Ekspresija imunoloških gena i funkcionalne mreže u različitim klasama lupus nefritisa Ⅰ

SAŽETAK

Cilj Istražiti korisnost platforme NanoString urazjašnjavajući bubregimunološki prijepisi za klasu III, IV i V lupus nefritis (LN) koristeći retrospektivnu kohortuformalinom fiksiran parafinski ugrađen(FFPE) tkivo biopsije bubrega.

Metode: Analiza prijepisa imunološkog gena provedena je pomoću platforme NanoString nCounter na RNA iz LN (n=55), bolesti tanke bazalne membrane (TBM) (n=14) i membranske nefropatije (MN) (n{ {2}}) FFPEbiopsija bubregatkivo. Uzorci LN-a sastojali su se od pojedinačnih biopsija klase III (n=11), IV (n=23) i V (n=21) bez miješanih lezija. Diferencijalna ekspresija gena provedena je pomoću NanoString nSolvera, s vizualizacijama vulkanskih dijagrama i toplinskih karata generiranih u R. Značajni transkripti ispitani su kako bi se identificirale funkcionalne mreže pomoću STRING i termina ontogeneze gena.

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE BILJNU FORMULACIJU CISTANCHE ZA BUBREGE

Rezultati U usporedbi s TBM, identificirali smo 52 značajno različito izražena gena zajednička za sve tri klase LN. Analiza putova pokazala je obogaćivanje signalnih putova interferona tipa I (IFN), komplementa i MHC II, pri čemu većina pokazuje najveću ekspresiju u LN klase IV. Naše biopsije LN klase IV također su pokazale značajnu regulaciju NF-κB signalizacije i imunološko obogaćivanje u usporedbi s biopsijama LN klase V. Transkripti iz puta IFN tipa I razlikuju LN klase V od MN.

Zaključak Naša transkriptomska analiza cijelog dijela bubrega pružila je uvid u molekularni profil LN klase III, IV i V. Podaci su istaknuli važne putove zajedničke za sve tri klase i putove obogaćene u našim biopsijama LN klase IV. Sposobnost otkrivanja molekularnih putova u LN-u korištenjem FFPE cijelih biopsijskih sekcija mogla bi imati kliničku korist u odabiru liječenja LN-a.

UVOD

Lupusni nefritis(LN) važna je manifestacija sustavnoglupus erythematosus(SLE) i razvija se u približno 40% bolesnika.1 Na njegovu prevalenciju utječu dob (veća kod SLE-a koji se pojavio u djetinjstvu) i etnička pripadnost (veća kod pacijenata koji nisu bijele rase) i obrnuto je povezana sa socioekonomskim statusom.2biopsija bubregavažan je dio liječenja LN3 4 i uloženi su značajni napori da se promjene uočene u biopsiji povežu s patogenezom, odabirom liječenja i prognozom.1 Za to je ključan bio razvoj sustava klasifikacije LN koji je uključivao standardizirane definicije biopsijskih lezija kako bi se smanjila varijabilnost među prijavama.

Konsenzusna klasifikacija LN5 Međunarodnog društva za nefrologiju/Društvo za bubrežnu patologiju (ISN/RPS) iz 2003. opisala je šest klasa: minimalni mezangijski LN (klasa I); mezangijski proliferativni LN (klasa II); žarišna LN (klasa III); difuzna LN koja se dalje može podijeliti na difuznu segmentalnu (klasa IV-S) i difuznu globalnu (klasa IV-G) proliferativnu LN; membranski LN (klasa V) i uznapredovali sklerozirajući LN (klasa VI). Aktivne (A, npr. endokapilarna hipercelularnost, fibrinoidna nekroza, stanični i mikrostanični polumjeseci) i kronične (C, npr. glomerularna skleroza, fibrozni polumjeseci) glomerularne lezije također su definirane i označene kada se opisuju klase III i IV. Na primjer, klasa IV-G (A) opisuje difuzni globalni proliferativni LN s aktivnim lezijama. Predloženo je ažuriranje ove klasifikacije.6 Preporuke su uključivale eliminaciju pododjeljaka razreda IV-S i IV-G budući da oni ne utječu na ishod. U meta-analizi, pojava bilo kojegzavršni stadij bolesti bubregailiudvostručenje serumskog kreatininanije se razlikovao između IV-S i IV-G klasa.7 Također je predloženo da se aktivni i kronični deskriptori zamijene indeksima aktivnosti i kroničnosti izvedenim iz NIH lupus aktivnosti i sustava bodovanja,8 čime se omogućuje kvantitativna procjena aktivnosti (a rezultat od 0 do 24) i kroničnost (rezultat od 0 do 12).

Klasa LN je kritična za informiranje menadžmenta.3 Imunosupresija se preporučuje kod aktivne LN klase III i IV, ali ne i kod LN klase II. Na odluku o pokretanju imunosupresije u LN klase V utječe stupanj proteinurije i njezin odgovor na blokadu renin-angiotenzin-aldosterona. Neuspjeh u kontroli proteinurije 12 mjeseci nakon liječenja povezan je s progresijom u kroničnu bubrežnu bolest9-11 pa je cilj liječenja smanjiti proteinuriju s ciljem potpunog kliničkog odgovora (<0.5–0.7 g per 24 hours).

Sama klasa LN manje je robusna u informiranju o ishodima jerčimbenici rizika za razvoj kronične bubrežne bolestiuključitikliničke značajkei zato što uključuju histološke značajke koje nisu obuhvaćene definicijama klase LN. To uključuje stupanj intersticijske fibroze i tubularne atrofije (IFTA) i specifične glomerularne lezije kao što su fibrinoidna nekroza i fibrozni polumjeseci.12 Kvantifikacija odabranih i dobro definiranih pojedinačnih bubrežnih lezija može dati informacije o prognozi. To je vidljivo u IgA nefropatiji gdje se pokazalo da ocjenjivanje mezangijske celularnosti, endokapilarne hipercelularnosti, segmentalne skleroze, tubularne atrofije, intersticijske fibroze i polumjesečaste ocjene za formiranje MEST-C rezultata pomaže u predviđanju rizika.13-15 Predložene revizije ISN-a /RPS 2003 konsenzusna klasifikacija LN-a mogla bi riješiti ove nedostatke6, ali se još uvijek temelji na upotrebi morfologije. Posljedično, postoji potreba za proučavanjem molekularnih putova unutar biopsija LN i razumijevanjem kako su oni povezani s klasama LN16 17 i ishodima liječenja.18 19 U smislu kliničke korisnosti, transkriptomska analiza biopsija bubrega je najveća napredni u dijagnostici odbacivanja bubrega posredovanog protutijelima gdje je povećanje ekspresije transkripata gena u biopsijskom tkivu, u iščekivanju validacije, dodano validiranim morfološkim kriterijima.20 Odrediti korisnost korištenja transkriptomskih podataka za poboljšanje kliničke korisnosti bubrega biopsije u SLE-u, upotrijebili smo tehnologiju NanoString za proučavanje ekspresije 750 prijepisa povezanih s imunološkim sustavom i upalom u presjecima fiksiranim formalinom i ugrađenim parafinom (FFPE) iz 55 biopsija LN-a, 14 biopsija s bolešću tanke bazalne membrane (TBM) i 9 biopsija s membranska nefropatija (MN).

METODE

Uzorci: FFPE tkivo biopsije bubrega dobiveno je iz arhiviranih uzoraka LN, TBM i MN koji su bili višak za kliničku upotrebu i gdje je bilo dostupno odgovarajuće tkivo za analizu. Isključene su biopsije lupusa s mješovitim lezijama ili značajnim ožiljcima. TBM je korišten kao kontrola bolesti zbog nedostatka dostupnih normalnih biopsija bubrega. Klinički parametri prikupljeni su retrospektivno iz zdravstvene dokumentacije. Interferonska (IFN) matrica rezultata dobivena je kao što je prethodno objavljeno.21 Potpuni odgovor definiran je kao omjer protein/kreatinin u urinu (uPCR) od<50mg/mmol and an estimated glomerular filtration rate (eGFR) of ≥60mL/min, or if <60mL/min at baseline not fallen by >20% godinu dana nakon biopsije. Djelomični odgovor definiran je kao uPCR<300mg/mmol with a≥50% improvement from baseline and eGFR criteria the same as for complete response. Non-response was defined as failing to achieve partial response by 1 year.

ekstrakcija RNA

Šest cijelih isječaka tkiva debljine 10 µm dobiveno je mikrotomom iz svakog FFPE bloka, nakon uklanjanja dvaju isječaka od 4 µm. Kako bi se spriječila unakrsna kontaminacija, oprema je očišćena s RNase Away između uzoraka, a za svaki je uzorak korištena nova oštrica. Izolacija RNA cijelog tkiva izvedena je istog dana korištenjem kompleta RNeasy FFPE (Qiagen, #73504), a koncentracija RNA procijenjena je spektrofotometrom NanoDrop ND1000 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, SAD; online dodatni podaci S1).

Analiza transkriptoma

Transcriptome analysis was performed using 100ng of total RNA on the NanoString nCounter platform (NanoString nCounter FLEX Dx analysis system, NanoString Technologies, Seattle, Washington, USA) with a probe CodeSet comprising the human PanCancer immune profiling panel (730 immune-related genes, 40 housekeeping genes, 6 positive control genes, 8 negative control genes) and additional 20 custom probes selected based on literature review (online supplemental table 1). Samples were run using two CodeSets which differed only by 10 unique probes, enabling us to analyze 750 endogenous transcripts across the 78 samples. CodeSet One: LN class III (n=6), class IV (n=9), class V (n=8), TBM (n=8), MN (n=1). CodeSet Two: LN class III (n=5), class IV (n=14), class V (n=13), TBM (n=6), MN (n=8). All samples passed NanoString quality control parameters (image quality control, binding density, positive control linearity and limit of detection). To control for inter-CodeSet variation and batch variability we used the nSolver Cross Reporter Library File (RLF) function to calibrate raw counts of overlapping probes using an identical sample run on both CodeSets. To reduce technical bias, and increase confidence and reproducibility, background thresholding was set at 100 counts, which is >dvostruko (srednja vrijednost+2 SD) sondi negativne kontrole. Brojevi su normalizirani na geometrijsku sredinu 10 kućnih gena (FCF1, HPRT1, MRPS5, MTMR14, POLR2A, PRPF38A, SDHA, SF3A3, TUBB i ZC3H14), odabranih kako su eksprimirani u svim vrstama uzoraka. Normalizirani brojevi za sve uzorke navedeni su u dodatnim mrežnim podacima S2.

Statistička analiza

Diferencijalna ekspresija gena (DGE) provedena je korištenjem algoritma napredne analize Solvera (V.4) Fast/Approxi mate koji koristi pojednostavljeni negativni binomni model za sve probe osim tamo gdje algoritam ne konvergira i koristi se metoda linearne regresije. LN, MN ili LN razred (III, IV i V) korišteni su kao nezavisne varijable, a TBM kao naša referentna skupina. Broj praga postavljen je na 100, a učestalost promatranja unutar uzoraka postavljena je na 8%; Vrijednost P prilagođena je Benjamini-Hochbergovom metodom s pragom lažnog otkrivanja postavljenim na 0.05. Dijagrami vulkana proizvedeni su korištenjem Enhanced Volcano paketa (https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano) u R.22 Funkcionalna vizualizacija mreže povezivanja proteina izvedena je korištenjem baze podataka STRING (https:// string-db.org/) , koristeći punu STRING mrežu. Rubovi mreže definirani su pouzdanošću, a interakcije su postavljene na najvišu ocjenu interakcije pouzdanosti (veća ili jednaka 0,9). Odspojeni čvorovi unutar mreža nisu prikazani. Značajni različito eksprimirani geni procijenjeni su za obogaćivanje pojmova genske ontologije (GO) (biološki procesi, molekularne funkcije, stanična komponenta), putova reaktoma i klastera lokalne mreže STRING. Mreže vizualne interakcije generirane su s funkcionalnim obogaćenjima u smislu GO (bioloških procesa) i STRING analize. Površinski proporcionalni Vennov dijagram preklapajućih različito eksprimiranih gena između LN potklasa generiran je pomoću BioVenn-a (www.biovenn. nl).23 Podaci iz naprednog softvera za rješavanje analiza očitani su u R statističko okruženje, a vizualizacija podataka izvedena je korištenjem boxplotova, analize glavnih komponenti, grafikoni vulkana i toplinske karte. Toplinske karte generirane su pomoću Z rezultata normaliziranih brojanja i featmapa u R. Klasteri su analizirani pomoću Fisherovog egzaktnog testa. Za usporedbu više skupina korištena je analiza varijance Sidakovim testom višestrukih usporedbi. Podaci su analizirani pomoću GraphPad Prism (V.8.0).

Izjava o uključenosti pacijenata i javnosti (PPI).

Ova je studija bila dio konzorcija MASTERPLANS i pacijenti suradnici su sudjelovali u svakoj radnoj cjelini uključujući ovu studiju. PPI je izradio rječnik pojmova kako bi se omogućio daljnji angažman sa širom zajednicom pacijenata, a nalazi istraživanja uključeni su u dane pregleda laika. Laičke recenzije publikacija dijele se na web stranici MASTERPLANA (https://sites.manchester.ac.uk/masterplans).

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

NABAVITE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOSIDA I 9% AKTEOZIDA ZA BUBREGE