Posredovani učinci ekstrakta Cistanche protiv starenja

kultura EZ

Endotelne stanice ljudske pupčane vene dobivene su iz American Type Culture Collection (Manassas VA, USA). Stanice su uzgajane na 37°C s 5 postotnim CO2 endotelnim medijem za rast-2 (EGM-2; Lonza, Walkerville, MD, SAD) s dodatkom 10 posto fetalnog goveđeg seruma (FBS). EC su uzgajani 48 sati na 37°C s 5 posto CO, u EGM-2 (kontrola) ili HG 30 mM mediju, sa ili bez dodatka različitih koncentracija Cistanche (1040 ug/mL).

Test viabilnosti stanica

Stanice su uzgajane na 37°C tijekom 72 sata u EGM-2 mediju dopunjenom s 2 posto FBS-a i različitim koncentracijama Cistanchea, te su tretirane otopinom MTT tijekom 4 sata. Rezultirajuće naslage formazana otopljene su dimetilsulfoksidom, gdje je apsorbancija izmjerena na 570 nm upotrebom VersaMax ELISA čitača mikropločica (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, SAD).

Ispitivanje migracije ogrebotina-rana

Stanice su ozlijeđene, a zatim su mediji kulture zamijenjeni svježim medijima koji sadrže različite koncentracije Cistanche. Stanice su održavane 24 do 48 h. Kad su bile pune migracije, stanice su snimljene pomoću mikroskopa (Olympus Optical Co, Ltd., Tokio, Japan). Migrirane stanice izbrojane su pomoću optičkog mikroskopa pri povećanju od 200x i kvantificirane ručno

SA-P-gal bojenje

To determine the number of senescent cells, SA-B-assays were performed using the SA-P-gal kit (Abcam)according to the manufacturer's instructions. Cells were fixed for 5 min in -gal fixative, washed with PBS, and then stained using -gal fixative solution at 37°C. This process was performed until p-gal staining was visible in either the experimental or control plate. SA-B-gal positive cells were observed via microscopy, with >500 stanica izbrojano pomoću tri neovisna polja.

Western blot analiza

Stanice su sakupljene i lizirane u otopini za ekstrakciju proteina (Intron Biotechnology, Inc, Gyeonggi, Koreja) koja sadrži inhibitore proteaze i fosfataze (10 min na 4°C). Ukupne koncentracije proteina u supernatantima mjerene su pomoću Bradfordovih testova. Nakon zagrijavanja na 95 stupnjeva tijekom 5 minuta, uzorci proteina (30 ug) su odvojeni elektroforezom na 8~12 posto natrij dodecil sulfat-poliakrilamid gelu. Proteini su zatim preneseni na membrane od poliviniliden fluorida (MilliporeBedford, MA, SAD) na 100 V tijekom 60 minuta. Membrane su inkubirane u 5 postotnom goveđem serumskom albuminu (BSA) u otopini Tris-puferirane fiziološke otopine (TBS) dopunjenoj s 0,05 posto TBS-a s Tweenom-20 (TBST) (30 minuta na sobnoj temperaturi), zatim inkubirane u 5 postotnom BSA u TBST dopunjenom primarnim antitijelima (1:200 do 1,000) (preko noći na 4'C). Zatim su membrane inokulirane s HRP-konjugiranim kozjim anti-zečjim ili anti-mišjim antitijelima (1:5,000) tijekom h, a proteinske trake su detektirane korištenjem poboljšanog pribora za detekciju kemiluminiscencije (Intron Biotechnology, Inc. ) i LAS-1000 Imager (Fuji Film Corp., Tokio, Japan). Semikvantitativna analiza rezultata denzitometrije provedena je pomoću Image J (National Institutes of Health, Bethesda, MD USA).

Mjerenje proizvodnje NO Koncentracije NO određene su detekcijom koncentracije nitrita korištenjem kompleta za ispitivanje NO, prema uputama proizvođača. Optičke gustoće određene su pri 560 nm pomoću čitača mikropločica, a koncentracije su izračunate pomoću kalibracijske krivulje

Statistička analiza

Rezultati su izraženi kao srednja vrijednost plus standardna devijacija (SD). Statistička značajnost određena je jednosmjernom analizom varijance (ANOVA). Post hoc usporedbe između skupina provedene su korištenjem Bonferronijevih testova višestrukih usporedbi. Svi izračuni izvedeni su pomoću SPSS-a u sustavu Windows (v.23.0; IBM Corp, Armonk, NYUSA) i P-vrijednosti<0.05 were considered statistically significant.

REZULTATI I RASPRAVA

Citotoksičnost Cistanche

Kako bi se odredila citotoksičnost Cistanchea na ECs, stanice su inkubirane s različitim koncentracijama Cistanchea (0 do 100 ug/ml) tijekom 72 sata. Cistanche je pokazao značajnu citotoksičnost (P<0.05) at concentrations >50 ug/ml u svim točkama liječenja (slika 1). Stoga, koncentracije Cistanche od<50ug/ml were considered non-toxic to ECs and were used in subsequent experiments.

Put protein-kinaze aktiviran mitogenom (MAPK) regulira ključne procese uključene u razvoj vaskularnog EC-a, kao što su stanična proliferacija, invazija, metastaze i preživljavanje te angiogeneza (Pišlar i sur., 2015.). MAPK uključuje ERK, c-Jun N-terminalnu kinazu i p38 (Kim i Choi, 2010.). ERK i p38 važni su signalni proteini uključeni u zacjeljivanje rana, dok ERK igra važnu ulogu u kontroli migracije stanica, proliferacije, diferencijacije i preživljavanja (Roskoski, 2012.). U nedavnoj studiji, sugerirano je da je signalni put p38 MAPK uključen u zacjeljivanje rana (Loughlin i Artlett, 2011.; Kim i sur., 2019.; Wang i sur., 2019.). U ovoj studiji ispitali smo ekspresiju proteina ERK i p38 kako bismo identificirali signalne putove uključene u EC migraciju reguliranu Cistancheom. Liječenje Cistancheom (40 µg/mL) povećalo je migraciju EC 1.5-puta u odnosu na kontrolu (P<0.05) (Fig. 2A). Western blot analysis showed that Cistanche treatment (20 to 40 g/mL) significantly increased phosphorylation of ERK in ECs (P<0.05). Furthermore, Cistanche increased phosphorylation of p38 in a concentration-dependent manner; in particular, treatment with 40 g/mL Cistanche, increased activation of p38 >2.5-sklop više od kontrole (str<0.01) (Fig. 2B). These results show that 

Sl. 1.Učinci odCistanche(Cistanche) na vitalnost stanica. Stanice su tretirane Cistancheom (0 do 100g/mL) tijekom 72 h. Viabilnost stanicaje izračunat kao postotak živih stanica uzgojenih uodsutnost Cistanche. Rezultati pokazuju srednju vrijednost±SD. *P<0.05.