Utjecaj gestacijskog niskog unosa proteina na ekspresiju mikroRNA bubrega embrija i u nefronskim progenitorskim stanicama muškog fetusa
Mar 08, 2022
Uvod
Nedostatak hranjivih tvari može rezultirati signaliziranjem promjena u ključnim putovima tijekom različitih faza fetalnog razvoja, što može uzrokovati ireverzibilne poremećaje organa i sustava u odrasloj dobi [1]. Fetalno programiranje odnosi se na bilo koju uvredu tijekom razvoja, koja uzrokuje dugoročne učinke na strukturu ili funkciju organizma [2]. Poremećaji u fetalnom programiranju rezultiraju niskom porođajnom težinom, manjim brojem nefrona i povećanim rizikom od kardiovaskularnih ibubrežniporemećaji u odrasloj dobi [3–6]. Studije drugih autora i nas pokazale su manju porođajnu težinu, 28 posto manje nefrona, smanjenjebubrežniizlučivanje soli, kroničnozatajenje bubrega, i arterijska hipertenzija u gestacijskom niskom unosu proteina (LP) u usporedbi sa standardnim (NP) unosom proteina kod potomaka u odrasloj dobi [3-7]. Nefrogeneza uključuje strogu kontrolu ekspresije gena, sinteze proteina i remodeliranja tkiva. Studije su pokazale da je broj nefrona određen interakcijama između progenitorskih stanica pupoljka uretera (UB) i metanefros mezenhima (MM) [8-10]. Signali iz MM induciraju UB-stimulirani rast i grananje sustava tubula. Zauzvrat, proliferacija i diferencijacija MM, koja čini mezenhimsku kapu (CM), posredovana je UB krajevima [11].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI
Postojao je ozbiljan interes za ulogu epigenetskih promjena, u vezi s dugoročnim učincima prenatalnog stresa, na razvoj fetusa [12]. MikroRNA (miRNA) su genomom kodirane male nekodirajuće RNA od približno 22 nukleotida u duljinu i igraju ključnu ulogu u posttranskripcijskoj regulaciji ekspresije ciljnog gena [13-16]. miRNA kontroliraju ekspresiju gena post-transkripcijski reguliranjem translacije mRNA ili stabilnosti u citoplazmi [17, 18]. Funkcionalne studije pokazuju da su miRNA uključene u kritične biološke procese tijekom razvoja i u fiziologiju stanice [13, 16]. Promjene u njihovoj ekspresiji uočene su u nekoliko patologija [16, 19]. Stoga je karakterizacija miRNA pomogla u razumijevanju regulacije gena i stanične proliferacije, diferencijacije i apoptoze te objasnila patofiziološke poremećaje, uključujućibubregporemećaji [20-22]. Studije su izvijestile da tijekombubregmiRNA u ontogeniji nezamjenjive su za razvoj nefrona [23-26]. Štoviše, nedovoljna ekspresija nekih miR NA u stanicama progenitorima MM smanjuje proliferaciju stanica, što rezultira ranom diferencijacijom, a posljedično, smanjenim brojem nefrona [27, 28]. Ovaj fenomen karakterizira povećana apoptoza i visoka ekspresija Bim u progenitorskim stanicama [27]. Stoga miRNA moduliraju ravnotežu između apoptoze i proliferacije ovih metanefričkih primarnih stanica [29].
Pretpostavili smo da su nepoznate epigenetske promjene i profiliranje ekspresije miRNA povezani sbubregrazvojni poremećaji kod majčinih potomaka s ograničenim unosom proteina. Stoga nam je cilj bio procijeniti obrasce miRNA i predviđenu ekspresiju gena u fetusububregu 17. danu gestacijskih (17-DG) proteinski ograničenih muških potomaka kako bi se identificirali molekularni putovi i poremećaji uključeni ububrežniproliferacija i diferencijacija stanica tijekombubregrazvoj.
Ključne riječi:zatajenje bubrega; bubrežni tubularni; bubrežni poremećaji; razvoj bubrega; bubreg
Materijal i metodologija
Životinje i dijetaEksperimenti su provedeni kao što je prethodno detaljno opisano [5, 6] na ženkama i mužjacima štakora iste dobi Wistar HanUnib štakora (250–300 g) koji potječu iz rasplodnog stada koje je dostavio CEMIB/UNICAMP , Campinas, SP, Brazil. Okoliš i smještaj predstavljali su prave uvjete za upravljanje njihovim zdravljem i dobrobiti tijekom eksperimentalnog postupka. Neposredno nakon odbijanja u dobi od tri tjedna, životinje su držane na kontroliranoj temperaturi (25˚C) i uvjetima osvjetljenja (07:00–19:00h) uz slobodan pristup vodi iz slavine i standardnoj laboratorijskoj hrani za glodavce (Purina Nuvital , Curitiba, PR, Brazil: sadržaj Na plus: 135 ± 3 μEq/g; sadržaj K plus: 293 ± 5 μEq/g), 12 tjedana prije uzgoja. Institucionalni etički odbor za korištenje životinja na Državnom sveučilištu São Paulo (#446-CEUA/UNESP) odobrio je eksperimentalni protokol, a opće smjernice koje je uspostavio Brazilian College of Animal Experimentation praćene su tijekom cijelog istraživanja. Određen je 1. dan trudnoće kao dan u kojem je vaginalni bris pokazao spermu. Zatim su majke držane ad libitum tijekom cijele trudnoće na izokaloričnoj laboratorijskoj hrani za glodavce sa standardnim sadržajem proteina [NP, n=36] (17 posto proteina) ili niskim sadržajem proteina [LP, n=51 ] (6 posto proteina). NP i LP potrošnja hrane majke određivana je dnevno (naknadno normalizirana na tjelesnu težinu), a tjelesna težina ženki bilježena je tjedno u obje skupine. 17 dana gestacije (17-DG), majke su anestezirane ketaminom (75 mg/kg) i ksilazinom (10 mg/kg), a maternica je izložena. Fetusi su uklonjeni i odmah eutanazirani dekapitacijom. Fetusi su izvagani, a rep i udovi su sakupljeni radi određivanja spola. Metanefros je prikupljen za sekvenciranje sljedeće generacije (NGS), RT-qPCR i imunohistokemijske analize.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
Određivanje spolaOvo istraživanje provedeno je samo na muškim 17-DG potomcima, a spol je određen Sry konvencionalnom analizom sekvence PCR (lančana reakcija polimeraze). DNA je ekstrahirana enzimatskom lizom s proteinazom K i fenol-kloroformom. Za reakciju je korištena Master Mix Colorless—Promega, uz uvjete ciklusa proizvođača. Integrated DNA Technologies (IDT) sintetizirao je početni niz sljedećih nizova: Naprijed: 5'-TACAGCCTGAGGACATATTA-3'Natrag: 5'-GCACTTTAACCCTTCGATTAG-3'.
Totalna ekstrakcija RNKRNA je ekstrahirana iz NP (n=4) i LP (n=4) cijelebubregakorištenjem Trizol reagensa (Invitrogen), prema uputama proizvođača. Ukupna količina RNA određena je apsorbancijom na 260 nm pomoću nanoVue spektrofotometra (GE Healthcare, SAD). Integritet RNA osiguran je dobivanjem broja integriteta RNA—RIN > 8 pomoću bioanalizatora Agilent 2100 (Agilent Technologies, Njemačka) [30].
miRNA-Seq i analiza podatakaSekvenciranje je provedeno na platformi MiSeq (Illumina). Protokol je slijedio upute proizvođača dostupne uUkratko, sekvenciranje uključuje konstrukciju biblioteke, a to je korišteno 1 ug ukupne RNA. U ovom koraku spajaju se adapteri, 3 'i 5'. Nakon podvezivanja adaptera, izvedena je reakcija obrnute transkripcije da bi se stvorila cDNA. Zatim je umnožen standardnom PCR reakcijom, koja koristi početnice koje sadrže indeks sekvence za identifikaciju uzorka—ova biblioteka cDNA, podvrgnuta elektroforezi u agaroznom gelu za izolaciju miRNA. Nakon kvantifikacije, koncentracija biblioteke je normalizirana na 2 nM upotrebom 10 nM Tris-HCl, pH 8,5, a sekvenciranje transkriptoma je izvedeno pomoću MiSeq Reagent Kit v2 (50 ciklusa).
Analiza podataka provedena je u suradnji s Tao Chen, Ph.D. iz Odjela za genetsku i molekularnu toksikologiju Nacionalnog centra za toksikološka istraživanja, Jefferson, AR, SAD. Podaci iz Next Generation Sequencing (NGS) miRNA generirani su u FASTA formatu i uvezeni u BaseSpace.com (Illumina, SAD). Kvaliteta podataka procijenjena je korištenjem softvera CASAVA za pozivanje baze koji je razvio proizvođač (Illumina). Analize su napravljene pomoću BaseSpace miRNA Analysis (sa Sveučilišta u Torinu, Kanada) i mapiranja sekvenci različitih miRNA pomoću Small RNA (Illumina, SAD) za genom štakora. Studija različito izražene miRNA analizirana je pomoću softvera Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity, SAD).
validacija ekspresije miRNAČetiri muška potomka iz različitih legla korištena su u svakoj skupini za miRNA (miR{{0}}p, -144-3p, -298-5p, let-7a{{ 4}}p, -181a-5p, -181c-3p, i -199a-5p) analiza izraza. Ukratko, 450 ng RNA je obrnuto transkribirano, bez prethodnog pojačanja, korištenjem TaqMan1 Micro RNA Reverse Transcription Kita, u skladu sa smjernicama proizvođača. Komplementarna DNA (cDNA) umnožena je pomoću TaqMan MicroRNA Assays (Life Technologies, SAD) s TaqMan1 Universal PCR Master Mix, No AmpErase1 UNG (2x) na StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM), prema uputama proizvođača. Analiza podataka provedena je korištenjem relativne ekspresije gena procijenjene metodom komparativne kvantifikacije (Pfaffl, 2001.). Na temelju analize stabilnosti, U6 snRNA i U87 scaRNA korišteni su kao referentni gen. Sve relativne kvantifikacije procijenjene su pomoću softvera DataAssist, v 3.0, koristeći ΔΔCT metodu. Podaci o miRNA generirani su u skladu s MIQE smjernicama [31].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
RT-qPCR predviđenih ciljnih genaZa sintezu cDNA korišten je komplet za reverznu transkripciju cDNA visokog kapaciteta (Life Technologies, SAD). RT-qPCR reakcije za Bax, Bim, Caspase-3, Collagen 1, GDNF, PCNA, TGF -1, Bcl-2, Bcl-6, c-Myc, c -ret, ciklin A, Map2k2, PRDM1, Six-2, Ki-67, MTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2, NOTCH1 i IGF1 gen izveo je SYBR Green Master Mix (Life Technologies, SAD) ) osigurao IDT1 Integrated DNA Technologies (Tablica 1). Reakcije su provedene u ukupnom volumenu od 20 μL korištenjem 2 μL cDNA (razrijeđene 1:30), 10 μL SYBER Green Master Mix (Life Technologies, SAD) i 4 μL svakog specifičnog primera (5 nM). Umnožavanje i detekcija provedeni su korištenjem StepOnePlusTM Real-Time PCR System (Applied BiosystemsTM). Vrijednosti Ct pretvorene su u relativne vrijednosti ekspresije korištenjem metode ΔΔCt s podacima o metanefrosima potomaka normaliziranim s GAPDH kao referentnim genom [32].
Imunohistokemija,Fetus (n {{0}} po skupini) je uklonjen i odmah fiksiran u 4 posto paraformaldehidu (0,1 M fosfat, pH 7,4). Materijali su dehidrirani, dijafanizirani i uključeni u paraplast, a blokovi su izrezani na dijelove debljine 5- μm. Histološki rezovi su deparafinizirani i obrađeni za imunofluorescenciju i imunoperoksidazu. Sekcije su bile
inkubirana s otopinom za blokiranje (8 posto fetalnog goveđeg seruma, 2,5 posto goveđeg albumina i 2 posto obranog mlijeka u prahu u PBS-u). Nakon toga, postavite s primarnim antitijelom (anti-Six-2) razrijeđenim u PBS-u koji sadrži 1 posto obranog mlijeka preko noći u hladnjaku. Nakon ispiranja s PBS-om, rezovi su inkubirani sa specifičnim sekundarnim antitijelom, konjugiranim s Alexa 488 fluoroforom, razrijeđenim u istom puferu, koji sadrži 1 posto mlijeka, 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon uzastopnih ispiranja s PBS-om, stakalca su montirana s pokrovnim stakalcima upotrebom Vectashield fluorescentnog sklopnog medija (Vector Laboratories, Inc. Burlingame). Fluorescencija u uzorku detektirana je laserskom konfokalnom mikroskopijom. Slike su dobivene pomoću sustava Focus Imagecorder Plus. Za proteine c-Myc, Ki-67, Bcl-2, TGF -1, -katenin, ZEB1, ZEB2, cijepane kaspaze 3, ciklin A i WT1, provedena je imunohistokemija. Stakalca su hidratizirana i nakon ispiranja u PBS pH 7,2 tijekom 5 minuta, antigenski oporavak je napravljen s citratnim puferom pH 6.0 tijekom 25 minuta u ekspres loncu. Stakalca su isprana u PBS-u. Potom je provedena blokada endogene peroksidaze s vodikovim peroksidom i metanolom tijekom 10 minuta u mraku. Sekcije su ponovno isprane u PBS-u. Zatim je praćeno blokiranje nespecifičnog vezanja, a stakalca su inkubirana s otopinom za blokiranje (5 posto obranog mlijeka u prahu, u PBS) 1 sat. Sekcije su inkubirane s primarnim protutijelom (Tablica 2), razrijeđenim u 1 posto BSA preko noći u hladnjaku. Nakon ispiranja s PBS-om, rezovi su bili izloženi specifičnom sekundarnom protutijelu 2 sata na sobnoj temperaturi. Stakalca su isprana s PBS. Reznice su otkrivene s DAB (3,3'- diaminobenzidin tetrahidroklorid, Sigma-Aldrich CO1, SAD). Nakon uzastopnog ispiranja u tekućoj vodi, stakalca su obojena hematoksilinom, dehidrirana i pričvršćena pokrovnim stakalcem pomoću Entellana1. Slike su dobivene fotomikroskopom (Olympus BX51) ili konfokalnim Zeiss LSM 780-NLO na mikroskopu Axio Observer Z.1 (Carl Zeiss AG, Njemačka) Nacionalnog instituta za znanost i tehnologiju za fotoniku primijenjenu na stanicu biologije (INFABIC) na Državnom sveučilištu u Campinasu.
Morfološka kvantifikacijaParafin 5 μmbubregpresjeci su analizirani pomoću softvera CellSens Dimension iz fotomikroskopa (Olympus BX51). Thebubregpristupilo se rezovima kako bi se odredilo nefrogeno područje, CM i UB protein i broj stanica, hematoksilin-eozin obojen u 17-DG LP fetusu (n=5) u usporedbi s NP potomcima odgovarajuće dobi (n {{4 }}) od različitih majki. Kvantificirali smo sve CM i UB svakog analiziranog metanefrosa (4NP i 4LP od različitih majki), a statistička analiza je provedena t-testom, a vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± SD. P�0.05 se smatra značajnim. Za statističku analizu i konstrukciju slika korišten je GraphPad Prism v01 Software, Inc., USA.
Statistička analizaKorišten je t-test, a vrijednosti su izražene kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD). P�0.05 se smatra značajnim. Za statističku analizu i konstrukciju slika korišten je softver GraphPad Prisma v. 01 (GraphPad Software, Inc., SAD).
Rezultati
Ekspresija miRNA miRNA-SeqDa bismo razumjeli promjene mikroRNK povezane s majčinim niskim sadržajem proteinabubrežniprogramiranja, izvršili smo ekspresiju globalne analize profiliranja miRNA. Identificirane su 44 deregulirane miRNA (p � 0.05), od kojih je 19, odnosno 25 miRNA, bilo regulirano gore ili dolje (tablica 3). Vrhunski izražene miRNA i njihove funkcije, putovi i mreže identificirani su korištenjem softvera Ingenuity (Tablica 4).
Validacija ekspresije miRNAKod životinja LP skupine, Let-7a-5p, miR-181a-5p, miR-181c-3p su regulirani prema gore, dok su miR-127-3p, miR-144-3p i miR-199a-5p bili smanjeni u odnosu na NP životinje. Rezultati ne pokazuju nikakvu razliku u ekspresiji miR-298, uspoređujući obje skupine (slika 1). Tablica 5 otkriva vrijednosti dobivene sekvenciranjem miRNA s RT-qPCR validacijskim podacima. Iako je opažena značajna razlika u ekspresiji miRNA u LP u odnosu na potomke NP, promjena nabora (FC) validiranih miRNA bila je slična objema tehnikama.
mete miRNA-gena
Ekspresijski geni predviđenih ciljeva različitih miRNA kao što su Six-2, Bcl-2, PRDM1, ciklin A, PCNA, GDNF, kolagen 1, kaspaza 3 i Bim u LP nisu se značajno razlikovali od NP fetus. Međutim, ekspresija gena Bax, TGF -1 Bcl-6, c-ret, Map2k2, Ki-67, mTOR, -catenin, ZEB1, ZEB2 i IGF1 bila je regulirana prema gore u {{15 }}Grupa DG LP u usporedbi s kontrolama iste dobi. Nasuprot tome, c-Myc i NOTHC1 bili su smanjeni u majčinih potomaka s ograničenim proteinima (Slika 2).
Tjelesna masa fetusa i morfometrija metanefrosaTjelesna masa 17-DG LP nije se razlikovala od NP potomaka iste dobi. Međutim, mezenhim metanefrosa LP-a pokazao je 7,6 posto smanjenu površinu i 29 posto smanjenje debljine korteksa od NP skupine (Slika 3).ImunohistokemijaU ovoj studiji, LP fetus pokazao je značajno smanjenje (oko 69 posto) fluorescencije šest-2 kapica u odnosu na NP potomke (Slika 4).
Analiza Six-2 imunoperoksidaze pokazala je smanjeni broj stanica (14 posto) u LP CM od povezanih s 28 posto smanjenih Six-2 plus stanica u odnosu na površinu kape u usporedbi s NP potomcima (Slika 4). Ova studija također je pokazala značajan postotak smanjenja c-Myc CM i UB imunološki obojenih stanica (manje od 14 posto) u LP u odnosu na NP potomstvo (Slika 4). Dodatno, postotak Ki-67 obilježenog područja u CM bio je 48 posto manji u LP u usporedbi s NP fetusom, dok se Bcl-2 i imunoreaktivnost cijepane kaspaze-3 nisu razlikovale od obje skupine (slike 5 i 6). Ova studija također je pokazala značajan postotak smanjenja c-Myc CM i UB imunološki obojenih stanica (manje od 14 posto) u LP u odnosu na NP potomstvo (Slika 4). Dodatno, postotak Ki-67 obilježenog područja u CM bio je 48 posto manji u LP u usporedbi s NP fetusom, dok se Bcl-2 i imunoreaktivnost cijepane kaspaze-3 nisu razlikovale od obje skupine (slike 5 i 6). S druge strane, u LP, područja obilježena CM i UB-kateninom bila su povećana za 154 odnosno 85 posto, u usporedbi s onim dostupnim u NP potomcima (Slika 7). U isto vrijeme, raspodjela imunoreaktivnosti mTOR također je zauzimala značajno veće područje u LP CM (139 posto) i UB (104 posto) nego u NP fetusu (Slika 7). U LP potomcima, TGF -1 u UBS stanicama se povećao (oko 30 posto), dok se u CM imunološki obojene stanice nisu razlikovale u odnosu na NP skupinu (Slika 8). ZEB1 metanefrosom obojen, smješten u stanicama jezgre CM, povećao je 30 posto u LP u usporedbi s NP fetusom (Slika 8). Istovremeno, imunofluorescencija ZEB2, iako prisutna u cijelim strukturama metanefrosa, bila je slična u obje eksperimentalne skupine (Slika 8). Trenutna studija, uzimajući u obzir miRNA i mRNA ekspresiju i proteine
Rasprava
Povećalo se znanje o staničnim i molekularnim mehanizmima nefrogeneze [33-37]. Međutim, uključeni su mnogi regulatorni čimbenici i signalni putovibubrežniontogeneza ostaju nejasne [38]. miRNA igraju ključnu ulogu u regulaciji ekspresije gena tijekombubrežnirazvoj [25, 39–41]. Koliko znamo, analize ekspresije miRNA i mRNA u muškim mezenhimskim stanicama DG 17-DG koje unose LP kod majke nisu provedene. Predlažemo novi molekularni mehanizam uključen u inhibiciju rane nefrogeneze, što rezultira smanjenim brojem nefrona. Koristili smo NGS za procjenu ekspresije miRNA i otkrili da je 19 miRNA regulirano naviše, a 25 naniže u 17-DG LP u usporedbi s NP metanefrosima. Među prvih 10 dereguliranih miRNA odabrali smo 7 miRNA s biološkim ciljevima uključenim u proliferaciju, diferencijaciju i staničnu apoptozu. Analiza podataka miRNA-Seq i TaqMan otkrila je dosljedne i specifične promjene u ekspresiji miRNA u LP životinja u odnosu na kontrolne NP životinje iste dobi.
Obitelj miR-181 sastoji se od četiri visoko očuvana člana, naime miR-181a, miR-181b, miR-181c i miR-181d [ 42]. U neoplastičnim stanicama miR-181a djeluje kao supresor tumora, inhibirajući staničnu proliferaciju i migraciju te inducirajući staničnu apoptozu [43]. Ova je studija otkrila povećanu ekspresiju miR-181a-5p u 17-DG LP u odnosu na potomstvo NP iste dobi. Iako je ekspresija mRNA kaspaze bila nepromijenjena, dvostruki porast omjera mRNA Bax/Bcl-2 u LP u usporedbi s potomcima NP ukazuje na povećanu apoptozu u CM, što ukazuje da je apoptoza regulirana posttranskripcijski. Studije su pokazale da obitelj BCL potiče oslobađanje citokroma iz mitohondrija, a zatim inhibira aktivaciju Casp3, čime inhibira staničnu apoptozu [44]. Li et al. upotrijebio model akutne ozljede pluća kako bi otkrio da je prekomjerno izražen miR-181a povezan sa smanjenom razinom proteina Bcl-2; obrnuto, inhibicija miR-181a povećala je razine Bcl-2 [45]. Ova je studija potvrdila rezultate Lv i sur., koji su pokazali da miR-181c negativno regulira ekspresiju Six-2 ekspresije i staničnu proliferaciju, paralelno s gubitkom fenotipa mezenhimalnih stanica tijekombubregrazvoj u LP 17-DG potomcima [25].
Xiang i sur. pokazalo je da povećana ekspresija miR-144 potiskujebubrežniproliferacija karcinoma, što rezultira kraćom G2/M fazom. Štoviše, Xiang et al. otkrili su da prekomjerna ekspresija miR-144 inhibira mTOR gen i ekspresiju proteina [46]. Nijland i sur. pokazalo je da je povećanje mTOR signalizacije ključno za određivanje broja nefrona u embrijima čije su majke bile podvrgnute restrikciji hranjivih tvari [47]. Cilj rapamicinskog kompleksa 1 (mTORC1) kod sisavaca je bitan za razvoj embrija; međutim, ostaje nepoznato kako ovaj kompleks regulira ravnotežu između rasta i autofagije u fiziološkim uvjetima i okolišnom stresu [48]. Stoga, mTOR signalizacija može biti uključena u stanične odgovore kod životinja koje su bile izložene unosu LP tijekom gestacije; u percepciji, indukciji i prekidu autofagije; i kao odgovor na intracelularnu dostupnost hranjivih tvari [46]. Hipotetski, tijekom ozbiljne restrikcije proteina, smanjena ekspresija miR-144-3p može biti povezana s povećanom ekspresijom mTOR, približno 139 posto odnosno 104 posto u CM stanicama i UB, kako bi se nadoknadio gubitak nefrona u {{ 11}}DG LP potomak Chen et al. definirao je miR-127 kao novi regulator staničnog starenja putem Bcl-6 [49]. Pan i sur. izvijestio je da nedovoljna ekspresija miR-127 korelira s povećanom staničnom proliferacijom u stanicama jetre [50]. Ova je studija pokazala smanjenje stanične proliferacije i značajno smanjenje stanica pozitivno obilježenih za Ki-67 u CM životinja s ograničenim unosom proteina. Štoviše, primijećeno je smanjenje nefrogenog područja i proliferacije u LP potomstvu, što je bilo u skladu s rezultatima Menendez-Castro i sur. u 8,4 posto potomstva s ograničenim unosom proteina [51, 52]. Prema tome, povećana ekspresija Ki-67 i Bcl-6 mRNA, popraćena smanjenom ekspresijom miR-127-3p u 17-DG LP capu, može biti povezana s proturegulacijskim mehanizmima za održavanje proliferacija.
Sun i sur. pokazalo je da prekomjerna ekspresija miR-199a-5p smanjuje proliferaciju cističnih stanica i inducira apoptozu, uz kontrolu staničnog ciklusa [53]. U ovoj studiji, ekspresija miR-199a-5p smanjena je u 17-DG LP praćena povećanom transkripcijom Ki-67, markera stanične proliferacije, i Map2k2 je povezan sa smanjenom Ki-67 reaktivnošću u LP 17-DG metanephros. Dakle, gestacijska pothranjenost potiče diferencijaciju kroz posttranskripcijski mehanizam. Naime, naši rezultati otkrivaju represivnu ulogu homeoboxa 1 (ZEB1), induktora EMT-a, koji održava pluripotentnost matičnih stanica tijekom diferencijacije embrionalnih matičnih stanica. Poznato je da -katenin aktivira nuklearnu ZEB1 transkripciju što rezultira ekspresijom ZEB1 [34]. TGF signalni put, jedan od najbolje proučenih putova, može inducirati EMT tijekom embrionalnog razvoja. Za embrionalni razvoj potrebno je nekoliko liganda sličnih TGF-u. Međutim, ne ovise svi učinci posredovani TGF-om na EMT o ZEB1/2, nokautirane stanice mogu inducirati ekspresiju mezenhimalnih gena fibronektina i N-kadherina. Međutim, E-kadherin više nije smanjen, a također se stvaraju aktinska vlakna [54]. Karner i sur. izvijestio da je tijekombubrežnirazvoj, Wnt9b/-katenin
signalni put, izražen u UB i CM, potreban je i za obnavljanje i diferencijaciju nefronskih progenitorskih stanica, budući da je bitan za stvaranje nefrona tijekom embriogeneze [55]. Evolucijski očuvani put Wnt9b/-catenin igra ključnu ulogu u razvoju organa, tkiva i popravku ozljeda u višestaničnim organizmima. Studija je pokazala da je c-Myc transkripcijski cilj -katenina, regulirajući proliferaciju i diferencijacijububrežnitubularni epitel [56]. Ekspresija -katenina na razini gena i proteina povećala se tijekom proučavanih razdobljabubrežnirazvoj u 17-DG LP fetusu. Pan i sur. izvijestio je da Myc surađuje s -kateninom u promicanju obnove nefronskih progenitorskih stanica [10]. Ovdje u usporedbi s NP potomcima iste dobi, LP je pokazao nižu ekspresiju c-Myc. Stoga ove životinje mogu imati manju rezervu obnovljivih stanica potrebnih za proliferaciju i preživljavanje i mogu odražavati manji broj nefrona u LP modelu. Štoviše,
Wnt/-catenin i Notch signalni putovi mogu koordinirati regulaciju ekspresije Six-2 i uključeni su u regulaciju ekspresije Six-2 u nefronskim progenitorskim stanicama. Studije su pokazale da bi niske razine -katenina mogle biti potrebne za održavanje ekspresije Six-2 i CM progenitorskih stanica u nediferenciranom stanju; štoviše, povišene razine -katenina određuju sudbinu progenitorskih stanica nefrona [57, 58]. Prema tome, pretpostavljamo da je smanjena cMyc i Notch signalizacija, popraćena povećanom ekspresijom -katenina, smanjila ekspresiju Six-2 za 28 posto u 17-DG LP potomcima i korelirala s ranom diferencijacijom CM stanica i smanjenim matičnim stanicama i broj nefrona u odrasloj dobi. Štoviše, naši podaci mogu potvrditi da, u MM stanicama potomaka LP, povećana ekspresija Let-7a-5p i -katenina i smanjeni Notch signal mogu modulirati c-Myc, Six-2, i ekspresiju Ki-67, što dovodi do smanjenja samoobnavljanja progenitorskih stanica. Deplecija preostalih CM progenitorskih stanica dovodi do smanjenja broja nefrona i razvoja arterijske hipertenzije ibubrežniporemećaja u odrasloj dobi (Slika 10). U skladu s onima Boivina i sur., naši rezultati pokazuju da povećani CM-katenin remeti rast i nefrogenezu UB [59]. Studije su pokazale da neurotrofni čimbenik koji potiče iz glije (GDNF), ključni regulator rasta UB, signalizira preko c-Ret tirozin kinaznog receptora i Gfra1 koreceptora [60, 61]. U 17-DG LP potomstvu, značajan
povećanje mRNA koja kodira c-Ret receptor teoretski bi dovelo do povećanja rasta UB. Međutim, u ovoj studiji ekspresija GDNF-a bila je nepromijenjena, što sugerira da je unatoč povećanju cRet mRNA, UB grananje smanjeno. Prethodno smo primijetili smanjenje od 28,3 posto u ograncima pupoljaka uretera nakon 14,5 dana gestacijske restrikcije proteina [4], što bi moglo biti povezano sa smanjenjem od 28 posto u Six-2 označavanju MM stanica, unatoč tome što nije bilo promjena u GDNF-u. transkripcija. -katenin vjerojatno stupa u interakciju s c-ret receptorom i prenosi se u jezgru UB stanice, potičući ekspresiju TGF -1 u epitelnim stanicama, inhibirajući UB grananje i uzrokujući preuranjenu diferencijaciju CM progenitorskih stanica, kao što se vidi u {{11} }DG LP potomci [62– 64]. Stoga, GDNF možda nije bitan u posredovanju mezenhimalnih signala do pupoljka uretera; međutim, mehanizam tek treba razjasniti. Uistinu, pokazali smo da je MM iz 17-DG LP potomaka pokazao specifično povećanje ekspresije Let-7 miRNA, što je rezultiralo značajno oslabljenombubregrazvoj, čime se potvrđuje modulatorna uloga ovih gena u razvojnom vremenu nefrogeneze [65].
U početnim studijama faktora rasta sličnog inzulinu (IGF), dominantne uloge IGF-1 i -2 u rastu fetusa razjašnjene su brojnim, ali uglavnom neizravnim, dokazima. Utvrđeno je da IGF-ovi djeluju kao faktori proliferacije i diferencijacije u kultiviranim fetalnim stanicama i prijeimplantacijskim embrijima. Štoviše, utvrđeno je da IGF-ove izlučuju kultivirane fetalne stanice i eksplantati in vitro [66]. Čimbenici rasta, uključujući IGF, mogu uzrokovati djelomičnu ili potpunu epitelno-mezenhimsku tranziciju. Aktivacija putova IGF-a rezultira pojačanom regulacijom EMT-a induciranjem ekspresije ZEB1 [67]. Iako je uključeno nekoliko čimbenika rasta kandidatabubregnije poznato jesu li uključeni u nefrogenezu. U različito vrijeme mogu biti potrebni različiti čimbenici rasta. Neki faktori rasta mogu biti suvišni u ovom kontekstu. Tijekom embrionalnog razvoja potrebni su sekvencijalni krugovi EMT i MET da bi se razlikovali specijalizirani tipovi stanica i stvorila trodimenzionalna struktura. U ovoj studiji utvrđeno je da mezenhimalno-epitelna interkonvertibilnost održava plastičnost stanice, što ukazuje na prisutnost visoko inducibilnog sustava u uvjetima LP za embrij. Ekspresija miRNA obitelji Let-7 opsežno je proučavana u različitim tkivima fetusa. Povećanje ekspresije Let-7 miRNA povezano je sa smanjenom proliferacijom i ranim povećanjem diferencijacije MM stanica, a posljedično, smanjenim brojem nefrona [27, 15, 68-71]. Veća ekspresija Let-7 dokazana je u višim organizmima tijekom posljednje faze cerebralne embriogeneze kod glodavaca [72, 73]. Nagalakshmi i sur. otkrili su da je Let-7 ekspresija miRNA promijenila sudbinu UB epitelnih stanica iz prekursora u diferencirano stanje [71]. Nasuprot tome, Yermalovich et al. pokazalo je da je prekomjerna ekspresija Lin28b, proteina koji veže RNA, povezana sa supresivnim Let-7 miRNA. Iako su lin28 i Let-7 poznati regulatori ontogenog vremena u beskralješnjaka, njihova uloga u razvoju organa sisavaca nije shvaćena [65]. U ovoj studiji, povećanje ekspresije Let-7a-5p miRNA u LP fetusu moglo bi biti povezano sa smanjenom proliferacijom CM stanica, ugrožavajući nefrogenezu u odnosu na NP skupinu. Stoga pretpostavljamo da se supresija proliferacije CM stanica i rani prestanak nefrogeneze uzrokovane povećanom Let-7 miRNA može dogoditi izravno ili neizravno kroz prolazno smanjenu ekspresiju Lin28b u 17-DG LP. Ovaj učinak može značajno narušitibubregrazvoj u 17-DG LP, potvrđujući da ovaj gen regulira vrijeme razvoja tijekom nefrogeneze. U ovoj studiji, povećana ekspresija Let-7a-5p miRNA podudara se sa smanjenjem ekspresije c-Myc. Myc je uključen u proliferaciju, rast, apoptozu i diferencijaciju stanica tijekombubrežniorganogeneza [74-76]. U LP 17-DG potomcima, ekspresija MM c-Myc gena bila je smanjena, a područje imunoreaktivnosti CM c-Myc bilo je 14 posto manje u usporedbi s onom u NP potomcima. Istovremeno, primijećeno je smanjenje od 14 posto u broju CM stanica za smanjenje Ki-67 imunoreaktivnosti od 48 posto u LP u odnosu na NP potomke. Dosljedno, studije su pokazale da c-Myc igra važnu ulogu u završnoj fazi grananja UB i u stimulaciji proliferacije progenitorskih stanica CM [74].
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE INFEKCIJE
smanjena razina u matičnim stanicama, održavajući ih u nediferenciranom stanju. Međutim, u ovoj studiji, jaka ekspresija Let-7a-5p miRNA u CM-u smanjila je ekspresiju c-Myc, čime se smanjila proliferacija progenitorskih stanica i rana diferencijacija stanica u LP 17-DG potomstvo (slika 10). Studije obubregac-Myc transgenih miševa otkrilo je istovremeno smanjenje c-Myc i S-ix-2 imunopozitivnih CM stanica povezanih sa smanjenom proliferacijom matičnih stanica [74]. Ova studija pokazuje značajno (28 posto) smanjenje u Six-2 pozitivnih stanica, specifičnobubrežnimarker matičnih stanica, kao što je uočeno smanjenje broja nefrona u CM potomaka 17-DG LP u usporedbi s onim u potomcima NP. Godine 2009. Fogelgren i sur. pokazalo je da je ekspresija gena Six-2 smanjena tijekom fetalne ontogeneze kada je povezana sa smanjenim brojem nefrona, hipertenzijom i kroničnimzatajenje bubrega[77]. Dakle, smanjena ekspresija gena Six-2 u stanicama progenitora CM ukazuje na supresiju diferencijacije izazvane signalom tijekombubrežnirazvoj u 17-DG LP potomstvu. Unatoč tome, redundanciju treba koristiti s oprezom - suptilni nedostaci u nefrogenezi mogu postati očiti detaljnijom analizom ili pod drugačijim uvjetima. Razine IGF1 mRNA bile su najviše tijekom početnog razdoblja metanefričkog razvoja, s transkriptima koji su otkriveni kroz MM, dok su njihove razine opadale tijekom daljnjeg razvoja. Međutim, tijekombubregembriogeneze, delikatna ravnoteža između čimbenika rasta koji olakšavaju nefron (IGF1) i inhibicijskih čimbenika rasta (TGF -1) regulira UB grananje.
Zaključak
Iako je nekoliko autora proučavalo nefrogenezu [34, 37, 78], malo se zna o mehanizmima koji određuju broj nefrona. Ova studija pokazuje da su mnoge miRNA, mRNA i proteini progenitorskih stanica MM promijenjene u potomcima 17-DG LP, što dovodi do smanjene proliferacije i rane diferencijacije stanica (Slika 11). Ova delikatna ravnoteža između obnove i diferencijacije nefrona preteče ključna je zabubregrazvoja jer je neuspjeh u postizanju odgovarajućeg broja nefrona čimbenik rizika za kroničnibubrežniporemećaj.
