u vratima živih imunoloških stanica (Zombie Aqua-CD45 plus). Kvantificirani su postotak i broj neutrofila (Ly6CintLy6Ghi) i monocita (Ly6C plus Ly6G−). Reprezentativno usmjeravanje protočne citometrije prikazano je u SI dodatku, slika S10. Postotna ekspresija i srednji intenziteti fluorescencije površinskih markera u PA modelu (CXCR4, ICAM1 i CXCR1) određeni su korištenjem kontrola bojenja fluorescencije minus jedan (FMO) u vratima neutrofila (Ly6Ghi). Svi uzorci obrađeni su protočnim citometrom CytoFLEX (Beckman Coulter), a podaci su analizirani softverom FlowJo verzija 10 (Tree Star).

Studije fotoaktivacije (PA).UBC-PA-GFP miševi su obrijani i dio leđa je ozračen jednom dozom UVB svjetla (500 mJ/cm2) kao gore. Samo područje kože koje će biti fotokonvertirano bilo je izloženo UVB svjetlu, dok je preostala koža prekrivena aluminijskom folijom. Nakon 24 sata od sterilne ozljede inducirane UVB zrakama, cijela regija kože ozračena UVB zrakama bila je podvrgnuta ljubičastom svjetlu (405 nm) pomoću diodne svjetiljke od 50 W s vlaknom numeričke aperture (NA) od 0,37 (Mightex) pri snazi od 100 mW (15 min izloženosti po površini). Ova je metoda optimizirana na temelju objavljenog protokola fotokonverzije specifične za kožu (80).Bubrezii pluća su sakupljena i obrađena za analizu protočnom citometrijom 24 sata nakon PA, kao što je gore opisano. Pristup i vremenski okvir prikazani su u dijagramu na slici 5A. Postotak GFP plus neutrofila ububreguspoređen je s onim pronađenim kod miševa pod tri kontrolna uvjeta: 1) bez UV-a i bez PA, 2) UV, ali bez PA, i 3) bez UV-a, ali PA. Razine ekspresije CXCR4 i fenotip ICAM1hiCXCR1lo unutar GFP plus i GFP− neutrofila u koži ibubregprocijenjena su protočnom citometrijom koristeći fluorescentno obilježena antitijela specifična za miševe kupljena od Biolegend-a. Kako bi se utvrdilo je li GFP plus neutrofili ububregpotječe iz kože, a ne iz krvi, koža u jednoj skupini miševa bila je izložena UV svjetlu i PA kao što je gore opisano (Skupina I), dok je u drugoj skupini koža bila izložena UV svjetlu, ali je PA izveden na susjednom području kože. nisu izloženi UV svjetlu (skupina II) (dijagram u dodatku SI, sl. S7A).Bubreziprikupljeni su i obrađeni za analizu protočnom citometrijom kako je gore opisano.

Ekspresija gena i proteomske analize.Koža,bubreg,a uzorci pluća pohranjeni su u otopini RNAlater (QIAGEN). RNA je ekstrahirana RNeasy Kitom od QIAGEN-a, a komplementarna DNA (cDNA) je sintetizirana korištenjem High Capacity cDNA Synthesis Kit (Applied Biosystems). Transkripti upalnih kemokina, citokina i adhezijskih molekula kvantificirani su qPCR-om u stvarnom vremenu upotrebom početnica navedenih u Dodatku SI, Tablica S1 i normalizirani na prosjek razina transkripata 18S. Korištena doza UVB svjetla nije utjecala na ekspresiju 18S ni u jednom organu. Relativna ekspresija mRNA ciljeva određena je pomoću standardne formule 2^(−Ct) × koeficijent. IFN rezultati izvedeni su iz ekspresije 10 reprezentativnih gena stimuliranih interferonom (ISG; Mx1, Irf7, Isg15, Isg20, Ifi44, ifit1, ifit3, oasl1, usp18 i ifi27l2a) kao što je prethodno opisano (6). Srednja vrijednost i SD relativne ekspresije svakog ISG-a određeni su ububregamiševa koji nisu bili izloženi UV svjetlu (meannoUV i SDnoUV). Oni su zatim korišteni za standardizaciju razina ekspresije svakog ISG-a u bubrezima tretiranih miševa (IgG izotip plus UVB ili a-GCSF plus UVB). Standardizirane razine ekspresije su zatim zbrajane za svakog miša kako bi se dobio rezultat ekspresije IFN-a; i=izraz svakog ISG-a; Tretman gena=relativna razina ekspresije gena nakon tretmana; i Gene inoUV=relativna razina ekspresije gena kod miševa koji nisu bili izloženi UVB svjetlu. ∑ 10 i=1=Geneitreatment−meanGeneinoUV SD(GeneinoUV ) . Razine proteina u plazmi i ekstraktima proteina kožnog tkiva mjerene su korištenjem definiranih panela analita LEGENDplex Panel za mišje upale i Inflammatory Chemokine Panel (Biolegend).

IF bojenje smrznutog bubrežnog tkiva.Perfuzirano fiziološkom otopinombubregafiksirani su u 4 posto paraformaldehida tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi i, nakon potapanja u 3 0 posto saharoze, zamrznuti u optimalnom mediju za rezanje (Sakura Finetek). Sekcije tkiva od 5- μm rehidrirane su u PBS-u prije IF bojenja. Tkiva su permeabilizirana s 0.1 posto Tritona X-100 u PBS-u i zatim blokirana u PBS-u plus 0,1 posto Tritona X-100/5 posto BSA (goveđi serumski albumin)/5 posto zečjeg seruma . NE i endotelne stanice detektirane su bojanjem s anti-mišjim NE Cy5 (1:100, Bioss) i anti-mišjim PECAM-1/CD31 Al488 (1:100, Biolegend), redom, na 4 stupnja preko noći. Prisutnost neutrofila ububregpotvrđeno je bojenjem s anti-mišjim Ly6G Al647 (1:100, Biolegend). Tkiva su montirana pomoću ProLong Golda s 4',6-diamidino-2-fenilindolom (DAPI) medijem za montiranje (Invitrogen) i snimljena fluorescentnim mikroskopom Nikon Eclipse 90i (Histology and Imaging Core, Sveučilište Washington).

Histološka procjena kože.Isječci kožnog tkiva fiksirani u formalinu, u parafinu (4 do 5 μm) obojeni su hematoksilinom i eozinom na Histologiji i slikovnoj jezgri Sveučilišta Washington prije UV-a, dan 1, dan 2 i dan 6 nakon UVB zračenja (n {{ 7}} ženke). Koža je ocjenjivana na slijepi način za sljedeće parametre: upala dermisa/potkožja, smrt epidermalnih stanica, akantoza, hiperkeratoza, stvaranje serocelularne kore i erozija/ulceracija. Ovi parametri ocijenjeni su na ljestvici od 0 do 4, ovisno o težini i opsegu, s izuzetkom erozije/ulceracije, koja je ocijenjena kao prisutna (1) ili odsutna (0). Reprezentativne slike snimljene su korištenjem NIS-Elements BR 3.2 64bit i postavljene u Adobe Photoshopu uz prilagodbe osvjetljenja primijenjene na cijelu sliku. Navedeno je izvorno povećanje.

Mjerenja urina.Razine proteina u mokraći procijenjene su Bradford testom proteina (Thermo Fisher Scientific). Uzorci urina testirani su u razrjeđenju 1:40 u PBS-u, a koncentracija proteina u urinu određena je na temelju serijskih razrjeđenja poznatih koncentracija BSA. Omjer albumin/kreatinin u urinu procijenjen je korištenjem Albuwellove analize albumina i Creatinine Companion Kita (Exocell) prema uputama proizvođača.

Prikupljanje ljudskih uzoraka i analiza protočnom citometrijom.Ovu studiju odobrio je Odbor za reviziju institucija Sveučilišta Washington (STUDY00001145). Puna krv je prikupljena u hepariniziranim epruvetama od zdravih dobrovoljaca i pacijenata sa SLE nakon informiranog pristanka. Neutrofili (PMN) i PBMC izolirani su Ficoll-Paque diskontinuiranim gradijentnim odvajanjem (GE Healthcare). PMN su pročišćeni iz taloga eritrocita sedimentacijom 5 posto dekstrana. Nakon lize crvenih krvnih zrnaca, stanice su obojene fluorescentno obilježenim antitijelima kupljenim od Biolegend-a, a ekspresija CXCR4 i postotak ICAM1hiCXCR1lo stanica procijenjeni su u PMN-ovima (CD66b plus) i LDG-ima (CD15 plus, CD14lo i CD10 plus u PBMC-ima (19)). Strategija usmjeravanja za LDG i ICAM1hiCXCR1lo bojenje na temelju FMO prikazana je u SI dodatku, slika S11. Uzorci su obrađeni protočnim citometrom CytoFLEX (Beckman Coulter), a podaci su analizirani softverom FlowJo verzija 10 (Tree Star).

Statističke analize.Podaci su analizirani korištenjem softvera GraphPad Prism 7 (GraphPad Software Inc.) i prikazani kao srednja vrijednost ± SEM. Statistička razlika između dvije skupine podataka određena je u odnosu na neozračene kontrole (D-1) koristeći Studentov test. Jednosmjerna ANOVA s višestrukim usporedbama i Tukey post hoc korištena je za određivanje statističke značajnosti između tri skupine.