Metode za stvaranje i procjenu modela zebrica bolesti ljudskih bubrega 1. dio
Apr 24, 2023
SAŽETAK
Poremećaji povezani s bubrezima pogađaju milijune ljudi diljem svijeta. Istraživanje bolesnika s kroničnom bubrežnom bolešću (CKB) pokazalo je da je teret bubrežnih bolesti svake godine sve veći. Studija globalnog tereta bolesti (GBD) iz 2017. svrstala je KBB na 12. vodeći uzrok smrti u svijetu. Stoga je identifikacija uzroka bubrežnih bolesti, razvoj točnih dijagnostičkih metoda i novih terapijskih lijekova od velike važnosti. Modelni organizmi koji vjerno rekapituliraju ljudske bolesti igraju važnu ulogu u razumijevanju procesa bolesti i pružaju dragocjenu osnovu za pronalaženje njihovog lijeka. Zebrica je izvrstan model za proučavanje razvoja, patofiziologije i molekularnih aspekata bolesti bubrega kod ljudi. U ovom pregledu sažimamo različite genetske i eksperimentalne manipulacije koje se mogu provesti na zebricama kako bismo bolje razumjeli patofiziologiju bolesti bubrega kod ljudi. Predlažemo da će ove metode pomoći u razvoju potencijalnih terapija za liječenje bolesti bubrega.
Prema relevantnim studijama,cistancheje tradicionalna kineska biljka koja se stoljećima koristi za liječenje raznih bolesti. Znanstveno je dokazano da posjeduje protuupalna, anti-age i antioksidativna svojstva. Istraživanja su pokazala da je cistanča korisna za bolesnike koji boluju od bolesti bubrega. Poznato je da aktivni sastojci cistanche smanjuju upalu, poboljšavaju rad bubrega i obnavljaju oštećene bubrežne stanice. Stoga, integracija cistanche u plan liječenja bolesti bubrega može ponuditi velike prednosti pacijentima u upravljanju njihovim stanjem. Cistanche pomaže smanjiti proteinuriju, snižava BUN i razine kreatinina te smanjuje rizik od daljnjeg oštećenja bubrega. Osim toga, cistanche također pomaže u smanjenju razine kolesterola i triglicerida što može biti opasno za pacijente koji pate odbolest bubrega.
Za više informacija:
David.deng
@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
KLJUČNE RIJEČI:CKD, AKI, model zebrice bolesti ljudskih bubrega, pronefros, bubrežna patologija
Uvod
Bubreg je jedan od vitalnih organa kod kralježnjaka koji uklanja otpadne tvari i održava pH, koncentracije iona i metabolita u krvi unutar fiziološkog raspona. Bubrezi luče eritropoetin koji regulira proizvodnju crvenih krvnih stanica i aktivira vitamin D koji pomaže kostima da apsorbiraju kalcij. U svakom ljudskom bubregu postoji oko milijun nefrona, koji su strukturne i funkcionalne jedinice ovog organa. Posljedično, defekti nefrona utječu na strukturu i funkcije bubrega. Do disfunkcije bubrega može doći zbog genetskih mutacija, infekcija, ozljeda, lijekova ili izloženosti toksičnim spojevima u okolišu. Kronične bolesti poput dijabetesa, kardiovaskularnih bolesti i hipertenzije uvelike pridonose teretu bubrežnih bolesti (Levey et al., 2010.). Poremećena funkcija bubrega povećava rizik od komplikacija i na drugim organskim sustavima (Thomas i sur., 2008.). Uobičajene vrste bubrežnih bolesti i njihovi uzroci navedeni su u tablici 1.
Bolesti bubrega
Bolesti bubrega doprinose značajnom udjelu globalnog opterećenja bolestima. Otprilike 750 milijuna ljudi diljem svijeta pati od poremećaja povezanih s bubrezima (Crews i sur., 2019.). Među njima je KBB najčešća s globalnom prevalencijom od 13,4 posto (Hill i sur., 2016.). Studija GBD-a iz 2010. svrstala je kroničnu bolest bolesti kao 18. vodeći uzrok smrti u svijetu, koji je skočio na 12. mjesto do 2017. zbog uzroka najvećeg broja smrtnih slučajeva na globalnoj razini (Jha et al., 2013.; Carney, 2020.). Prema GBD studiji iz 2017., u svijetu je prijavljeno oko 697,5 milijuna slučajeva kronične bubrežne bolesti, među kojima je 1,2 milijuna ljudi umrlo. Procjenjuje se da će broj smrtnih slučajeva uzrokovanih KBB-om porasti na 4 milijuna do 2040. u najgorem mogućem scenariju (Foreman et al., 2018.). Jedna trećina pacijenata s KBB-om živi u dvije zemlje, Kini i Indiji (Bikbov i sur., 2020.). Status CKD među indijskim stanovništvom je nejasan zbog nedostatka točnih sustava za prikupljanje podataka. U Indiji je 2017. godine prijavljeno oko 115 milijuna slučajeva kronične bubrežne bolesti (Bikbov i sur., 2020.). Najčešće bolesti u indijskom stanovništvu su dijabetes i hipertenzija (Geldsetzer i sur., 2018.). Prema izvješću Indijskog vijeća za medicinska istraživanja (ICMR), prevalencija dijabetesa i hipertenzije među odraslim gradskim stanovništvom je 28 posto odnosno 21,4 posto (Varma, 2015.). Između 40 do 60 posto slučajeva KBB-a nastaje zbog ovih komplikacija i njihov broj brzo raste (Rajapurkar i sur., 2012.). Podatkovni centar za bubrežne bolesti Međunarodnog nefrološkog društva izvijestio je o 16,8-postotnoj prevalenciji CDK među indijskom populacijom (Ene-Iordache et al., 2016.). Uzroci CKD razlikuju se diljem Indije. Andhra Pradesh, Odisha i Goa izvijestili su o visokim razinama KBB-a nepoznate etiologije poznate kao kronična intersticijska nefropatija (Varughese i Abraham, 2018.). Budući da broj pacijenata s kroničnom bubrežnom bolesti raste u cijelom svijetu alarmantnom brzinom, postoji hitna potreba za provedbom temeljite analize temeljnih uzroka uobičajenih bubrežnih bolesti kako bi se pronašli bolji načini za njihovu prevenciju i liječenje. Modelni organizmi koji mogu oponašati ljudsku fiziologiju i bolesna stanja mogu pružiti velike mogućnosti za rješavanje gore navedenih problema. Zebrice su postale koristan model za proučavanje razvoja i bolesti te pružaju obećavajuće načine za prepoznavanje novih terapijskih ciljeva i lijekova. U ovom smo pregledu raspravljali o različitim metodama za rekapitulaciju bolesti ljudskih bubrega kod zebrica i kako se ti modeli mogu koristiti za razumijevanje patogenosti bolesti i njezinih temeljnih molekularnih mehanizama. To može rezultirati stvaranjem novih terapijskih pristupa za upravljanje i liječenje bolesti bubrega.
Sličnosti između bubrega čovjeka i zebrice
Razvoj bubrega kod sisavaca jedinstven je jer se odvija kroz tri različite strukture tijekom embriogeneze: pronefros, mezonefros i metanefros. Prve dvije strukture su prolazne u sisavaca i samo metanefros postoji tijekom cijelog života (Smyth i sur., 2017.; Jain, 2014.). Pronefros je funkcionalni bubreg tijekom embrionalnog razvoja kod nižih kralješnjaka poput vodozemaca i riba, koji je zamijenjen mezonefrosom kao funkcionalnim bubregom u kasnijim fazama (Tahara i sur., 1993.; Diep i sur., 2015.). Tablica 2 opisuje vremensko trajanje različitih oblika bubrega kod ljudi, miševa, Xenopusa i zebrica.
Iako se ukupna složenost bubrega povećava kako se krećemo prema višim oblicima, nefroni su strukturne i funkcionalne jedinice svih vrsta bubrega. Svaki nefron ima tri dijela: bubrežno tjelešce za filtriranje krvi, tubule za apsorbiranje i izlučivanje otopljenih tvari i sabirni kanal za prikupljanje neželjenog otpada za izlučivanje. Tubularni epitel podijeljen je u različite segmente za obavljanje specifičnih funkcija. Nefroni iz svih oblika bubrega imaju sličan segmentacijski uzorak (Desgrange i Cereghini, 2015.). Segmentalna organizacija nefrona pronefrosa i mezonefrosa zebrice slična je metanefrosu sisavaca, kao što je prikazano na slici 1. Pronefrični tubul zebrice podijeljen je na proksimalni zavojiti tubul (PCT), proksimalni ravni tubul (PST) i distalni rani (DE) ) i distalnih kasnih (DL) tubula, koji su analogni obrascu segmentacije metanefričkih nefrona sisavaca. Zebrice imaju endokrinu žlijezdu nazvanu Stanniusova tjelešca (CS), koja održava homeostazu kalcija (Krishnamurthy, 1976.). CS nastaje transdiferencijacijom bubrežnih epitelnih stanica između DE i DL segmenata, koji se postupno odvajaju od tubula i tvore uparenu CS žlijezdu koja se nalazi retroperitonealno na površini bubrega kod odraslih riba (Roberts i Ellis, 2012.; Naylor). i sur., 2018). Jedna od glavnih razlika između nefrona zebrice i sisavaca je nedostatak Henleove petlje kod zebrice, koja djeluje kao protustrujni multiplikator za stvaranje medularnog osmotskog gradijenta za očuvanje vode. Ovaj segment nema nikakvu korist kod zebrice jer se radi o slatkovodnoj ribi (Elmonem et al., 2018.). Svaki segment posjeduje različite tipove stanica i genske ekspresije specifične za segment, koji su sačuvani među kralješnjacima (Verlander, 1998; Desgrange i Cereghini, 2015). Svi tipovi bubrega slijede slične putove razvoja. Sljedeća četiri stadija su sukcesivno uključena u razvoj nefrona; A: indukcija intermedijarnog mezoderma za formiranje bubrežnog primordija, B: epitelizacija i rast kanala nefrona, C: oblikovanje uzorka nefrona u specijalizirane segmente i D: vaskularizacija nefrona za filtraciju krvi (Drummond, 2003.).
Metode za generiranje modela zebrica bolesti ljudskih bubrega
Zebrice posjeduju jedan par pronefrosa koji se počinju formirati nakon 12 sati nakon oplodnje (hpf) i postaju potpuno funkcionalni nakon 48 hpf. Dostupnost cijele sekvence genoma, 71 posto ljudskih gena koji imaju barem jednog ortologa zebrice, lakoća rukovanja, transparentni embriji, kratko vrijeme stvaranja, učinkovite tehnike manipulacije gena, metode za stvaranje transgene ribe i njezin brzi pregled čine zebricu najprikladnijim modelnim organizmom za proučavati abnormalnosti bubrega (Howe i sur., 2013.; Poureetezadi i Wingert, 2016.). Jedna od ključnih značajki odraslih zebrica je njihova sposobnost regeneracije novih nefrona procesom neonefrogeneze kao odgovor na oštećenje bubrega (Chambers i Wingert, 2016.). Tablica 3 opisuje usporedbe između zebrica i drugih uobičajenih modela organizama poput miševa i Xenopusa. Genetske manipulacije u zebricama pokazale su da se nove genetske komponente razvoja i funkcije bubrega mogu identificirati pomoću ovog modela organizma (Poureetezadi i Wingert, 2016.). Postoji nekoliko metoda za stvaranje modela zebrica bolesti ljudskih bubrega.
Naprijed genetika
Prednji genetički ekran koristi se za identifikaciju gena koji su povezani s fenotipovima od interesa (Lawson i Wolfe, 2011.). I kemijska i insercijska mutageneza koriste se u prethodnim genetskim pregledima (Patton i Zon, 2001.). Kemijska mutageneza je probir koji se temelji na tri generacije u kojem se odrasli muškarci tretiraju kemijskim mutagenima kao što su etil metan sulfonat (EMS), etil nitrozourea (ENU) ili fizičkim mutagenima poput gama zračenja kako bi se stvorilo nekoliko mutacija u zametnim stanicama (Varshney i Burgess, 2014). Ribe koje nose mutacije zatim se križaju sa ženkama divljeg tipa kako bi se stvorile F1 ribe koje sadrže jedinstvene alele generirane mutacije. F1 ribe se križaju kako bi se stvorili F2 nositelji koji se zatim križaju kako bi se dobili njihovi homozigotni mutanti u F3 generaciji. Potomci koji imaju željene fenotipove zatim se izoliraju i koriste za genetsko mapiranje i sekvenciranje kako bi se identificirao mutirani gen (Patton i Zon, 2001.). Druge varijacije ovog pregleda, kao što je korištenje haploidnog i homozigotnog diploida, mogu pomoći u smanjenju vremena i truda potrebnog za identifikaciju fenotipa i uzročne genetske mutacije (o čemu su detaljno raspravljali Patton i Zon, 2001.). Transgene reporterske linije koje eksprimiraju fluorescentne proteine u organu od interesa mogu se kombinirati s konvencionalnim genetskim probirom za lakši pregled mutanata od interesa. Ispitivanje mutageneze temeljeno na ENU dovelo je do identifikacije žarulje (lib) mutirane zebrice koja pokazuje morfološke i segmentacijske nedostatke nefrona slične embrijima zebrice s nedostatkom retinoične kiseline (RA). Utvrđeno je da lib mutanti imaju prijelaz C u A na nukleotidu 174 aldh1a2, za koji se predviđa da sintetizira skraćeni protein duljine 58 aminokiselina, čime se ukida funkcija aldh1a2 i utječe na sintezu RA iz retinaldehida. Analiza lib, neckless (nls) mutanta koji ima točkastu mutaciju u katalitičkoj domeni aldh1a2 i DEAB (inhibitor sinteze retinoinske kiseline) tretiranih embrija otkrila je da razine RA moduliraju segmentaciju nefrona promjenom prostorne ekspresije faktora transkripcije specifičnih za segmente (Wingert i Davidson, 2011.; Begemann i sur., 2001.; Mullins i sur., 1994.). Drugi mutant nazvan Zeppelin pomogao je identificirati brac2 kao regulator razvoja podocita (Kroeger et al., 2017).
Insercijska mutageneza je metoda temeljena na transpozonu ili antivirusu koja se koristi za nasumično umetanje DNA u različite genomske lokuse, a ta strana DNA zatim pomaže identificirati mutirani gen (Amsterdam et al., 1999.). Laboratorij Hopkins na MIT-u izveo je test insercijske mutageneze u embrijima ribica zebrica koristeći retrovirusni vektor. Identificirali su 12 gena koji su bili povezani s defektnim fenotipovima bubrega koji pokazuju ciste u glomerularnoj tubularnoj regiji, među kojima su četiri bila povezana s formiranjem cilija (Sun et al., 2004.). Nedostaci naprednog genetskog pristupa su u tome što je proces probira glomazan i dugotrajan. Međutim, napredak u novoj tehnologiji sekvenciranja učinio je napredni genetički pristup mnogo učinkovitijim.
Izbacivanje gena pomoću programabilnih nukleaza
Jedna od glavnih prednosti korištenja zebrice kao modela organizma je dostupnost učinkovitih tehnika za uređivanje genoma kao što su CRISPR/Cas, TALEN i ZFN (Sertori et al., 2016.). CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/ Cas9 najsvestranija je i najčešće korištena tehnologija za uređivanje genoma zebrica. Himera CRISPR RNA (crRNA) i trans-aktivirajuće crRNA (tracrRNA) dizajnirana je kao jedna RNA vodiča (sgRNA), koja se zajedno s Cas9 proteinom/mRNA ubrizgava u embrije zebrice u fazi jedne stanice (Varshney et al. , 2016). SgRNA se veže na ciljnu sekvencu DNA od 20 bp uz protospacer susjedni motiv (PAM) NGG sekvencu u genomu, Cas9 zatim stvara dvolančani rez u ciljnoj sekvenci DNA. To se zatim poželjno popravlja nehomolognim spajanjem krajeva, što je mehanizam popravka sklon greškama koji rezultira generiranjem nasumičnog umetanja/brisanja (indel) što dovodi do promjena u okviru čitanja kodirajuće sekvence, i posljedično, poništava funkcije gena od interesa. Posljednjih godina razvijene su napredne metodologije za povećanje učinkovitosti tehnike uređivanja genoma temeljene na CRISPR-u (Liu et al., 2019.). Moguće je izbrisati veliki fragment DNK koristeći dvije ili više sgRNA odjednom (Kim i Zhang, 2020.). Također je moguće istovremeno učinkovito ciljati više gena u jednom embriju zebrice (Shah et al., 2016.). Provedena su mnoga istraživanja za stvaranje mutanata zebrice za rekapitulaciju ljudskih bubrežnih bolesti pomoću tehnologije CRISPR/Cas9. Izbacivanje proteina cilijarne membrane Arl13b posredovano CRISPR-om rezultiralo je stvaranjem mutanata koji oponašaju "Joubertov sindrom" (Cantagrel et al., 2008). Zabilježeno je da mutacije u ljudskom ELMO1 genu doprinose dijabetičkoj nefropatiji. elmo1 mutirane zebrice pokazuju fenotipove koji se vide u hiperglikemijskim embrijima nastalim rušenjem gena pdx1, kao što su veći glomerul, defektni podocit, kraći vrat i hiperfiltracija, čime se ističe očuvana funkcija ovog gena (Sharma et al., 2016.). Mutant magi2a zebrica pokazuje nefrotski sindrom otporan na steroide koji je također opažen kod ljudi s mutacijama u MAGI2 (Jobst-Schwan et al., 2019.). Ova opažanja naglašavaju prikladnost zebrice kao organizma za modeliranje ljudskih bubrežnih bolesti.
Još jedna metoda za generiranje mutanata zebrica jesu efektorske nukleaze slične aktivatoru transkripcije (TALEN) temeljene na uređivanju genoma. U ovoj tehnici, DNA vezna domena TALE sastoji se od monomera, pri čemu se svaki monomer sastoji od tandemskih ponavljanja od 34 aminokiselinska ostatka koji se vežu na određeni nukleotid u DNA sekvenci. Ove TALE sekvence izvedene su iz patogene bakterije Xanthomonas koja mijenja transkripciju gena u stanicama domaćina (Boch i Bonas, 2010.). TALEN ciljni konstrukt sastoji se od signala lokalizacije jezgre, domene za vezanje DNA i domene FokI nukleaze na njihovim karboksilnim krajevima. TALEN rade u parovima sa svojim veznim mjestima smještenim na suprotnim nitima DNK odvojenim razmaknicom od 12 do 25 bp. Konstrukti se vežu na ciljno mjesto u jezgri i generiraju dvolančani prekid, koji se zatim popravlja nehomolognim spajanjem krajeva (Liu et al., 2014.). Mutant zebrice generiran CRISPR-om ili TALEN-om može aktivirati gene koji kompenziraju gubitak gena od interesa, što otežava otkrivanje funkcije gena (Rossi i sur., 2015.). Međutim, moguće je identificirati te kompenzacijske gene analizom transkriptoma korištenjem metoda sekvenciranja sljedeće generacije (NGS), što može pomoći u identificiranju funkcije gena od interesa. Identifikacija gena i molekularnih putova koji kompenziraju gubitak funkcije gena može pomoći u pronalaženju novih metoda liječenja genskih mutacija koje uzrokuju ozbiljne bolesti (El-Brolosy i Stainier, 2017.).
Uništavanje gena korištenjem morfolino antisense oligosa
Morfolini su neanionski oligonukleotidi koji su relativno stabilni u usporedbi s njihovim DNA ili RNA oligomerima (Summerton, 1999.). Morfolino antisense oligonukleotidi vežu se za mRNA ciljnog proteina na njegovom mjestu inicijacije translacije i blokiraju njegovu translaciju. Druga vrsta morfolino antisense oligosa može ciljati spojeve spajanja i blokirati spajanje pre-mRNA (Summerton, 1999). Morfolino-antisense oligo učinak je prolazan i može se koristiti za proučavanje rane razvojne uloge gena od interesa. Injekcija morfolino-antisens oliga vrši se u stadiju 1-4 stanica embrija zebrice i njegov se učinak može vidjeti do 3-5 dana nakon oplodnje (pdf) (Bill et al., 2009.). Morfolino antisense oligonukleotidi često pokazuju efekte izvan cilja (Robu et al., 2007). Kontrolni pokusi kao što je pokus spašavanja trebali bi se izvesti ubrizgavanjem morfolino zajedno s mRNA koja ne može biti ciljana ovim antisense oligom kako bi se potvrdila njegova specifičnost (Eisen i Smith, 2008.). Razvijen je foto-aktivirani morfolino čija se aktivnost može prostorno i vremenski kontrolirati UV izlaganjem (Tallafuss et al., 2012.). Provedene su brojne studije korištenjem morfolino antisense oligo-posredovanog obaranja gena za razumijevanje bolesti bubrega kod ljudi. Na primjer, uništavanje gena za nefrocistin-3 dovelo je do stvaranja cista i hidrocefalije u embrijima zebrica na sličan način kao kod bolesti tipa nefronoftize-3 (Zhou et al., 2010.).
Aminoglikozidni antibiotici koji se općenito koriste za liječenje mnogih po život opasnih infekcija poznati su po svom nefrotoksičnom i ototoksičnom učinku (Mingeot-Leclercq i Tulkens, 1999.). Gentamicin je često korišteni antibiotik koji može izazvati akutnu ozljedu bubrega (AKI) kod zebrica. Gentamicin uzrokuje spljoštenje epitela četkastog ruba, gubitak tubularnog epitela, deformaciju strukture glomerula, lizosomsku fosfolipidozu i nakupljanje leukocita ili staničnih ostataka u tubularnom lumenu, što oponaša predoziranje gentamicinom u ljudi (Cianciolo Cosentino i sur., 2010.). Zebrice mogu regenerirati i zamijeniti oštećene nefrone. Insult gentamicina može se koristiti za proučavanje regeneracije bubrega kod zebrica (Kamei i sur., 2015.). Oštećenje gentamicinom izaziva reakciju regeneracije koja potiče matične stanice bubrega da prođu faze specifikacije, proliferacije i diferencijacije kako bi se stvorili novi nefroni. Za regeneraciju nefrona odraslim ribama potrebno je oko 14 do 21 dan (Diep i sur., 2011.; McCampbell i sur., 2015.). Cisplatin, koji se koristi kao kemoterapijski lijek za liječenje tumora, također ima nefrotoksične učinke, kao što je uočeno kod zebrica (Hentschel i sur., 2005.). Etimicin je još jedan aminoglikozid koji se može koristiti uz oponašanje niske nefrotoksičnosti i ototoksičnosti u embrija zebrice (Shao et al., 2020.). Stoga se AKI i regeneracija bubrega mogu proučavati kod zebrica uz pomoć ovih antibiotika.
Mehanička ozljeda bubrega
Pronefros zebrice može se fizički ozlijediti resekcijom, ubodom ili krioozljedom. Kirurška ozljeda može se izvesti korištenjem fine pincete za ubod željenog područja pronefrosa kako bi se stvorio model AKI. Ova tehnika je korištena za oštećenje pronefričnog kanala blizu kloake, što je ometalo protok tekućine i dovelo do stvaranja ciste unutar 30 minuta (Kramer-Zucker, 2005.). Utvrđeno je da smanjenje brzine protoka tekućine u pronefrosu stvara povratni tlak na mjestu ulaska tekućine, uzrokujući širenje lumena tubula i stvaranje ciste. Druga skupina istraživača napravila je opstrukciju u pronefričkom tubulu pri 50 hpf ili u mezonefričkom tubulu 12-mjesečnih zebrica pomoću pincete da bi odštipnula područje u blizini distalnih sabirnih tubula (Hellman et al., 2010.). Otkrili su da ožiljci u tubulima dovode do povećanja brzine lupanja cilija i pojačane regulacije transkripcijskog faktora foxj1a koji regulira ekspresiju lipogenog gena. Ovo sugerira da ozljeda pronefričkih tubula stvara mehanosenzorni signal temeljen na cilijama za održavanje homeostaze nefrona.
Ozljeda bubrega izazvana laserom
Laserski posredovana ablacija stanica koristi se kao alat za proučavanje bubrežne ozljede i oponašanja AKI-a kod zebrica. Johnson i sur., (2011.) opisali su metodu za laserski posredovanu ablaciju nakon koje slijedi praćenje regenerirajućih nefrona. Ubrizgali su 40 kDa dekstran-FITC u somite trupa embrija zebrice na 48-55 hpf kako bi označili epitelne stanice proksimalnih tubula, koje su zatim ciljane za laserski posredovanu ablaciju na 72 hpf. Abliranim embrijima je zatim ponovno ubrizgan rodamin dekstran da bi se pratile epitelne stanice proksimalnih tubula. Otkrili su da je potpuno razvijen proksimalni tubul formiran 7. dana nakon ablacije posredovane laserom (Johnson et al., 2011.). Druga alternativa je korištenje transgene linije specifične za bubrege za identifikaciju stanica za laserski posredovanu ablaciju i praćenje ponašanja susjednih stanica. Ljubičasto lasersko svjetlo valne duljine od 405 nm korišteno je za ciljanje pronefričnog tubula Tg(atp1a1a.4:GFP) zebrice (Palmyre et al., 2014.). Budući da spektri pobude GFP-a leže u rasponu od plave do ljubičaste svjetlosti, apsorbirao je lasersku svjetlost od 405 nm, koja djeluje kao ponor energije za potencijalno induciranje ozljeda na ciljnim epitelnim stanicama. Ovaj eksperiment je doveo do otkrića da je migracija stanica primarni odgovor ozlijeđenog epitela. Skupna migracija stanica uzrokovala je mehaničko istezanje koje je omogućilo stimulaciju stanične proliferacije za popravak ozlijeđenog tubula. Kako bi odredili vrijeme kada pronefrični tubul zebrice stječe sposobnost regeneracije, Yakulov et al., (2018) upotrijebili su 2-fotonski laser za ablaciju malog dijela pronefričnog tubula u Tg(cldn2b:lyn-GFP) embrije u različitim vremenskim točkama i pratili proces regeneracije. Otkrili su da je ablacija pronefričkih tubula 2-dnevnih embrija bila brzo popravljena migracijskim odgovorima, dok 1-dnevni embriji nisu imali tu sposobnost. Proveli su profiliranje genske ekspresije ozlijeđenih embrija zebrice i otkrili da su cxcr4b i liskun uključeni u ovaj proces popravka (Yakulov et al., 2018).
Kemijska genetika
Male bioaktivne molekule mogu se koristiti za ometanje funkcioniranja proteina i razumijevanje njihove biološke uloge. Velik broj kemijskih biblioteka dostupan je na tržištu ili se može izraditi po narudžbi za ispitivanje funkcija proteina. Te male biblioteke molekula uključuju inhibitore kinaze, inhibitore proteaze, nuklearne receptore i ligande koji se mogu koristiti za identifikaciju uloge signalnih putova uključenih u razvoj i funkciju organa (Kawasumi i Nghiem, 2007.). U posljednjih nekoliko desetljeća, zebrice su se pojavile kao snažan modelni organizam kralježnjaka za visokoučinkovito kemijsko ispitivanje i fenotipsko ocjenjivanje (Kaufman et al., 2009.). Cao et al., (2009.) upotrijebili su pristup kemijskog pregleda kako bi identificirali spojeve koji mogu preokrenuti fenotipove uzrokovane mutacijama u pkd2 (uzročni gen PKD) i ift172 (gen odgovoran za formiranje cilija). Otkrili su da inhibitor pan-histonske deacetilaze (pan-HDAC) trihostatin A (TSA) i inhibitor HDAC specifične klase I valproična kiselina (VPA) mogu suzbiti stvaranje bubrežne ciste u pkd2 knock-out modelu (Cao et al., 2009. ). Dakle, kemijska genetika može biti koristan alat za prepoznavanje novih kandidata za lijekove koji mogu preokrenuti ili potisnuti bolesna stanja.
Genetski inducibilni modeli oštećenja bubrega
Genetski inducibilni model ablacije tkiva može se koristiti kod zebrica u kojima se bakterijska nitroreduktaza (NTR) eksprimira pod kontrolom odabranog promotora koji pokreće ekspresiju NTR u određenom segmentu pronefrosa. NTR pretvara metronidazol u citotoksični metabolit koji može uzrokovati smrt stanica koje eksprimiraju NTR (Curado i sur., 2008.). Zhou i Hildebrandt (2012.) upotrijebili su ovu tehniku za induciranje oštećenja podocita ekspresijom NTR pod kontrolom promotora podocina u Tg(pod: NTR-mCherry) liniji zebrice. Također su razvili dvostruku transgenu liniju VDBP-GFP (Vitamin D binding protein tagged with GFP) kao tragač proteinurije zajedno s Tg(pod: NTR-mCherry) linijom. Liječenje metronidazolom uzrokovalo je oštećenje podocita što je rezultiralo edemom cijelog tijela i nakupljanjem VDBP-GFP u proksimalnim tubulima, oponašajući fenotip ljudskog nefrotskog sindroma (Zhou i Hildebrandt, 2012.).
Metode za procjenu razvoja i funkcije pronefrosa u ribica zebrica
Opisali smo metode za generiranje modela ljudske bubrežne bolesti korištenjem ribe zebrice. Stvaranje modela bolesti korištenjem drugog organizma početni je korak koji treba ocijeniti u pogledu njegove sposobnosti da vjerno rekapitulira različite aspekte bolesti viđene kod ljudi. Riba zebrica nudi mnoge prednosti koje se mogu koristiti za brzu procjenu njene sposobnosti da služi kao surogat za razumijevanje bolesti bubrega kod ljudi, kao što je objašnjeno u nastavku.
Probir temeljen na morfologiji
Najčešće mutirani embriji zebrice pokazuju morfološke razlike u usporedbi s divljim tipom, što se može lako procijeniti promatranjem pod mikroskopom. Transparentnost embrija zebrice i njihova sposobnost preživljavanja do 5 dana čak i s ozbiljnim razvojnim defektima velika je prednost u pregledima temeljenim na morfologiji. Uobičajene morfološke promjene primijećene u embrija zebrice s oštećenim pronefrosom uključuju perikardijalni edem, pronefrične ciste, zakrivljenu os tijela i hidrocefalus (Poureetezadi i Wingert, 2016.; Outtandy i sur., 2019.). Edem je jedan od uobičajenih znakova neispravnog bubrega koji se također vidi kod nedostataka drugih organa kao što je razvoj srca (Hanke i sur., 2013.). Mutanti s bubrežnim defektima mogu razviti ciste zbog druge ver-proliferacije epitelnih stanica, što se lako može uočiti pod mikroskopom (Zhao i Malicki, 2007; Yamaguchi et al., 2006). Zakrivljena os tijela često se vidi kod mutanata koji imaju defekte pronefričnih cilija. Mutanti zebrice kao što su Locke (lok), shen yantf214a(shy), garbustm304 (grb) i zatortg238a (zar) neki su drugi primjeri koji pokazuju zakrivljenu os tijela (Zhao i Malicki, 2007.). Mutanti zebrice s oštećenjima bubrega pokazuju višestruke morfološke nedostatke u istom embriju. Rušenje dva policistinska gena pkd1a i pkd1b dovelo je do oralno zakrivljene osi tijela, hidrocefalije, hrskavice i kraniofacijalnih defekata s niskom učestalošću pronefričnih cista (Mangos et al., 2010.). Mutanti intraflagelarnih transportnih proteina ift57, ift88 i ift172, gdje su cilije bile neispravne, imali su ventralno zakrivljenu os tijela (Lunt et al., 2009). Stoga mutanti zebrice s oštećenim bubrezima pokazuju mnoge morfološke značajke koje se mogu lako identificirati.
Za više informacija: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501
