Aktivacija makrofaga saharidima niske molekularne težine iz Cistanche Deserticola

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

［Apstpričati］

Istražiti učinak aktivacije imuniteta i mehanizam saharida niske molekulske mase izCistanche deserticola(LMSC) na peritonealnim makrofagima miša, RAW264. 7 stanica. RAW264. 7 stanica podijeljeno je u normalnu kontrolnu skupinu, LPS pozitivnu kontrolnu skupinu i LMSC tretirane skupine. RAW264. 7 stanica tretirano je različitim koncentracijama LMSC od 3,91 do 62,5 g·L - 1. Test neutralnog crvenog korišten je za otkrivanje fagocitne aktivnosti makrofaga. Otpuštanje NO detektirano je upotrebom NO kita i razine ekspresije proteina povezane s aktivacijom makrofaga (TNF-, IL-6, IKK, p-IKK, IκB, p-IκB, NF-κB i p-NF-κB) otkriveni su Western blotom. Rezultati su pokazali da LMSC ima aktivacijski učinak na makrofage; može značajno povećati otpuštanje NO u RAW264. 7 stanicama i potiču ekspresiju citokina TNF- i IL-6. Štoviše, LMSC je značajno povećao fosforilaciju IKK, IκB i NF-κB p65. Nadalje, manitol je jedan od glavnih sastojaka u LMSC-u značajno pojačao fagocitnu aktivnost makrofaga. Ovi rezultati su pokazali da bi LMSC mogao aktivirati makrofage pojačanom regulacijom NF-κB signalnog puta, a manitol bi mogao biti jedna od glavnih aktivnih komponenti u LMSC.

［Ključne riječi］ Saharidi niske molekularne težine; Cistanche deserticola; aktivacija imuniteta; makrofag; upalni faktor; NF-κB

Cistanche deserticola YC Maje biljka koja pripada roduCistanche deserticolaYC Ma. Njegova mesnata stabljika može se koristiti kao lijek. Ima funkciju njege yanga bubrega, njege esencije i krvi te hidratacije crijeva. Poznat je kao "pustinjski ginseng". Kemijske komponente Cistanche uključuju feniletanoidne glikozide, iridoidne glikozide, šećere, lignane i mnoge druge vrste. Suvremene farmakološke studije otkrile su da Cistanche ima mnoge biološke aktivnosti kao što su neuroprotekcija, antitumorska, imunološka regulacija, protuupalna i antioksidativna [1]. Istraživanja su pokazala da dekokcija Cistanche i polisaharidi mogu značajno poboljšati fagocitnu sposobnost i funkciju izlučivanja makrofaga [2-3]. Međutim, nema izvješća o istraživanju aktivnosti njegovih niskomolekularnih ugljikohidrata. Stoga je ova studija koristila in vitro sustav kulture RAW264. 7 mišjih peritonealnih makrofaga za istraživanje imunomodulatorne aktivnosti i srodnih mehanizama Cistanche ugljikohidrata niske molekularne težine. Ovo istraživanje može pružiti više eksperimentalnih dokaza za sveobuhvatno razumijevanjeCistanchein imunomodulatorni učinaku budućnosti, kako bi se dalje usmjeravala njegova klinička primjena.

Cistanche deserticola ima mnoge učinke, kliknite ovdje da biste saznali više

1. Materijali

RAW264. 7 stanica kupljeno je od Staničnog centra Kineske akademije medicinskih znanosti; fetalni goveđi serum (FBS) je kupljen od PAN Biotech, Njemačka; antibiotici i DMEM medij su nabavljeni od Zhongke Machen Technology Co., Ltd. Lipopolisaharid iz Escherichia coli O55:B5 (LPS) je kupljen od Sigma Company, SAD. Komplet za dušikov oksid (NO) kupljen je od Nanjing Jiancheng instituta za bioinženjering. ECL kemiluminiscencijski kit je kupljen od Thermo Fisher, SAD; antitijelo je kupljeno od Cell Signaling Technology, SAD; Ukupne glikozide cistanche cistanche, niskomolekularne šećere cistanche i polisaharide cistanche sama je proizvela naša istraživačka grupa. Maseni udio ukupnih glikozida cistanhe bio je 78,76 posto. Maseni udio niskomolekularnih šećera odCistanche deserticolaje 58. 00 posto i maseni udio odCistanche deserticolapolisaharida je 65. 24 posto . Tanon-5200Multi gel slikovni split sustav kupljen je od Shanghai Tianneng Technology Co., Ltd.; Čitač mikropločica Sunrise-Basic kupljen je od tvrtke TECAN.

2. Metoda

2. 1 Neutralna crvena metoda za mjerenje fagocitne aktivnosti makrofaga

Uzmite mišje peritonealne makrofage u logaritamskoj fazi rasta, nakon tripsinizacije, prebrojite stanice, podesite broj stanica na 5 × 104 stanica/mL i inokulirajte ih u 96-pločicu za kulture stanica, 100 μL/jažici , na 37 stupnjeva Kultivirano pod uvjetima od 5 posto CO2, nakon što se stanice priljube na stijenku, odbacite supernatant kulture, dodajte DMEM medij (10 posto FBS plus 1 posto P/S), LPS (1 mg·L － 1) i Cistanche cistanche odnosno ukupni glikozidi,Cistancheukupni polisaharidi i šećeri niske molekularne težine Cistanche cistanche (3,91 ~ 62,5 g·L -1, filtrirani filtarskom membranom prije primjene) su uzgojeni. Nakon uzgoja od 48 sati, dodajte 100 μL 0,075 posto neutralne crvene fiziološke otopine u svaku jažicu, nastavite s uzgojem 4 sata, aspirirajte supernatant, isperite 3 puta s PBS-om, dodajte stanični lizat (ledene octene kiseline -etanol 1:1) 100 μL, stavite na 4 stupnja 2 sata i izmjerite apsorbanciju (A540 nm) nakon što su stanice lizirane.

2. 2 Detekcija količine otpuštenog NO u staničnom supernatantu

Inokulirajte RAW264. 7 stanica u 48-ploču s jažicom (1 × 105 stanica/mL, 500 μL/jažici), aspirirajte medij stanične kulture nakon inkubacije preko noći, dodajte DMEM medij (10 posto FBS plus 1 posto P/S), 500 μL LPS-a (1 mg·L -1) i ukupnih glikozida Cistanche cistanche, ukupnih polisaharida i šećera niske molekularne težine (3,91 ~ 62,5 g·L -1). Nakon 24 sata indukcijske kulture, supernatant je sakupljen. Odredite koncentraciju NO u staničnom supernatantu svake skupine pomoću NO kita, slijedite upute i na kraju detektirajte apsorbanciju (A570 nm) čitačem mikropločica

2. 3. Western blot

Inokulirajte RAW264. 7 stanica u 6-ploču s jažicama, aspirirajte medij stanične kulture nakon inkubacije preko noći, dodajte DMEM medij (10 posto FBS plus 1 posto P /S), LPS (1 mg·L － 1) iCistancheukupni polisaharidi i šećeri niske molekularne težine (3,91 ~ 62,5 g·L -1) bili su po 2 mL, a supernatant je bačen nakon 24 sata indukcijske kulture. Stanice su isprane dva puta s PBS-om i odbačene. Nakon tripsinizacije, stanice se pipetiraju. Centrifugirajte, uklonite supernatant, dodajte 100 μL pufera za lizu NP40 i lizirajte na ledu 40 minuta. Nakon centrifugiranja uzet je supernatant, te je BCA metodom određena koncentracija proteina te je ravnomjerno podešena koncentracija proteina svakog histona. Uzmite istu količinu uzoraka proteina i odvojite ih na 12 postotnoj SDS-PAGE pod stalnim pritiskom. Zatim upotrijebite spremnik za prijenosnu elektroforezu Bio-Rad za prijenos membrane konstantnom strujom od 350 mA tijekom 1 sata i prenesite protein na PVDF membranu (prethodna obrada PVDF membrane: potopite u metanol i uravnotežite s puferom za prijenos). Nakon blokiranja s 5 posto obranog mlijeka (konfiguriranog s TBST-om koji sadrži 0,1 posto Tween-20) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, membrana je isprana 3 puta s TBST-om, a membrana je inkubirana u razrjeđivaču proteinskog primarnog antitijela na 4 stupnja preko noći. Membrana je isprana 3 puta s TBST svaki drugi dan, te je dodan odgovarajući razrjeđivač za inkubaciju 1 h. Membrana je isprana 3 puta s TBST, a trake su razvijene s ECL kemiluminiscentnim razvijačem.

2. 4 analiza podataka

Podaci su izraženi kao x ± s, a značajnost razlike testirana je pomoću statističkog softvera GraphPad Prism 6 za jednosmjernu analizu varijance. Uzmi P<0.01 as="" a="" very="" significant="" difference,="" and=""><0.05 as="" a="" significant="">

3. Rezultati

3. 1. Učinci niskomolekularnih šećera Cistanche cistanche, ukupnih glikozida i ukupnih polisaharida na fagocitnu aktivnost RAW264. 7 stanica

To pokazuju istraživanja kemijskih komponenti CistancheCistancheuglavnom sadržifeniletanoidni glikozidi, iridoidni glikozidi i ugljikohidrati. U ovom eksperimentu odabrani su ukupni glikozidi cistanhe (uključujući glikozide fenetilnog alkohola i iridoidne glikozide), niskomolekularni šećeri i šećeri. Tri aktivna mjesta ukupnih polisaharida istražena su zbog njihovih učinaka na aktivaciju RAW264. 7 stanica. I polisaharid Cistanche cistanche i niskomolekularni šećer cistanche mogu značajno povećati fagocitnu aktivnost RAW264. 7 stanica, ali se fagocitna aktivnost skupine koja je primila ukupni glikozid ne mijenja značajno. Uz to, lijek pozitivne kontrole LPS također je značajno poboljšao fagocitnu aktivnost RAW264. 7 stanica, kao što je prikazano na slici 1. Gornji rezultati sugeriraju da šećeri niske molekularne težine i polisaharidi Cistanche mogu imati učinak aktiviranja RAW264. 7 stanica.

3. 2. Učinak Cistanche ukupnih glikozida, niskomolekularnih šećera i ukupnih polisaharida na sadržaj dušikovog oksida (NO) u staničnom supernatantu

Kako bi se dalje istražio učinak aktivacije tri aktivna mjesta Cistanche na RAW264. 7 stanica određen je sadržaj NO u supernatantima stanica stimuliranim različitim lijekovima. Rezultati su pokazali da je oslobađanje NO u skupini koja je primala LPS bilo značajno veće nego u skupini koja je primala slijepu probu (P<0.01); the="" release="" of="" no="" in="" the="" 5="" doses="" of="" low="" molecular="" sugar="" and="" polysaccharides="" in="" the="" cistanche="" cistanche="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" control="" group="" (p=""><0.01) ),="" and="" was="" dose-dependent;="" the="" total="" glycosides="" of="">Cistanchenije imalo značajnijeg učinka. Gore navedeni rezultati pokazuju da i polisaharidi i niskomolekularni šećeri Cistanchea mogu pospješiti otpuštanje NO iz RAW264. 7 stanica. Među njima je posebno značajan učinak niskomolekularnih šećera Cistanche, što je prikazano na slici 2.

3. 3. Učinak niskomolekularnog šećera Cistanche cistanche na ekspresiju TNF- i IL-6 proteina u RAW264. 7 stanica

TNF- je važan upalni medijator koji se pojavljuje u procesu aktivacije RAW264. 7 stanica, koje mogu pospješiti sintezu i otpuštanje drugih citokina (kao što je IL-6). Rezultati su pokazali da je ekspresija TNF-a i IL-6 značajno povećana nakon što je stimuliran niskomolekularni šećer Cistanche cistanche, što sugerira da niskomolekularni šećer Cistanche može pospješiti ekspresiju TNF-a - i IL-6 u RAW264. 7 stanica, čime se aktivira stanična imunost Fagocitoza, vidi sliku 3.

3. 4. Regulacijski učinak niskomolekularnog šećera Cistanche cistanche na signalni put IKK /IκB /NF-κB

Kako bismo istražili potencijalni mehanizam niskomolekularnih šećera Cistanche cistanche u aktiviranju RAW264. 7 stanica, autori su istraživali njegove regulatorne učinke na klasični signalni put IKK /IκB /NF-κB. Niskomolekularni šećer Cistanche cistanche može značajno povećati fosforilaciju NF-κB i fosforilaciju njegovih uzvodnih ključnih signalnih proteina IKK i IκB, te smanjiti ekspresiju ukupnog proteina IκB, što ukazuje da ima aktivirajući učinak na IKK / IκB /NF-κB signalni put. Lijek pozitivne kontrole LPS također ima sličan regulatorni učinak. Ukratko, niskomolekularni šećeri Cistanche mogu aktivirati signalni put IKK /IκB /NF-κB, uzrokujući na taj način sintezu i oslobađanje citokina kao što su TNF- i IL-6, i konačno uzrokujući imunološki aktivacija RAW264. 7 ćelija, pogledajte sliku 4.

3. 5. Probir aktivnih sastojaka s učinkom aktivacije makrofaga u niskomolekularnim šećerima Cistanche

Naš laboratorij analizirao je niskomolekularne šećere sadržane uCistancheu ranoj fazi i otkrili da uglavnom sadrži manitol (16,53 posto), saharozu (8,34 posto), fruktozu (25,38 posto) i glukozu (7,75 posto), te druge sastojke. Stoga je autor upotrijebio neutralnu crvenu metodu za provjeru učinka aktivacije gore navedenih komponenti na makrofage. Manitol može značajno povećati fagocitnu aktivnost makrofaga na način ovisan o dozi, dok učinci ostalih komponenti nisu značajni. Ovo sugerira da bi manitol mogao biti jedna od ključnih aktivnih komponenti u niskomolekularnim šećerima Cistanche cistanche za aktiviranje makrofaga, kao što je prikazano na slici 5.

4. Rasprava

Cistanche cistanche, parazitska biljka iz obitelji Lydanaceae, navodno ima imunomodulatorne učinke, pa bi trebala sadržavati imunomodulatorne tvari. U ovom eksperimentu, autor je pregledao fagocitnu aktivnost mišjih peritonealnih makrofaga na različitim pročišćenim dijelovimaCistanchei otkrio da niskomolekularni šećeri i polisaharidi Cistanche imaju učinak aktivacije makrofaga, ali ukupni glikozidi Cistanche nisu očiti. U isto vrijeme, autor je otkrio da niskomolekularni šećeri mogu aktivirati makrofage u nižim koncentracijama, pa su autori odabraliCistanchešećeri niske molekularne težine kao fokus kasnijih istraživanja.

Ispitivanjem učinka šećera cistanhe niske molekularne težine na ekspresiju citokina TNF- i IL-6, autori su otkrili da šećer cistanhe niske molekularne težine značajno povećava ekspresiju TNF-a i IL-6, što dodatno dokazao da niskomolekularni cistanche šećer ima učinak na miševe. Peritonealni makrofagi imaju aktivirajući učinak. Stoga je autor dodatno istražio njegov potencijalni mehanizam djelovanja. Istražite

Pokazalo se da bakterijski lipopolisaharid (LPS) može inducirati aktivaciju mišjih makrofaga i mišjih glijalnih stanica putem signalnih putova kao što su JAK2/STAT3, NF-κB, p38/ERK i MAPK [4-8]. Put NF-κB prepoznat je kao klasični put, pa su signalni proteini na tom putu testirani u ovom eksperimentu. Rezultati su pokazali da niskomolekularni šećeri Cistanche mogu značajno povećati fosforilaciju NF-κB i fosforilaciju ključnih uzvodnih signalnih proteina IKK i IκB, što sugerira da niskomolekularni šećeriCistanchemože aktivirati mišje peritonealne divove putem IKK /IκB /NF-κB signalnog puta. Fagne stanice oslobađaju upalne citokine i zatim igraju ulogu u aktiviranju stanične imunosti.

U ranoj fazi laboratorija, kemijski sastav ekstrakta šećera niske molekularne težineCistanche deserticolaje sustavno analiziran. Utvrđeno je da niskomolekularni šećeri uglavnom sadrže monomere kao što su manitol, saharoza, fruktoza i glukoza. Daljnja istraživanja su pokazala da manitol može značajno poboljšati fagocitnu aktivnost makrofaga. Stoga se nagađa da bi manitol mogao biti ključna komponenta niskomolekularnih šećera koji aktiviraju staničnu imunološku funkciju.

Ukratko, ova studija koristila je makrofage u sustavu kulture Vitro i otkrila da su šećeri niske molekularne težineCistancheimaju značajan aktivirajući učinak na makrofage i mogu aktivirati mišje peritonealne makrofage putem NF-κB signalnog puta, a zatim igraju ulogu. Manitol u niskomolekularnim šećerima može imati važnu ulogu u aktiviranju fagocitne aktivnosti makrofaga.

Reference

[1] Tu Pengfei, Guo Yuhai. Tehnike uzgoja pustinjske cistanče i njenog domaćina tamariksa [M]. Peking: Science Press, 2015:31.

[2] Gao Xiaoxia, Chen Jun, Peng Yanli. Pregled istraživanja farmakoloških učinakaCistanche deserticolapolisaharid [J]. Hrana i lijekovi, 2015., 17(2):136.

[3] Wang Xiangyan, Qi Yun, Cai Ruslan, et al. Makrofagna aktivacija Cistanche polisaharida [J]. Kineski farmakološki bilten, 2009, 25(6):787.

[4] Liu Zhongyuan, Li Yanping. Biološka aktivnost i mehanizam bakterijskog lipopolisaharida [J]. Medical Science Review, 2010, 16(2):166.

[5] Fu Zhihui, Xu Ling, Huang Jiao, et al. LPS kroz p38 /MAPK put i aktivaciju NF-κB inducira ekspresiju HIF-1 u RAW264. 7 stanica [J]. Chongqing Medical University Journal, 2016., 41(10): 1033.

[6] Hao Yutong, Chen Chunhai, Yang Xuesen, et al. JAK2/STAT3 signalni put uključen je u lipo poli šećerom induciranu aktivaciju mikroglije［J］. Vjesnik Trećeg vojnomedicinskog učilišta, 2009, 31(12):1119.

[7] Song Xiaomin, Liao Lixi, Dong Xin, et al. Mulbascum glikozidi inhibiraju upalu mikroglije BV-2 izazvanu lipopolisaharidima i njezin mehanizam [J]. Kineski časopis tradicionalne kineske medicine, 2016., 41(13): 2506.