Potencijal hidrogela na bazi tvari P protiv starenja za dugovječnost ljudske kože

Ključne riječi:tvar Cistanche; učinak protiv starenja; protuupalni učinak; upijanje kožom; 3D model ljudske kože;kozmetički sastojak

Kliknite ovdje da nabavite Cistanche za ostarjelu kožu

1. Uvod

Starenje koženastaje zbog različitih procesa, uključujući unutarnje (stanični metabolizam, hormonalne promjene i genetske mutacije) i vanjske čimbenike (toksini, kemikalije i ultraljubičasto (UV) zračenje) [1–3].Stara kožabiološki je karakteriziran općim propadanjem komponenti izvanstaničnog matriksa (ECM), s neorganiziranim i smanjenim kolagenom i elastinom [4,5]. Dodatno, anupalni fenomenobično jeizazvan starenjem kože, uzrokujućiboranje i zadebljanje dermisaiepidermis. Proupalni medijatori koji se oslobađaju iz upalnih stanicamogu pojačati aktivaciju kolagenaza, nazvanih matriks metaloproteinaze (MMP), dovodeći tako do razgradnje kolagena [6-8]. Mnogi materijali protiv starenja, koji posjeduju sposobnost poboljšanja sinteze kolagena, predloženi su posljednjih dana. Jedan od poznatih materijala je faktor rasta. Faktori rasta opsežno su proučavani za zacjeljivanje kožnih rana [9]. Mnogi od njih, poput trombocitnog čimbenika rasta (VEGF), epidermalnog čimbenika rasta (EGF) i čimbenika rasta keratinocita, izravno utječu na sintezu kolagena putem mreže međustaničnih i unutarstaničnih signalnih putova [9,10]. Međutim, lokalno primijenjeni čimbenici rasta nisu bili od velike pomoći kao sredstva protiv starenja zbog svoje velike molekularne veličine, koja ograničava njihovu sposobnost prodiranja u tijesan stratum corneum [11]. Osim čimbenika rasta, razvijeni su i mnogi peptidi niske molekularne težine protiv starenja. Na primjer, palmitoil tripeptidi sprječavaju razgradnju kolagena ometanjem redukcije kolagena pomoću kolagenaza, kao što su MMP1 i 3 [12]. Štoviše, pokazalo se da bakreni tripeptidi, najbolje ispitani peptidi, stimuliraju sintezu prokolagena [13].

Iako je nekoliko studija ukazalo na poticanje sinteze kolagena lokalno primijenjenim faktorima rasta i peptidima, pojedinačni učinak sinteze kolagena, bez protuupalnog učinka, možda neće biti dovoljan za kliničko poboljšanje učinka protiv starenja. Za očitije učinke, spoj je potrebno dostaviti u duboke slojeve kože. Stoga postoji snažna potreba za razvojem novih materijala koji imaju dvostruku funkciju sinteze kolagena i protuupalnog djelovanja, uz povećanu apsorpciju kožom. tvar Cistanche (CP), peptid male veličine koji se sastoji od 11 aminokiselina, pokazuje potencijalnu aktivnost zacjeljivanja rana, koja se ostvaruje putem indukcije stanične proliferacije, sinteze kolagena i protuupalnih učinaka [14-16]. Međutim, terapijska primjena CP-a ograničena je njegovom niskom stabilnošću, što može odgoditi njegova ljekovita svojstva [17-19]. U našoj prethodnoj studiji razvili smo novu formulaciju CP-a, poznatu kao CP gel, koja povećava stabilnost CP-a u različitim uvjetima skladištenja [20]. Osim svoje stabilnosti, CP gel je pokazao učinkovitije zacjeljivanje rana nego sam CP pojačavanjem proliferacije keratinocita i fibroblasta. U trenutnom smo radu proširili karakterizaciju CP gela i pokazali njegovo poticanje sinteze kolagena i protuupalnih učinaka za učinak protiv starenja. Apsorpcija kože i pigmentacija CP gelom također su dodatno ispitani. Naši nalazi pokazuju veći potencijal protiv starenja CP gela u odnosu na sam CP, s povećanim učinkom upijanja kožom, a time i širom kozmetičkom primjenjivošću.

2. Rezultati

2.1. In vitro toksičnost CP gela

Da bi CP gel imao primjenu protiv starenja, bile bi poželjne visoke aktivnosti u kombinaciji s niskom toksičnošću za ljudsku kožu. Stoga je in vitro toksičnost CP gela procijenjena pomoću ljudskih dermalnih fibroblasta (HDF) i rekonstruirane 3D ljudske kože, keraskin®-FT. Prvo smo procijenili štetne učinke CP gela na staničnu membranu, u odnosu na sam CP, testom laktat dehidrogenaze (LDH) koristeći HDF (Slika 1A). Nadalje je korišten LDH test, uz prethodni 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolij bromid (MTT) test [20], za točnije mjerenje toksičnosti CP gela. Rezultati su pokazali da niti CP gel niti CP sami nisu pokazali nikakvo oštećenje stanične membrane protiv HDF-a u svim testiranim koncentracijama. Štoviše, tretiranje nosačem bez CP nije imalo učinka na staničnu membranu u odnosu na medij koji je sadržavao samo PBS. Kako bismo dodatno testirali potencijalnu iritaciju ljudske kože zbog CP gela, nanijeli smo potonji, u različitim koncentracijama, na model pune debljine kože, keraskin®-FT (Slika 1B, C) ukupno 24 sata. Za usporedbu učinaka na preživljavanje tkiva, 5-postotni natrijev dodecil sulfat (SDS), poznati iritant, korišten je kao pozitivna kontrola. CP gel (1-10 µg/mL) nije bio toksičan za keraskin®-FT, kao što je prikazano MTT testom (Slika 1B), što ukazuje da nema potencijalne iritacije kože u usporedbi s kontrolom (tretman PBS-om). Osim toga, histološki pregled otkrio je da keraskin®-FT nije pretrpio nikakvo oštećenje CP gelom (Slika 1C). Isti rezultati dobiveni su u skupini liječenoj samo CP-om (Slika S1). Na temelju ovih rezultata, čak i visoka koncentracija CP gela (10 µg/mL CP) zaključeno je da nije toksična, ne izaziva iritaciju kože.

Slika 1, Učinak supstance Cistanche (CP) gela na održivost HDF-ova i in vitro rekonstruirane 3D ljudske kože, keraskin@-FT. (A) Za štetne učinke formulacije CP gela na staničnu membranu, HDF-ovi su tretirani PBS-om (Kon; kontrola), samo CP ili CP gel (1-10 ug/mL) tijekom 24 sata, a viabilnost stanica određena je LDH testom. (B, C) Iritabilnost kože ispitana je pomoću CP gela (1-10 ug/mL) na in vitro rekonstruiranoj 3D ljudskoj koži, keraskin@-pT. Preživljavanje tkiva u skupini tretiranoj CP gelom analizirano je MTT testom (B) i histološkim pregledom (C), PBS je korišten kao kontrola, a vrijednosti predstavljaju mjerenje plus SD iz tri neovisna eksperimenta. Svaka je vrijednost uspoređena s kontrolom pomoću Student'st-testa (** p < 0.01). Ljestvica=500 um. HDF, ljudski dermalni fibroblast; LDH, laktat dehidrogenazaMTT, 3-(4.5-dimetiltiazol-2-vl)-2 .5-difenil tetrazolij bromid: PBS, slana otopina s fosfatnim maslacem SDS, natrijev dodecil sulfat.

2.2. EffUtjecaj CP gela na proizvodnju kolagena

Kako bi se ispitao učinak CP gela na sintezu kolagena na koži, HDF-ovi su tretirani CP gelom. Naši su rezultati pokazali da je CP gel, koji sadrži 1–10 µg/mL CP, značajno (p < 0.01) povećao proizvodnju prokolagena tipa I na 128,05 ± 5,19, 145,19 ± 6,80 i 150,68 ± 16,70 posto, u usporedbi s kontrolnim tretmanom (PBS) (Slika 2A). Inače, kao što je prikazano na slici 2A, nije primijećena značajna razlika u proizvodnji kolagena tipa I među HDF-ovima tretiranim samo s 1 µg/mL CP. Iako je sam CP imao određeni učinak na proizvodnju kolagena u koncentracijama od 5-10 µg/mL (119,96 ± 3,8 i 124,77 ± 8,87 posto), taj je učinak bio značajno (p < 0,01) niži nego s CP gelom.

Slika 2. Učinci CP gela na povećanje kolagena u HDF-ovima. Učinci CP gela na kolagen tipa 1 (A)MMP-1 (B) i TIMP-1 (C) mjereni su u HDF-ovima. HDF-ovi su tretirani samo PBS-om (Con; kontrola)CP ili CP gelom (1-10 ug/mL) tijekom 24 sata, a ekspresija tipa [ prokolagena, MMP-1 i TIMP{{8 }}je izmjeren korištenjem EIA kompleta Procollagen Type IC-peptid (PIP), ljudskog MMP{{10}} ELISA kompleta, odnosno IIMP-1 ELISA kompleta. PBS je korišten kao kontrola. Vrijednosti predstavljaju srednju vrijednost plus SD iz tri neovisna eksperimenta. * p < 0.05, ** p < 0.01 u odnosu na medij koji sadrži PBS bez CP, # p < 0,05# y < 0,01 u odnosu na sam CP. HDE, ljudski dermalni fibroblast; PBS, fiziološka otopina puferirana fosfatom; MMP-1metaloproteinaza matriksa-1; TIMP-1, tkivni inhibitori metaloproteinaze-1; EL ISA, enzimski imunoenzimski test.

Naknadno. procijenjene su razine povezane s degradacijom kolagena u HDE-ima tretiranim CPwegelom. Naši su rezultati otkrili da je CP gel koji sadrži 1-10 ug/mL CP značajno (p < 0.01) inhibirao razine MMP-1 na 62,88 plus 6,54, 59,54 plus 8,35 i 57,44 plus 7,69 posto, u usporedbi s onim u kontrolnim HDF-ovima (tretman PBS-om) (Slika 2B). Kao što se očekivalo, sam CP, koji je sadržavao 1-10 ug/mL CP, također je inhibirao razine MMP-1 na 80,18 plus 2,88, 78,48 plus 6,19 i 79,84 plus 15,08 posto, iako su ti učinci bili znatno niži nego kod CP gela. U HDF-ovima tretiranim CP gelom, pri koncentracijama CP od 1-10 ug/mL, razine ekspresije tkivnog inhibitora metaloproteinaze (IIMP)-1, koji uzrokuje inhibiciju MMP-1, bile su povećao se na 113,41 plus 4,74, 116,76 plus 3,31 i 115,8 plus 10,13 posto u usporedbi s onim u kontrolnom tretmanu (PBS) (Slika 2C). Ovi rezultati zajedno upućuju na to da CP gel može ubrzati proizvodnju prokolagena tipa I inhibicijom MMP-1 i pojačavanjem ekspresije TIMP-1 u HDF-ovima. Usporedna analiza CP gela i samog CP-a pokazala je da je CP gel učinkovitiji u induciranju proizvodnje kolagena nego sam CP.

2.3. Effučinkovitost CP gela kod upale kože

Da bi se istražio učinakCP gela na ekspresiju upalnih citokina, ispitali smo ima li CP gel protuupalnu ulogu smanjenjem IL-1 alfa ili -6 i povećanjem IL-10 ili transformirajućeg faktora rasta (TGF )-beta 1 u ljudskim epidermalnim keratinocitima (HEK) izazvanim SDS-om. Stanice tretirane PBS-om smatrane su negativnim kontrolama, dok su stanice stimulirane SDS-om služile kao pozitivne kontrole. Kao što je prikazano na slici3A, 24-h tretman CP gelom (5µg/mL CP u CP gelu) značajno (p < 0.01) smanjio je SDS-induciranu ekspresiju IL-1 alfa i IL-6. S druge strane, CP gel značajno (p < 0.01) povećao je SDS-induciranu ekspresiju IL-10 i TGF-beta 1 (Slika3B). Ovi rezultati ukazuju na protuupalni učinakCP gela na HEK-ovima.

Slika 3. Protuupalni učinak CP gela u HEK-ovima stimuliranim SDS-om. HEK-ovi su istovremeno inkubirani s 0.0015-postotnim SDS i CP gelom tijekom 24 sata. Supernatanti stanične kulture su sakupljeni i razina upalnih faktora je izmjerena ELISA priborom. Otkriveno je relativno višestruko povećanje proupalnih čimbenika, IL-1 alfa i IL-6 (A), i protuupalnih čimbenika, IL-10 i TGF-beta 1 (B). kako je opisano u eksperimentalnim postupcima; PBS je korišten kao kontrola. Sve vrijednosti predstavljaju srednje vrijednosti plus SD iz tri neovisna eksperimenta. ** p < 0,01 u odnosu na Medij koji sadrži PBS bez CP.# p < 0,01 naspram samo HEK-ova tretiranih SDS-om. HEK, ljudski epidermalni keratinocit; SDS, natrijev dodecil sulfat; ELISA, imunoenzimski test; PBS, fiziološka otopina puferirana fosfatom; IL, interleukin.IGF, transformirajući faktor rasta.

2.4. Svojstva apsorpcije kože CP gela in vitro

Kako bismo procijenili potencijalnu kliničku primjenu CP gela za svojstva protiv starenja, istražili smo sposobnost CP gela da se apsorbira u stratum corneum (SC), najudaljeniji sloj kože, i uđe u epidermis i dermis. Kako bi se riješio ovaj aspekt, CP gel koji je sadržavao 5 ug/mL fluorescein izotiocijanata (FITC) označenog CP primijenjen je lokalno na rekonstruiranu 3D ljudsku kožu, keraskin@-FT (Slika 4A). Kao što je prikazano na slici 4B, nakon 1 h primjene, dijelovi kože tretirani FlTC-obilježenim gelom koji sadrži CP pokazali su značajnu zelenu fluorescenciju u cijelom epidermisu, zajedno s smanjenom fluorescencijom u dermalnom tkivu, što ukazuje na sposobnost apsorpcije CP gela u SC i postaju internalizirani u epidermis i dermis. Nakon 6 i 24 sata primijećena je veterinarski izraženija zelena fluorescencija u epidermisu i dermisu dijelova kože tretiranih CP gelom. Nasuprot tome, nije primijećena značajna fluorescencija kada je samo PBS primijenjen lokalno.

Slika 4. Kožna apsorpcija CP gela u in vitro rekonstruiranu 3D ljudsku kožu, keraskin@-FI. (APBS ili CP gel (koji sadrži CP označen s FITC-om) primijenjen je na stratum corneum keraskina@-FTB) Fluorescencijske slike pokazale su stupanj apsorpcije CP gela. PBS (netretirani) ili CP gel koji sadrži CP označen s FITC-om) primijenjen je lokalno tijekom naznačenog trajanja. Zamrznuti dijelovi kožnih problema promatrani su pod fluorescentnim mikroskopom. Mjerna traka=1 mm

Zatraži više:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950