Imunološki odgovori na sekvencijalnu binokularnu transplantaciju alogenih retinalnih progenitorskih stanica u šupljinu staklastog tijela kod miševa

Sažetak:

Intravitrealna transplantacija alogenih progenitorskih stanica ljudske retine (RPC) obećava kao tretman zasljepljujuće degeneracije retine. Prethodni rad je pokazao da se neuralni progenitori dobro podnose kao alografti nakon pojedinačnih injekcija; međutim, sekvencijalna isporuka alogenih stanica povećava potencijalni rizik od senzibilizacije domaćina s naknadnim imunološkim odbacivanjem presatka. Trenutna studija osmišljena je kako bi se procijenilo hoće li imunološki odgovor biti induciran ponovljenim intravitrealnim transplantacijama alogenih RPC-ova korištenjem životinjskog modela miša. U miševe primatelje BALB/c ubrizgali smo matične stanice mišje mrežnice (gmRPC), izvorno izvedene od donora s genetskom pozadinom C57BL/6, kako bismo pružili sigurnosne podatke o tome što se može očekivati ​​nakon ponovljenog liječenja pacijenata alogenim produktom ljudskih stanica . Imunološki odgovori na gmRPC bili su blagi, sastojali su se od T stanica, B stanica, neutrofila i prirodnih stanica ubojica, s jasnom prevladavanjem makrofaga. Životinje liječene ponovljenim dozama gmRPC-a nisu pokazale znakove senzibilizacije, niti je došlo do imunološki posredovane destrukcije presatka. Unatoč nedostatku imunosupresivnih tretmana, alogeni gmRPC presaci preživjeli su nakon ponovljenog doziranja, čime se podupire preliminarno zapažanje da se ponavljano ubrizgavanje alogenih RPC u šupljinu staklastog tijela tolerira kod pacijenata s retinitis pigmentosa.

biljka cistanche koja jača imunološki sustav

Kliknite ovdje za pregled Cistanche proizvoda za jačanje imuniteta

【Tražite više】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Ključne riječi: matične stanice; imunološka tolerancija; imuni privilegij; odbacivanje presatka; intravitrealna injekcija

1. Uvod

Retinitis pigmentosa (RP) obuhvaća klasu genetske degeneracije štapića i čunjića i rezultira progresivnim oštećenjem vida i konačnom sljepoćom. Za veliku većinu slučajeva ne postoje dokazane terapijske mjere za očuvanje ili vraćanje vida; međutim, jedna strategija za rješavanje ove nezadovoljene medicinske potrebe je transplantacija matičnih stanica. Naša istraživačka skupina istraživala je intravitrealnu injekciju uzgojenih stanica preteča ljudske retine (RPC) kao način intervencije u RP s terapeutskim ciljem stabilizacije progresije ili možda preokreta tijeka bolesti. RPG se mogu dobiti iz nezrelih retina donacijom tkiva ili, u novije vrijeme, iz pluripotentnih staničnih linija. Studije na životinjskim modelima pokazale su da su te stanice sposobne spasiti fotoreceptore od degeneracije nakon ubrizgavanja u oko te da su također sposobne diferencirati se u štapićaste fotoreceptore u oku domaćina. Postoje neki dokazi iz studija na životinjama da ubrizgani hRPC mogu postati funkcionalni, integrirani fotoreceptori i time potencijalno stabilizirati mrežnicu izravnom zamjenom umirućih stanica. Prema tome, ubrizgani hRPC mogu liječiti RP na neurotrofični način kao i putem mehanizma zamjene stanica. U svakom slučaju, ovaj stanični pristup nudi racionalnu strategiju za liječenje pacijenata oboljelih od RP i, potencijalno, drugih bolesti mrežnice.

Drugi povoljan atribut RPC-a, a možda i neuralnih progenitora općenito, je relativna tolerancija koju te stanice dobivaju nakon transplantacije kao alografta, osobito kada se dostavljaju na mjesto koje pokazuje imunološku privilegiju kao što je mrežnica [1,2]. S tim u vezi, nedavni pregledi kliničkih ispitivanja provedenih u području regenerativne medicine nastavljaju izvještavati o široko rasprostranjenim i značajnim izazovima povezanim s upalom i imunološkim odbacivanjem [3,4], uključujući intervencije usmjerene na oko kao što su retinalne genske terapije [5], kao kao i neke, ali ne sve stanične terapije [6]. Iako je lokalna vrsta stanica, stanica pigmentnog epitela mrežnice (RPE) nije izuzeta od problema odbacivanja [7-9]; stoga je imunološka supresija primatelja trenutno standardna praksa [10,11]. S druge strane, čini se da se ljudski RPC izuzetno dobro podnose kao alografti [6,12-16], iako se to ne odnosi na njihovu upotrebu kao ksenografta, gdje je potrebna imunološka supresija [17]. Osnova za održivo preživljavanje alogenih RPC-ova u oku vjerojatno uključuje niz čimbenika povezanih s korištenim stanicama i mjestom primatelja [1,8,18,19]. U prethodnom radu koristeći protočnu citometriju, pokazali smo da ljudski neuralni preci, i iz mozga i iz retine, izražavaju antigene glavne histokompatibilnosti (MHC) klase I, ali ne i klase II [20,21]. Klasični mehanizam odbacivanja presatka uključuje nespecifično prepoznavanje stranih molekula MHC klase II od strane CD4+ limfocita domaćina [20-25]. Na taj način, odsutnost molekula klase II može omogućiti cijepljenim progenitorskim stanicama da izbjegnu imunološko odbacivanje posredovano ovim mehanizmom. Međutim, prividni "imunološki privilegirani" status intravitrealno ubrizganih hRPC nije nužno apsolutan. Dok progenitori mišjeg središnjeg živčanog sustava (SŽS) ne eksprimiraju detektabilne molekule MHC klase I ili klase II na početku i pokazuju prividnu imunološku privilegiju kao alografti [1,2,20], te stanice mogu biti podvrgnute imunološkom odbacivanju pod određenim okolnostima. Studije su pokazale da se MHC antigeni mogu inducirati stimulacijom progenitora središnjeg živčanog sustava interferonom gama (IFN) [1,26]. CNS progenitori mogu biti odbačeni nakon senzibilizacije prethodno presađenog domaćina. Stoga, progenitorske stanice CNS-a (uključujući RPC-ove) eksprimiraju aloantigene koje detektira imunološki sustav domaćina. Zajedno, ovo implicira da je imunološki privilegirani status presađenih stanica prekurzora privremen i podložan modulaciji, npr. citokinima prisutnim u lokalnom mikrookruženju, i koji se mogu promijeniti tijekom degeneracija kao što je RP. Zbog svih ovih razloga, imunološki odgovor na višestruke intravitrealne RPC injekcije teško je predvidjeti i mora se posebno ispitati.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Ako se liječenje RPC-om pokaže klinički uspješnim u RP-u, postojat će jaki poticaji za liječenje oba oka u ovoj bilateralnoj sljepljujućoj bolesti. U najmanju ruku iz sigurnosnih razloga, binokularni tretmani obično bi se izvodili uzastopno, sa značajnim vremenskim odmakom između dvije injekcije. Treba napomenuti da ova sekvencijalna isporuka alogenih stanica može rezultirati senzibilizacijom domaćina kao odgovor na prvu injekciju, potencijalno izazivajući imunološko odbacivanje kao odgovor na drugu injekciju. To bi moglo dovesti do gubitka transplantata u oba oka. Prethodni izvještaji koji su ispitivali pojedinačno subretinalno doziranje hRPC-a u RP-u [27] ili ponovno doziranje ljudskim neuralnim progenitorima kod životinja [28,29] uključivali su imunološku supresiju. Stoga je sljedeća studija osmišljena kao translacijsko istraživanje mišjih RPC-ova kao sekvencijalnih alografta u imunološki kompetentnom soju miša s različitom genetskom pozadinom. Iako ne uključuje ljudske RPC proizvode, ovaj rad je obavljen kao dio IND-omogućujućih studija kako bi se pružili podaci o životinjama koji se odnose na sigurnost, tj. hoće li imunološka supresija biti potrebna za pacijente koji primaju ponovljene tretmane RPC alograftom u ispitivanjima registriranim od strane FDA.

2. Rezultati

Za proučavanje imunoloških posljedica bilateralne RPC injekcije u alogenim miševima, gmRPC (genetska pozadina C57BL/6) ubrizgani su intravitrealno u jedno oko primatelja BALB/c, a druga doza RPC ubrizgana je u drugo oko 2 tjedna kasnije. 2-tjedni vremenski interval odabran je tako da bude dovoljan da omogući prvom presatku da inducira i urođeni i adaptivni imunološki odgovor. Niti jedna od pokusnih životinja nije primila nikakvu terapiju lijekovima za supresiju imuniteta kako bi se mogli promatrati prirodni fiziološki imunološki odgovori.

2.1.Kliničko promatranje i oftalmološki pregled nisu otkrili abnormalnosti

Mase pokusnih životinja mjerene su u vrijeme svake injekcije gmRPC. Sve pokusne životinje pokazale su povećanje tjelesne težine između prve i druge injekcije, što je u skladu s općim dobrim zdravljem. Životinje koje su prekinute 14. dana i 28. dana ± 1 nakon druge injekcije gmRPC pregledane su kroz kirurški mikroskop. I prednji i stražnji segment većine pregledanih očiju ocijenjeni su kao "unutar normalnih granica" (WNL). Nije bilo znakova upale ili drugih vidljivih abnormalnosti unutar neliječenih, lažno liječenih i skupina liječenih gmRPC-om, što ukazuje da gmRPC intravitrealna injekcija nije izazvala nedopuštene upalne reakcije ili fizičko oštećenje tkiva koje se može otkriti ovom metodom. Nakupine stanica koje su sačinjavale transplantat bile su vidljive u staklastom tijelu i 14. i 28. dana ± 1 nakon druge injekcije gmRPC (Slika 1). Ponovljeno ubrizgavanje gmRPC nije izazvalo primjetne promjene u veličini klastera stanica, u skladu s održivim preživljavanjem stanica donora. Gruba patologija također je procijenjena na krajnjoj točki i nisu primijećene povećane očne jabučice (indikativno za stvaranje tumora) ili druge abnormalnosti.

Slika 1. Transplantirani gmRPC vizualizirani in vivo putem fotografije fundusa kroz kirurški mikroskop (svi=lijevo oko, OS). (A, B), lažno liječene životinje (lažno/lažno, S/S); (C, D), kontrolne životinje s lažno tretiranim desnim okom, a zatim lijevim okom tretiranim gmRPC-ima (lažna/stanica, S/C), i životinje s oba oka tretirana uzastopno s gmRPC-ima (stanica/stanica, C/C) promatrati i slikati kroz kirurški mikroskop. Gornja ploča (A, C, E) prikazuje slike OS-a snimljene 14. dana nakon druge injekcije; donja ploča (B, D, F) prikazuje slike OS-a snimljene 28. dana nakon druge injekcije. Alografti su viđeni kao blijedo obojene nakupine stanica (strelice) vidljive u staklastom tijelu lijevog oka u koje su ubrizgane stanice (S/C, C/C) u obje vremenske točke (14. dan: (C, D); i 28. dan: ( E, F)). Osim transplantata, nije bilo očite upale ili dodatne abnormalnosti viđene u prednjem i stražnjem segmentu, gledano aksijalno na ovaj način.

2.2. Imunofluorescentno označavanje pokazalo je imunološke stanice u staklastom tijelu

Imunofluorescentno označavanje za pet glavnih tipova imunoloških stanica (makrofagi, neutrofili, prirodne stanice ubojice, T stanice i B stanice) provedeno je na očnim kriosekcijama i otkrilo je pozitivnu infiltraciju imunoloških stanica u oku nakon injekcije gmRPC (Slika 2A–F). T stanice (CD3), B stanice (CD45R), neutrofili (Ly-6G) i prirodne stanice ubojice (CD49b) pokazale su ograničenu prisutnost u očima kojima su ubrizgani gmRPC, dok su aktivirani makrofagi (Iba-1 ) bile su glavne imunološke stanice koje su reagirale na intravitrealne presatke. Usporedivo tkivo neliječenih i lažno liječenih životinja nije pokazalo imunološke stanice u okularnim kriosekcijama, što sugerira da je viđena infiltracija imunoloških stanica bila odgovor na gmRPC presatke. U skladu s ovim opažanjem, imunološke stanice su bile smještene u području koje okružuje gmRPC presatke ili unutar samih gmRPC klastera.

Slika 2. Imunološko označavanje infiltriranih imunoloških stanica prema skupini za liječenje. Imunofluorescentne slike (A) kontrolnih presjeka (samo sekundarno protutijelo), (B) anti-Iba-1 (marker aktiviranih makrofaga i mikroglije), (C) anti-Ly-6G (marker neutrofila), (D) anti-CD49b (prirodni marker stanica ubojica), (E) antitijela anti-CD3 (marker T stanica) i (F) anti-CD45R (marker B stanica) prikazani su na slici. Ograničeni prisutni crveni signali označavaju pozitivno označavanje protutijela za markere leukocita, zeleni signali označavaju presatke gmRPC, a plavi signali označavaju nuklearno označavanje DAPI. Žuto je nespecifično preklapanje signala, najočitije u vanjskim segmentima fotoreceptora koji pokazuju autofluorescenciju. Terapijske skupine: neliječeno (UT), oba oka neliječena; S/S, oba oka lažno tretirana (sekvencijalno) nosačem; S/C, u desno oko ubrizgan je nosač, a zatim u lijevo oko s 50,000 gmRPC-a i; C/C, u oba oka ubrizgano je 50,000 gmRPC (sekvencijalno) prema rasporedu u odjeljku 4

Vršni broj svake imunološke stanice u oku varirao je ovisno o tipu stanice (Slika 3A-E). Nasuprot tome, dvosmjerna ANOVA nije otkrila razlike u infiltraciji imunoloških stanica pri usporedbi životinja koje su primile pojedinačne injekcije gmRPC (lažne/stanice) s onima koje su primile bilateralne injekcije (stanice/stanice). To je bio slučaj za infiltraciju makrofaga (bojanje protiv Iba-1) (slika 3A), neutrofila (bojanje protiv Ly-6G) (slika 3B), prirodnih stanica ubojica (bojenje CD49b) ( Slika 3C), T stanice (bojenje CD3) (slika 3D) i B stanice (bojenje CD45R) (slika 3E).

2.3. ELISPOT nije pokazao odgovore prisjećanja antigena

ELISPOT je način za ispitivanje aktivacije T stanica koje proizvode antigen-specifični IFN. Liječenje forbol 12-miristat 13-acetatom (PMA) bilo je pozitivna kontrola koja oponaša drugi glasnik, DAG, za aktivaciju puta receptora T stanica i, zauzvrat, izaziva aktivaciju T stanica. Na slici 4A–D, skupine tretirane PMA-om pokazale su puno veći broj IFN mrlja u usporedbi s kontrolnim skupinama sa samim stanicama koje su odgovorile (tj. limfociti iz CLN-a, splenociti iz slezene). Kada su stanice koje su odgovorile bile kokultivirane sa splenocitima C57BL/6 (B6 SPL), uzorci 14. dana bili su usporedivi sa skupinama sa samim stanicama koje su odgovorile, sa samo malo većim brojem IFN mrlja, što ukazuje na nedostatak aktivacije T stanica (Slika 4A, B).

Slika 3. Kvantifikacija infiltracije imunoloških stanica nakon transplantacije gmRPC. Infiltrirane imunološke stanice vizualizirane su kao crveni fluorescentni signali unutar polja snimanja nakon injekcije gmRPC za svaki eksperimentalni uvjet, izbrojane pomoću ImageJ i iscrtane u stupčastim grafikonima. Podaci iz Iba-1 (marker aktiviranih makrofaga i mikroglije) (A), anti-Ly-6G (marker neutrofila) (B), anti-CD49b (marker prirodnih stanica ubojica) (C), antitijela anti-CD3 (marker T stanica) (D) i anti CD45R (marker B stanica) (E) prikazani su na slici. Dvosmjerni ANOVA testovi korišteni su za testiranje značajnosti između lažnih/stanica i stanica/stanica grupa; p vrijednosti bile su: (A) p < {{10}}.4492, (B) p < 0.9376, (C) p < 0.119{{18 }}, (D) p < 0,6411 i (E) p < 0,7201 (nijedan nije bio značajan).

Prilikom testiranja alogenih donorskih stanica pomoću ovog testa, stanice koje su odgovorile iz životinja kojima je intraperitonealno ubrizgan gmRPC (IP skupina) nisu imale odgovore prisjećanja antigena budući da uzorci nisu pokazali veću aktivaciju T stanica brojanjem IFN točka u usporedbi s lažnim životinjama koje nikada nisu bile izložene. na gmRPC-ove (lažno/lažno). Ni životinje kojima su intravitrealno ubrizgani gmRPC-ovi, bilo jednom (lažna/stanica) ili opetovano (stanica/stanica) nisu pokazale nikakve reakcije prisjećanja antigena. U jednom slučaju, odgovori na ponovno doziranje gmRPC-a činili su se prigušenijim (Slika 4B). Zajedno, ovi rezultati pokazuju da gmRPC pokazuju vrlo nisku antigenost. Imajte na umu da su splenociti C57BL/6 usklađeni s genetskom pozadinom gmRPC-a. Neočekivano, alternativne stanice stimulatora, gmRPC, povećale su broj IFN mrlja u svim eksperimentalnim skupinama u usporedbi s negativnim kontrolnim skupinama (Slika 4A-D). Potencijalno objašnjenje mogu biti gmRPC-ovi koji uzrokuju visoku pozadinu u ovom testu. Važno je da nije bilo razlike između neliječenih, lažno liječenih, jednostruke injekcije gmRPC-a i skupina s ponovljenim injekcijama gmRPC-a, što je opet ukazivalo na odsutnost odgovora prisjećanja antigena.

Slika 4. ELISPOT kvantifikacija nakon transplantacije gmRPC. ELISPOT testovi postavljeni su kao sljedeće skupine: kontrola, same stanice koje reagiraju (limfociti ili splenociti koji sadrže T stanice izolirane iz cervikalnih limfnih čvorova (CLN) ili slezene (SPL) pokusnih životinja; PMA, stanice koje reagiraju tretirane forbolom {{1} }miristat 13-acetat (PMA) i Ca ionofor; B6 SPL, stanice koje su odgovorile pomiješane sa splenocitima izoliranim iz C57BL/6 životinja; gmRPCs, iste stanice koje su odgovorile pomiješane s gmRPC-ima. (A), Stanice koje su odgovorile bile su splenociti iz pokusnih životinja koje su žrtvovane 14. dana nakon druge injekcije gmRPCs. (B) Stanice koje su odgovorile bile su limfociti iz CLN pokusnih životinja koje su žrtvovane 14. dana nakon druge injekcije gmRPCs. (C) Stanice koje su odgovorile bili su splenociti iz pokusnih životinja koje su žrtvovane 29. dana nakon druge injekcije gmRPCs (D) Stanice odgovora bile su limfociti iz CLNs pokusnih životinja koje su žrtvovane 29. dana nakon druge injekcije gmRPCs. Dvosmjerni ANOVA testovi korišteni su za testiranje značajnosti (*) između lažnih/stanica i stanica/stanica skupina; p vrijednosti bile su: (A) p < 0.5332, (B) p < 0.0001 (značajno), (C) p < 0,0207 ( značajno), i (D) p < 0,3355.

3. Rasprava 

Postojao je značajan interes za tehnologiju matičnih stanica kao način liječenja degenerativnih bolesti mrežnice i naša grupa je istraživala upotrebu alogenih hRPC-ova u RP-u. Kako bismo prikupili podatke koji se odnose na potencijalne imunološke posljedice kada se više od jedne doze alogenog humanog RPC proizvoda primijeni putem intravitrealne injekcije, proveli smo ovu studiju na životinjama koristeći gmRPC iz C57BL/6 pozadine kao transplantate i BALB/c miševe kao domaćine. Ove različite genetske pozadine korištene su za modeliranje sekvencijalnog tretmana alogenim hRPC-ima i davanje preliminarnih podataka o sigurnosti prije testiranja na ljudima.

Za potpunu procjenu odgovora, životinje domaćini nisu primile nikakvo imunosupresivno liječenje. Usporedili smo imunološke odgovore generirane jednom injekcijom gmRPC sa sekvencijalnim bilateralnim doziranjem prema opisanom rasporedu injekcija. Oftalmološki pregledi nisu otkrili upalu ili bilo kakve druge značajne razlike između skupina životinja koje su primile 1 dozu gmRPC-a ili 2 doze gmRPC-a, što sugerira da ili primatelji nisu bili senzibilizirani početnim tretmanima gmRPC-om ili je senzibilizacija bila suptilna. Rezultati imunooznačavanja otkrili su da je svih pet ispitanih tipova imunoloških stanica, naime T-stanice (CD3), B-stanice (CD45R), makrofagi (Iba-1), neutrofili (Ly-6G) i prirodne stanice ubojice ( CD49b), infiltrirao se u oko i ciljao na RPC presatke nakon transplantacije. Usprkos tome, ta je infiltracija bila relativno umjerena i, iako su se mogle otkriti druge vrste stanica, pretežno se sastojala od Iba-1 pozitivnih makrofaga. Bio je prisutan vrlo ograničen broj T stanica, B stanica, neutrofila i prirodnih stanica ubojica. Zanimljivo je da je preživljenje prikazano pojedinačnim i ponovljenim RPC presacima bilo jednako, bez gubitka presatka u oba slučaja, unatoč prisutnosti makrofaga. Sve u svemu, ovo sugerira da su i urođeni i adaptivni imunološki odgovori na genetski različite RPC-ove bili umjereni, iako imunološka supresija nije korištena. Nadalje, rezultati ELISPOT testa nisu pokazali reakcije prisjećanja antigena u skupinama tretiranim gmRPC-om, što je u skladu s tvrdnjom da T stanice ne igraju važnu ulogu u odbacivanju gmRPC presatka iz C57BL/6 miševa. Ponovno je primijećena infiltracija makrofaga u gmRPC presatke, iako to nije bilo povezano sa značajnim uništavanjem presatka tipa povezanog s klasičnim imunološkim odbacivanjem [22-24].

koristi cistanche za muškarce-jača imunološki sustav

Zajedno, ova opažanja otkrivaju situaciju koja se jasno razlikuje od široko priznatih mehanizama alogenog odbacivanja transplantata posredovanih T i B stanicama koji se vide u drugim tkivima. Više čimbenika može pridonijeti ovoj situaciji. S jedne strane, postoji pojam oka kao "imunološki privilegiranog" mjesta, iako se manje proučava i možda više spori u kojoj mjeri staklasto tijelo dijeli takve karakteristike s rožnicom i mrežnicom. S druge strane, čini se da sami RPC pokazuju smanjenu imunogenost kao alografti, u usporedbi s tipovima stanica koji se češće proučavaju. Kao što smo prethodno pokazali, mišjim RPC nedostaje osnovna ekspresija MHC antigena klase I i klase II, iako ih je moguće inducirati stimulacijom citokina. Ova odsutnost ekspresije MHC-a mogla bi doprinijeti preživljavanju ovih stanica nakon transplantacije. Ipak, prisutnost imunoloških stanica u presacima podupire koncept da tolerancija na presatke u ovom okruženju nije pasivna i proizlazi iz aktivnog imunoregulacijskog fenomena. Ovdje treba naglasiti da je ista vrsta infiltracije imunoloških stanica već bila prisutna nakon pojedinačnih injekcija i nije pogoršana ponovljenim doziranjem, čime se naglašava naš zaključak da infiltracija imunoloških stanica presatka, osobito makrofaga, nije bila rezultat prethodnog senzibilizacija domaćina. Unutar parametara ovog eksperimenta, čini se da ponovljeno doziranje nije umanjilo ukupnu održivost transplantata, što je bilo u skladu s mogućnošću održive učinkovitosti u terapijskim kontekstima. Alternativni parametri, kao što su različiti intervali između injekcija, mogu ili povećati ili smanjiti aktivnost imunoloških stanica do mjere koja bi bila relevantna za kliničku primjenu. Nejasno je hoće li se stanični sastojci infiltrata, uključujući predominaciju makrofaga, također odnositi na ljude. Nadalje, preživljavanje ovih alografta možda ne ovisi o normalnoj mrežnici sa zdravom krvno-retinalnom barijerom. Ovdje korišteni BALB/c primatelji su albinosi i osjetljivi na svjetlosna oštećenja [30]. Štoviše, održivo preživljavanje više puta je viđeno u prethodnom radu s različitim modelima retinalne degeneracije (npr. [31]).

U usporedbi s preživljavanjem presatka, održivost stanica unutar presatka predstavlja složeniju situaciju. Poznat je gubitak progenitorskih stanica CNS-a koji se događa brzo nakon transplantacije, vjerojatno zbog više čimbenika koji potencijalno uključuju naglo povlačenje faktora rasta. Nakon što se smjeste u oku, disocirane stanice spajaju se u kuglaste nakupine, čiji centri izgledaju kao da pružaju suboptimalno mikrookruženje za rast, možda zbog nedostatka vaskularizacije i izazova difuziji hranjivih tvari. Očigledni tropizam makrofaga za RPC presatke mogao bi biti nespecifični odgovor na prisutnost ovih neživih stanica u unutrašnjosti presatka, pri čemu makrofagi funkcioniraju u svojoj ulozi čistača staničnih ostataka. Alternativno, potpuno održivi RPC-ovi mogu aktivno privući makrofage, npr. putem ekspresije kemo-atraktivnih citokina, nakon čega bi se stanice domaćina sekundarno susrele s ostacima iz neživih donorskih stanica. Važno je da se čini da stupanj infiltracije makrofaga koji se vidi u ovim posebnim postavkama nema negativne posljedice za presatak ili mrežnicu domaćina, za razliku od odgovora na stanične alografte na neimuno privilegiranim mjestima [4]. Na kraju, vrijedno je spomenuti da ovdje objavljeni rezultati, iako ograničeni na mišji model, mogu imati implikacije na rad kod ljudi. Za razliku od miša, znamo da kultivirani ljudski RPC izražavaju snažne razine MHC klase I antigena na početku; stoga je usporedba doduše provizorna. Unatoč tome, zanimljivo je primijetiti da je kliničko testiranje subretinalnih hRPC transplantata od strane skupine u Kini [13], kao i intravitrealna transplantacija hRPC od strane naše grupe, naknadno pokazalo održivo preživljavanje alografta u pacijenata bez imunosupresije s RP (JC -01, [32], neobjavljeni podaci). To je također bio slučaj nakon sekvencijalnog ubrizgavanja u oba oka (JC-01 Extension, neobjavljeni podaci), analogno radu predstavljenom ovdje. Osim toga, preživljenje transplantata uočeno je u studiji praćenja JC-02 [33], u kojoj su uzastopne ponovljene doze primijenjene na isto oko [34]. Uzeti zajedno, ovi nalazi pokazuju da imunološka supresija nije uvijek potrebna u okruženju transplantacije neuralnih progenitora, osobito oka, iako granice ovog fenomena i temeljne regulatorne mehanizme tek treba razjasniti.

4. Materijali i metode

4.1. Kultura stanica

Prethodno karakterizirani gmRPC [31] odabrani su kao donorske stanice za ovu alogeničku studiju. Izvorno, gmRPC su izolirani iz GFP-transgenih C57BL/6 miševa genetski modificiranih za ekspresiju pojačanog zelenog fluorescentnog proteina (GFP). Ekspresija GFP proteina u gmRPC-ima bila je zanimljiva jer omogućuje vizualizaciju presatka nakon injekcije bez potrebe za dodatnim označavanjem. Za trenutnu studiju, gmRPC-ovi su uzgajani u Advanced DMEM/F12 s dodatkom N-2 dodatka (1:100, Life Technology, Carlsbad, CA, SAD), Glutamax-1 (1:100, Life Technology , Carlsbad, CA, SAD) i EGF (20 ng/mL, rekombinantni, Human, Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) i inkubirani na 37 ◦C i 5% CO2. Stanice su održavane u miješanoj suspenziji/labavo pričvršćenim kolonijama u neobloženim tikvicama za kulturu tkiva. Stanice su pasirane tripsinizacijom s TrypLE Select CTS (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) razrijeđenim 1:5 u PBS-u tijekom jedne minute i neutralizirane 10 puta većim volumenom dodanog tripsina. Mješavina stanica-tripsin centrifugirana je na 140 g tijekom 2 minute na sobnoj temperaturi, supernatant je uklonjen, a stanični talog resuspendiran u svježem mediju prije nasađivanja u tikvice za kulturu tkiva u željenoj koncentraciji. Koncentracija stanica i sposobnost preživljavanja određeni su bojanjem tripan plavim; brojanje je izvršio Countess (Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) i hemocitometar.

Za intravitrealne injekcije, stanični talog je resuspendiran na 50K stanica/µL u BSS PLUS®. Koncentracija i vitalnost stanica procijenjeni su prije i poslije injekcija. Ubrizgana doza bila je 50 000 stanica po oku po injekciji. Doza i nosač odabrani su na temelju naših prethodnih studija.

4.2. Pokusne životinje

Svrha trenutne studije bila je istražiti potencijalne alogene imunološke odgovore izazvane ponovljenom intravitrealnom injekcijom alogenih RPC-a. Životinje primatelji bili su BALB/c miševi, koji se genetski razlikuju od C57BL/6 miševa iz kojih su gmRPC izolirani. Korištenje najmanje tri životinje po tretiranoj eksperimentalnoj skupini za svaku vremensku točku smatralo se potrebnim kako bi se omogućila procjena statističke značajnosti između skupina s obzirom na varijable ishoda i potencijalne gubitke životinja tijekom eksperimentalnog razdoblja. Nadalje, s obzirom na mnoge dodatne čimbenike koji potencijalno utječu na ishod eksperimenta, kao što je neuspješna procedura ubrizgavanja stanica ili potencijalno trošenje kao rezultat borbe životinja, postupci ubrizgavanja su provedeni na pet životinja po skupini kako bi se dodatno osiguralo ispunjavanje minimalnog broja potrebnog za statističku analizu.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

Tablica 1 prikazuje četiri skupine životinja pripremljene za svaku od četiri vremenske točke (4, 7, 14 i 28 dana) u kojima bi se izvršile procjene histopatološke analize, uključujući imunofluorescenciju. Dvije dodatne skupine životinja kojima je intraperitonealno ubrizgano 10ˆ6 gmRPC pripremljene su kao pozitivne kontrole za svaku od dvije vremenske točke ELISPOT procjene (14 i 28 dana). Tablica 2 sažima evaluacije predviđene za svaku skupinu.

Tablica 1. Eksperimentalne skupine.

Tablica 2. Vremenske točke evaluacije.

4.3. Intravitrealna injekcija

GmRPC su primijenjeni putem intravitrealne injekcije. Nakon anestezije, Mydriacyl (1% Tropicamide oftalmička otopina) i Phenylephrine (2,5% oftalmička otopina) primijenjeni su na oba oka životinje kojoj je trebalo ubrizgati injekciju. Kada je postignuta odgovarajuća midrijaza, životinja je ručno obuzdana, a glava životinje rotirana kako bi se poravnala okularna os oka koje se ubrizgava s optikom kirurškog mikroskopa kako bi se vizualizirao stražnji segment oka (tj. staklasto tijelo i mrežnica) . Oko je nježno ispruženo ručno pritiskom na kapke, a 31G igla na inzulinskoj šprici korištena je za nježno probijanje bjeloočnice uz limbus u donjem nosnom kvadrantu. Vrh mikropipete od poliranog stakla koji je sadržavao donorske stanice (ili kontrolu nosača) provučen je kroz rez u šupljinu staklastog tijela pod izravnom vizualizacijom. Pazilo se da se ne poremeti integritet leće ili strukture stražnjeg segmenta. Same stanice ili nosači su injektirani u volumenu od 1 mikrolitre. Nakon nekoliko trenutaka pauze kako bi se omogućilo ekvilibriranje intraokularnog tlaka, vrh pipete je postupno uklonjen iz oka, sve pod izravnom vizualizacijom. Zabilježeno je svako intraokularno krvarenje, zajedno s lokacijom. Nakon injekcije, životinja je stavljena u čisti kavez obložen svježim jastučićem za jednokratnu upotrebu okrenutom upijajućom stranom prema gore/plastičnom stranom prema dolje, kako bi se oporavila. Oporavak je olakšan korištenjem grijaćeg jastuka i potvrđen je sposobnošću životinje da se kreće. Nakon buđenja, životinja je prebačena u postoperativni kavez s ad libitum pristupom vodi. Životinje su vizualno praćene na dnevnoj bazi nakon operacije. Uočeni su minimalni ili nikakvi znakovi povezani s intraokularnom injekcijom.

Nakon postupka, životinje su promatrane zbog trljanja operiranog oka, nakostriješenog krzna ili dugotrajne letargije, što je sve predstavljalo razloge za hitnu eutanaziju. Dvije su životinje ubijene zbog rana zadobivenih u borbi. Sve ostale životinje su ubijene na planiranim krajnjim točkama. Eutanazija je izvršena inhalacijom CO2.

4.4. Oftalmološki pregled

A Leica Ultimate Red Reflex Surgical Microscope was used for ophthalmic examination and photography of experimental mice. Sedation was performed with a Ketamine Hydrochloride/Xylazine Hydrochloride mixture (50–100 mg/mL Ketamine, 5–10 mg/mL Xylazine) administered by intraperitoneal injection. After sedation, topical mydriatics (Tropicamide, Phenylephrine) were applied to the eye(s) to be imaged in 5 min intervals until adequate mydriasis was achieved, as determined via pupil diameter (>2,5 mm) i odgovor na svjetlosnu stimulaciju. Kao kompenzacija za gubitak treptanja, topikalno je primijenjena otopina hipromeloze (Gonak) prema potrebi na oba oka kako bi se spriječilo isušivanje rožnice. Za postupak snimanja, anestezirane životinje stavljene su na grijaću podlogu i postavljene u ležeći položaj prsne kosti. Na kraju postupka, djelomično poništenje anestezije postignuto je primjenom atipamezola (0.1–1 mg/kg) intraperitonealnom injekcijom.

4.5. Histopatologija

Imunološki odgovor kod životinja koje su primile dva uzastopna presatka (jedan u svakom oku) procijenjen je histopatologijom oba oka 4. dana, 7. dana, 14. dana i 28. dana ± 1 nakon injekcije u drugo oko. Miševi koji su tretirani u skladu s tablicom 1 su prekinuti na temelju navedenog rasporeda u tablici 2. Životinje su eutanazirane inhalacijom ugljičnog dioksida. Srčane perfuzije izvedene su na pokusnim životinjama s 2% paraformaldehidom (PFA) u fosfatnom puferu (PBS). Zatim su sve očne jabučice sakupljene i ostavljene da se namaču u 2% PFA/PBS 48 h na 4 ◦C. Fiksirane očne jabučice obrađene su kroz gradijent saharoze (10% saharoze u PBS-u 1 h na sobnoj temperaturi, 20% saharoze u PBS-u 1 h na sobnoj temperaturi i 30% saharoze u PBS-u na 4 ◦C preko noći) prije nego što su umetnute u OCT mediji za kriosekcije. Kriosekcije (10 µm) očiju obojene su Harrisonovim hematoksilinom i eozinom (H&E) kako bi se vizualizirala mikroanatomija retine i locirale ubrizgane donorske stanice.

Za skupine tretirane gmRPC-om, kriosekcije su procijenjene korištenjem imunofluorescencije za GFP+ (donatorske) stanice. Identifikacija specifičnih vrsta imunoloških stanica prisutnih u očima provedena je označavanjem specifičnim primarnim antitijelima za sljedeće: CD3 (marker T limfocita) [35], CD45R (marker limfocita B) [36], Iba-1 (marker aktiviranih makrofaga i mikroglije) [37], Ly-6G (marker neutrofila) [38] i CD49b (marker prirodnih stanica ubojica) [39]. Kriosekcije su isprane u PBS tri puta na sobnoj temperaturi i blokirane s 0.03% Triton X-100 i 10% normalnim kozjim serumom u PBS (NGS; Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, SAD) za 1 h na sobnoj temperaturi. Štakorski anti-mišji CD3 (1:100 razrjeđenje, BD Biosciences, San Jose, CA, SAD), štakorski anti-mišji CD45R (1:100, BD Biosciences, San Jose, CA, SAD), zečji anti-mišji Iba{{ 26}} (razrjeđenje 1:400, Wako Chemicals, Richmond, VA, SAD), štakorski anti-mišji Ly-6G (1:100 razrjeđenje, BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) i štakorski anti -mišji CD49b (1:100 razrjeđenje, BD Biosciences, San Jose, CA, SAD) naneseni su na uzorke i inkubirani preko noći na 4 stupnja. Uzorci su ponovno isprani u PBS-u 3 puta na sobnoj temperaturi. Alexa-Fluor-konjugirana sekundarna protutijela (kozja anti-štakorska Alexa-Flour-568 i kozja anti-zečja Alexa-Flour-568, Life Technologies, Carlsbad, CA, SAD) primijenjena su na uzorke tijekom 1 h na sobnoj temperaturi. Svi uzorci su zatim isprani u PBS-u još tri puta na sobnoj temperaturi. Pokrovna stakalca su postavljena pomoću DAPI Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL, SAD), a stakalca su ostavljena da se suše preko noći na sobnoj temperaturi.

4.6. ELISPOT i MLR testovi

RPC-specifične memorijske T-stanice praćene su 2 i 4 tjedna nakon postavljanja prvog transplantata pomoću enzimski vezanog imunosorbent spot testa (ELISPOT). Eksperimentalne skupine su postavljene kao što je prikazano u tablicama 1 i 2 za svaku vremensku točku. ELISPOT analiza hvata izlučene proteine ​​na mikropločici obloženoj specifičnim antitijelima i može se koristiti za određivanje aktivacije memorijskih T stanica otkrivanjem lučenja IFN T stanica. Eksperimentalno očitanje je broj IFN točaka na mikroploči. Broj prisutnih IFN točaka ukazuje na broj aktiviranih T stanica. Učestalost aloreaktivnih T stanica procijenjena je izvođenjem 48-satne reakcije miješanih leukocita (MLR) na 96-jažičnim Multiscreen-IP pločama (Millipore, Burlington, MA, SAD). Stanice odgovora bile su limfociti/splenociti koji sadrže T stanice pročišćene iz cervikalnih limfnih čvorova (CLN) i slezene pokusnih životinja, a stanice stimulatora bile su gmRPC izvorno izvedene iz C57BL/6 miševa. ELISPOT testovi su provedeni na temelju standardnog protokola. 96-Multiscreen-IP ploče s jažicama prethodno su navlažene s 15 µL 35% etanola po jažici pod sterilnim uvjetima. Ploče su isprane sterilnim PBS-om tri puta prije nego što je 100 µL antitijela za hvatanje IFN-a (klon AN-18, eBioscience, San Diego, CA, SAD) razrijeđenog u PBS-u (2 µg/mL) primijenjeno na ploče. Ploče su inkubirane preko noći na 4 stupnja prije nego što su MLR testovi provedeni na pločama. Ploče obložene protutijelima za hvatanje isprane su tri puta s PBS-om i zatim blokirane s RPMI1640 2 sata na 37 ◦C.

Svaka od testnih ploča uključivala je sljedeće kontrole: jažice koje nisu sadržavale stanice, jažice koje su sadržavale stanice bez stimulacije i jažice koje su sadržavale stanice tretirane forbol {{0}}miristat 13-acetatom (PMA) i Ca ionofor kao pozitivne kontrole. Tretman PMA služi kao pozitivna kontrola oponašanjem drugog glasnika, DAG, za aktivaciju puta receptora T stanica i zauzvrat izaziva aktivaciju T stanica, s Ca ionoforom koji olakšava ulazak iona kalcija u stanice. Ploče su inkubirane 36 h na 37 ◦C prije reakcije boje. Ploče su isprane s PBS-om koji je sadržavao {{10}}.01% Tween 20 šest puta, a zatim 100 µL antitijela za detekciju (klon R64A2, eBioscience, San Diego, CA, SAD), razrijeđeno u PBS (0,5 µg/mL) primijenjeno je u svaku jažicu. Ploče su inkubirane na 37 ◦C dodatna 2 sata. Ploče su ponovno isprane s 0,01% Tween 20 u PBS-u. Primijenjeno je 100 µL Streptavidin-AP (1:1000 razrjeđenje, Invitrogen) po jažici i ploče su inkubirane 45 minuta na sobnoj temperaturi. Sve ploče su opet tri puta isprane s 0,01% Tween 20 u PBS-u i samo s PBS-om još tri puta. Konačno, 100 µL BCIP/NBT (Sigma Aldrich, München, Njemačka) je dodano u svaku jažicu za bojanje. Sve su ploče opsežno isprane vodom iz slavine i osušene prije analize podataka.

cistanche tubulosa-poboljšava imunološki sustav

5. Zaključci

Ova studija pokazuje da sekvencijalni binokularni presaci alogenih RPC-ova u staklastu šupljinu ne izazivaju klasično imunološko odbacivanje kod miša. Premda je poznato da se ove alogene histološke studije ne mogu provesti s humanim kliničkim proizvodom RPC, čini se da su podaci u skladu s rezultatima kliničke sigurnosne studije (jCyte, JC-01E, neobjavljeni podaci) u kojoj su pacijenti s retinitisom pigmentosa primili su neistovremene bilateralne injekcije bez imunosupresivnog tretmana. Iako je teško izravno usporediti dvije studije, važno je napomenuti da su ukupni rezultati obiju pokazali sličnost u pogledu preživljenja alografta.

Reference

1. Hori, J.; Ng, TF; Shatos, M.; Klassen, H.; Streilein, JW; Young, MJ Neuralne pređašnje stanice nemaju imunogenost i otporne su na uništenje kao alografti. Matične stanice 2003, 21, 405–416. [CrossRef] [PubMed]

2. Klassen, H.; Schwartz, PH; Ziaeian, B.; Nethercott, H.; Young, MJ; Bragadottir, R.; Tullis, GE; Warfvinge, K.; Narfstrom, K. Neuralni prekursori izolirani iz mačjeg mozga u razvoju pokazuju retinalnu integraciju nakon transplantacije na mrežnicu distrofične mačke. Veterinar. Ophthalmol. 2007., 10, 245–253. [CrossRef] [PubMed]

3. Salado-Manzano, C.; Perpina, U.; Straccia, M.; Molina-Ruiz, FJ; Cozzi, E.; Rosser, AE; Canals, JM Je li imunološki odgovor usko grlo za staničnu terapiju u neurodegenerativnim bolestima? Ispred. Cell Neurosci. 2020, 14, 250. [CrossRef]

4. Petrus-Reurer, S.; Romano, M.; Howlett, S.; Jones, JL; Lombardi, G.; Saeb-Parsy, K. Imunološka razmatranja i izazovi za regenerativne stanične terapije. Komun. Biol. 2021, 4, 798. [CrossRef]

5. Bucher, K.; Rodriguez-Bocanegra, E.; Dauletbekov, D.; Fischer, MD Imunološki odgovori na retinalnu gensku terapiju bez pridruženih virusnih vektora - Implikacije za uspjeh i sigurnost liječenja. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 83, 100915. [CrossRef]

6. Singh, MS; Park, SS; Albini, TA; Canto-Soler, MV; Klassen, H.; MacLaren, RE; Takahashi, M.; Nagiel, A.; Schwartz, SD; Bharti, K. Transplantacija matičnih stanica retine: Uravnoteženje sigurnosti i potencijala. Prog. Retin. Eye Res. 2020, 75, 100779. [CrossRef]

7. Kamao, H.; Mandai, M.; Okamoto, S.; Sakai, N.; Suga, A.; Sugita, S.; Kiryu, J.; Takahashi, M. Karakterizacija stanica pluripotentnih matičnih stanica retinalnog pigmentnog epitela induciranih ljudima s ciljem kliničke primjene. Rep. matičnih stanica 2014., 2, 205–218. [CrossRef]

9. Sugita, S.; Kamao, H.; Iwasaki, Y.; Okamoto, S.; Hashiguchi, T.; Iseki, K.; Hayashi, N.; Mandai, M.; Takahashi, M. Inhibicija aktivacije T-stanica retinalnim pigmentnim epitelnim stanicama izvedenim iz induciranih pluripotentnih matičnih stanica. Istražite. Ophthalmol. Vis. Sci. 2015, 56, 1051–1062. [CrossRef]

9. McGill, TJ; Stoddard, J.; Renner, LM; Messaoudi, I.; Bharti, K.; Mitalipov, S.; Lauer, A.; Wilson, DJ; Neuringer, M. Neuspjeh presatka stanice RPE izvedenog iz alogenog iPSC-a nakon transplantacije u subretinalni prostor kod primata koji nisu ljudi. Istražite. Ophthalmol. Vis. Sci. 2018, 59, 1374–1383. [CrossRef]

10. Sugita, S.; Mandai, M.; Kamao, H.; Takahashi, M. Imunološki aspekti transplantacije RPE stanica. Prog. Retin. Eye Res. 2021, 84, 100950. [CrossRef]

11. Nair, DSR; Thomas, BB Strategije liječenja degenerativnih bolesti mrežnice temeljene na matičnim stanicama. Curr. Matične stanice Res. Ther. 2022, 17, 214–225. [CrossRef] [PubMed]

12. Martinez Velazquez, LA; Ballios, BG Sljedeća generacija molekularne i stanične terapije za nasljedne bolesti mrežnice. Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 11542. [CrossRef]

13. Liu, Y.; Chen, SJ; Li, SY; Qu, LH; Meng, XH; Wang, Y.; Xu, HW; Liang, ZQ; Yin, ZQ Dugoročna sigurnost transplantacije progenitorskih stanica ljudske retine u pacijenata s retinitis pigmentosa. Matične stanice Res. Ther. 2017, 8, 209. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Y.; Tang, Z.; Gu, P. Transplantacija temeljena na matičnim/progenitorskim stanicama za degeneraciju retine: pregled kliničkih ispitivanja. Cell Death Dis. 2020, 11, 793. [CrossRef] [PubMed]

15. Nijemac, OL; Vallese-Maurizi, H.; Soto, TB; Rotstein, NP; Politi, LE Matične stanice mrežnice, nade i prepreke. Svjetska J. Matične stanice 2021, 13, 1446–1479. [CrossRef]

17. Karamali, F.; Behtaj, S.; Babaei-Abraki, S.; Hadady, H.; Atefi, A.; Savoj, S.; Soroushzadeh, S.; Najafian, S.; Nasr Esfahani, MH; Klassen, H. Potencijalne terapijske strategije za degeneraciju fotoreceptora: Put do vraćanja vida. J. Transl. Med. 2022, 20, 572. [CrossRef]

18. Semo, M.; Haamedi, N.; Stevanato, L.; Carter, D.; Brooke, G.; Young, M.; Coffey, P.; Sinden, J.; Patel, S.; Vugler, A. Učinkovitost i sigurnost progenitorskih stanica ljudske mrežnice. prev. Vis. Sci. Technol. 2016, 5, 6. [Unakrsna Ref.]

18. Mochizuki, M.; Sugita, S.; Kamoi, K. Imunološka homeostaza oka. Prog. Retin. Eye Res. 2013, 33, 10–27. [CrossRef]

20. Yamasaki, S.; Sugita, S.; Horiuchi, M.; Masuda, T.; Fujii, S.; Makabe, K.; Kawasaki, A.; Hayashi, T.; Kuwahara, A.; Kishino, A.; et al. Niska imunogenost i imunosupresivna svojstva ljudske mrežnice izvedene iz ESC-a i iPSC-a. Stem Cell Rep. 2021, 16, 851–867. [CrossRef]

20. Klassen, H.; Schwartz, MR; Bailey, AH; Young, MJ Površinski markeri izraženi multipotentnim ljudskim i mišjim neuralnim progenitorskim stanicama uključuju tetraspanine i neproteinske epitope. Neurosci. Lett. 2001., 312, 180–182. [CrossRef]

22. Klassen, H.; Ziaeian, B.; Kirov, II; Young, MJ; Schwartz, PH Izolacija retinalnih progenitorskih stanica iz post mortem ljudskog tkiva i usporedba s autolognim moždanim progenitorima. J. Neurosci. Res. 2004., 77, 334–343. [CrossRef]

22. Ingulli, E. Mehanizam staničnog odbacivanja u transplantaciji. Pediatr. Nefrol. 2010, 25, 61–74. [CrossRef]

23. Issa, F.; Schiopu, A.; Wood, KJ Uloga T stanica u odbacivanju presatka i toleranciji na transplantaciju. Stručnjak Rev. Clin. Immunol. 2010., 6, 155–169. [CrossRef] [PubMed]

25. Nasr, M.; Sigdel, T.; Sarwal, M. Napredak u dijagnostici odbacivanja transplantata. Stručnjak Mol. dijagnoza 2016, 16, 1121–1132. [CrossRef] [PubMed]

25. Klassen, H.; Imfeld, KL; Ray, J.; Young, MJ; Gage, FH; Berman, MA Imunološka svojstva odraslih hipokampalnih progenitorskih stanica. Vis. Res. 2003, 43, 947–956. [CrossRef] [PubMed]

26. Weinger, JG; Weist, BM; Pleteni, WC; Klaus, SM; Walsh, CM; Lane, TE MHC neusklađenost rezultira odbacivanjem neuralnih progenitorskih stanica nakon transplantacije leđne moždine u modelu demijelinizacije izazvane virusom. Matične stanice 2012, 30, 2584–2595. [CrossRef] [PubMed]

27. ReNeuron, L. First-in-Human Phase I/IIa, Open-Label, prospektivna studija sigurnosti i podnošljivosti subretinalno transplantiranih stanica preteča ljudske mrežnice (hRPC) kod pacijenata s pigmentnim retinitisom (RP). Kliničko ispitivanje # NCT02464436. Dostupno na internetu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02464436 (pristup 27. veljače 2023.).

28. Lu, B.; Lin, Y.; Tsai, Y.; Girman, S.; Adamus, G.; Jones, MK; Shelley, B.; Svendsen, CN; Wang, S. Naknadna transplantacija ljudskog neuralnog progenitora u degeneriranu mrežnicu ne ugrožava početno preživljavanje presatka ili terapijsku učinkovitost. prev. Vis. Sci. Technol. 2015, 4, 7. [CrossRef] [PubMed]

29. Jones, MK; Lu, B.; Girman, S.; Wang, S. Terapeutske strategije temeljene na stanicama za zamjenu i očuvanje u degenerativnim bolestima retine. Prog. Retin. Eye Res. 2017, 58, 1–27. [CrossRef] [PubMed]

30. Bell, dipl. Kaul, C.; Bonilha, VL; Rayborn, ME; Shadrach, K.; Hollyfield, JG Miš BALB/c: Učinak standardne rasvjete vivarija na patologiju retine tijekom starenja. Exp. Eye Res. 2015, 135, 192–205. [CrossRef]

32. Klassen, HJ; Ng, TF; Kurimoto, Y.; Kirov, I.; Shatos, M.; Coffey, P.; Young, MJ Multipotentni retinalni progenitori izražavaju razvojne markere, diferenciraju se u retinalne neurone i zadržavaju svjetlosno posredovano ponašanje. Istražite. Ophthalmol. Vis. Sci. 2004., 45, 4167–4173. [CrossRef]

32. jCyte, Inc. Sigurnost jedne, intravitrealne injekcije humanih retinalnih progenitorskih stanica (jCell) u Retinitis Pigmentosa. Kliničko ispitivanje # NCT02320812. Dostupno na internetu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT02320812 (pristup 24. veljače 2023.).

33. jCyte, Inc. Sigurnost i djelotvornost intravitrealne injekcije progenitorskih stanica ljudske retine u odraslih s pigmentnim retinitisom. Kliničko ispitivanje # NCT03073733. Dostupno na internetu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT03073733 (pristup 24. veljače 2023.).

34. jCyte, Inc. Sigurnost ponovljene intravitrealne injekcije progenitorskih stanica (stanica) ljudske retine u odraslih osoba s retinitisom pigmentosa. Kliničko ispitivanje # NCT04604899. Dostupno na internetu: https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT04604899 (pristupljeno 24. veljače 2023.).

35. Oudejans, JJ; van der Valk, P. Imunohistokemijska klasifikacija neoplazmi T stanica i NK stanica. J. Clin. Pathol. 2002, 55, 892. [CrossRef] [PubMed]

37. Tostanoski, LH; Chiu, YC; Gammon, JM; Simon, T.; Andorko, JI; Bromberg, JS; Jewell, CM Reprogramiranje mikrookruženja lokalnog limfnog čvora promiče toleranciju koja je sistemska i specifična za antigen. Cell Rep. 2016, 16, 2940–2952. [CrossRef] [PubMed]

38. Jurga, AM; Paleczna, M.; Kuter, KZ Pregled općih i diskriminirajućih markera diferencijalnih fenotipova mikroglije. Ispred. Cell Neurosci. 2020, 14, 198. [CrossRef] [PubMed]

38. Li, JC; Zou, XM; Yang, SF; Jin, JQ; Zhu, L.; Li, CJ; Yang, H.; Zhang, AG; Zhao, TQ; Chen, CY Izvanstanične klopke neutrofila sudjeluju u razvoju tromboze povezane s rakom u bolesnika s rakom želuca. World J. Gastroenterol. 2022, 28, 3132–3149. [CrossRef]

39. Kee, BL Razvoj prirodnih stanica ubojica i ILC1. Encikl. Immunobiol. 2016, 1, 140–148.