Tandemska spektrometrija mase visoke razlučivosti identificira određeni gangliozidni uzorak u ranoj dijabetičkoj bolesti bubrega kod pacijenata s dijabetesom melitusom tipa 2 Ⅱ

2.2. Detaljna strukturna analiza polisijaliranih vrsta povezanih s makroalbuminurijom pomoću HCD MS/MS

HR-MS probir pokazao je da je gangliozid pacijenata s makroalbuminuricom karakteriziran povišenim ukupnim sadržajem sijalične kiseline. Ne manje od četiri pentasialo gangliotetraoze klase GQ1 identificirane su u uzorku A3 s velikom preciznošću mase. Ion na m/z 812,7{{10}}68, detektiran samo u spektru mase probira za A3, pripisan je, prema izračunu mase, trostruko deprotoniranom i natriranom GQ1(d18:1/18 :0). Kako bismo detaljno strukturno karakterizirali ovu vrstu povezanu s makroalbuminurijom, izolirali smo ion na m/z 812,7068 i podnijeli ga HCD MS/MS na HR u modu negativnih iona. Ciljevi ovog tandem MS eksperimenta bili su: (i) istraživanje strukture oligosaharidnog lanca; (ii) potvrda sastava ceramida, koji je postuliran s obzirom na masu cjelokupne molekule GQ1; (iii) prikupljanje specifičnih podataka o lokalizaciji monosaharida Neu5Ac duž oligosaharidne okosnice, što dovodi do razlikovanja izomera od pet najčešćih GQ1(d18:1/18:0) struktura (Slika 3) koje bi mogle biti prisutne u urinu makroalbuminuričnih pacijenata.

Prikazan je fragmentacijski spektar iona prekursora [M-4H+Na]3− detektiran na m/z 812,7068, generiran kombiniranjem TIC-a dobivenog dvije minute pod promjenjivom energijom sudara unutar raspona od 30-80 eV. na slici 4.

Slika 3. Pet najčešćih izomera GQ1(d18:1/18:0): (A) GQ1a(d18:1/18:{{10}}) izomer; (B) GQ1b(d18:1/18:{{20}}) izomer; (C) GQ1c(d18:1/18:0)izomer; (D) GQld(d18:1/18:0) izomer; (E) GQ1e(d18:1/18:0) izomer.

Usluga podrške Wecistanche-najvećeg izvoznika cistanche u Kini:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Kupite za više pojedinosti o specifikacijama:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE OVDJE DA DOBIJETE PRIRODNI ORGANSKI EKSTRAKT CISTANCHE SA 25% EHINAKOZIDA I 9% AKTEOZIDA ZA BUBREŽNE INFEKCIJE

MS/MS podaci potvrđuju (d18:1/18:0) sastav ceramida pomoću Y0 na m/z 564,8704 i Y1 na m/z 726,5845 koji odgovara sekvenci Glc-Cer, kao i ion unutarnjeg cijepanja, S, na m/z 325,1828 koji odgovara C18:0 masnoj kiselini (Slika 5). Isto tako, ukupni status sialilacije molekule je također dokumentiran. Stoga, ionom B1 detektiranim na m/z 290,0868 i njegovim natrijumom na m/z 312,0686 što odgovara odvajanju jednog ostatka Neu5Ac od matičnog iona, zajedno s distalnim elementom detektiranim na m/z 581,1807 i m/z 603,1626 , potvrđuju pojavu veze Neu5Ac-Neu5Ac.

Slika 5. Shema fragmentacije pomoću HCD MS/MS koju je doživio [M-4H++Na+ ] 3− prekursor na m/z 812,7068 i dijagnostika iona sekvence za GQ1d strukturni izomer.

Uzimajući u obzir najčešći položaj vezivanja ostataka Neu5Ac na unutarnjem ili vanjskom Gal, postoji pet mogućih strukturnih kandidata za GQ1(d18:1/18:0), kao što je prikazano na slici 3. Međutim, ion na m/z 1032,3662 formirana dvostrukom vezom i unutarnjim križnim cijepanjem prstena i dodijeljena Z4 /Y0/ 2,4A2, zajedno s ionom detektiranim na m/z 936,7894 kao Y2 / 3,5A1, podržava vezanje sva četiri Neu5Ac ostatka na unutarnji Gal. Iako se učestalost drugih strukturnih izomera ne može potpuno isključiti, ova dva iona fragmenta pokazuju da je strukturni motiv u skladu s (D) kandidatom, koji odgovara d izomeru GQ1(d18:1/18:0) , definitivno je prisutan u uzorku A3. Shema na slici 5 prikazuje putanju fragmentacije koju doživljava prekursorski ion koji odgovara GQ1d(d18:1/18:0).

Sljedeći polisijalični kandidat povezan s makroalbuminurijom za detaljnu strukturnu analizu je [M-3H+ ] 3− ion detektiran isključivo u spektru mase uzorka A3 pri m/z 708,3379 i dodijeljen, na temelju točnog izračuna mase, na GT1(d18:1/18:0). Ovaj ion je izoliran i podvrgnut analizi fragmentacije pomoću tandem MS pomoću HCD. Spektar produkta iona generiran zbrajanjem skeniranja snimljenih tijekom 2 minute pri promjenjivim energijama sudara između 30 i 80 eV prikazan je na slici 6, zajedno s kemijskom strukturom ove vrste i dodjelom glavnih signala. Mehanizam fragmentacije pod korištenim MS/MS uvjetima, zajedno s dijagnostičkim fragmentima iona, prikazan je na slici 7. Kako bi se poboljšala vidljivost svih dodijeljenih produktnih iona, tablica 3 nadopunjuje popis identificiranih signala u spektru prikazanom na slici 6.

Slika 6. Strukturna analiza pomoću (−) nanoESI HR HCD MS/MS iona prekursora [M-3H+ ] 3− otkrivenog u uzorku A3 pri m/z 708,3379, što prema za izračun mase, odgovara GT1(d18:1/18:0). Vrijeme prikupljanja: 2 min; promjenjive energije sudara unutar 30–80 eV. Umetak: struktura GT1b(d18:1/18:0) izomera izvedena iz MS/MS podataka.

Fragmentacija HCD-a dovela je do nekoliko sekvencijskih iona, koji su nastali kao rezultat glikozidnih veza i križnih cijepanja prstena. Ovi ioni su vrlo korisni za dodjeljivanje cijele sekvence ugljikohidrata, s identifikacijom GT1 položajnih izomera i za potvrdu sastava ceramid aglikona.

D18:1/18:0 tip ceramida otkriven je ionom Y0 na m/z 564,5353 i podržan Glc-Cer sekvencom identificiranom kroz Y1 na m/z 726,5879. Nadalje, dodjela iona dokazuje prisutnost GT1 izoforme. Ion na m/z 493,1669, sa sastavom NeuAc-GalNAc, može se pojaviti isključivo iz GT1, koji je karakteriziran sijalilacijom GalNAc ostatka. Ostatak fragmenata iona sugerira postojanje strukturnog izomera GT1b u uzorku A3. Strukturu GT1b podupiru svi ioni koji proizlaze iz nereducirajućeg kraja molekule, dokumentirani nizom Y-tipa, popraćeni s dva iona Z, od kojih se jedan pojavljuje u manjoj količini (Slika 6). Međutim, Y2 /B2 detektiran kao ion s priličnom zastupljenošću na m/z 888,6405 daje dokaz o sekvenci Gal–Glc–Cer, koja vjerojatno potječe iz izomera GT1a ili GT1b nakon odgovarajuće desijalacije odvajanjem Neu5Ac ili Neu5Ac-Neu5Ac iz unutarnji Gal ili iz izomera koji sadrži nesupstituirani unutarnji Gal, kao što je GT1d.

S druge strane, Y2 detektiran na m/z 734,5701 potkrepljuje disijalo lokalizaciju Neu5AcNeu5Ac elementa na unutarnjem Gal, konfiguraciju koja je u skladu s GT1b izomerom. Prisutnost distalne skupine također dokazuje ion B2 na m/z 581,1828.

U HCD MS/MS, nekoliko signala je povezano s parcijalnom desijalilacijom molekule, kao što su Y4 i/ili Y3 ioni koji odgovaraju desijaliranoj Gg4Cer sekvenci; međutim, ti ioni ne mogu ukazivati ​​na mjesta vezanja Neu5Ac na neutralnoj Gg4 glikanskoj jezgri. Osim toga, signal na m/z 364,1243 koji odgovara sekvenci Gal–GalNAc dodijeljenoj ionu GT1b unutarnjeg cijepanja B3 /B1 može se pripisati izomeru GT1c jer ovaj glikoform sadrži nesupstituirani terminalni disaharid Gal–GalNAc. Stoga, osim Y2, koji je povezan s GT1b, svi ioni mogu nastati iz drugih položajnih izomera Neu5Ac, kao što su GT1a, GT1, GT1c ili čak rijetko prijavljeni GT1d. S druge strane, sam Y2 mogao bi biti rezultat događaja niske vjerojatnosti, koji je također eliminirao Neu5Ac iz elementa ispitivanja povezanog s unutarnjim Gal.

S obzirom na to da, osim otkrivanja GT1, MS/MS podaci koji se odnose na cijepanja glikozidnih veza nisu mogli jednoznačno dodijeliti druge GT1 izomere u smjesi A3, pažljivije smo analizirali ione cijepanja prstena kako bismo otkrili moguću unutarnju fragmentaciju koja podržava GT1b. Primijetili smo trostruko nabijeni ion niskog intenziteta na m/z 634,6067, što je u skladu s 0,2 tipom križnog cijepanja prstena na jednom od krajnjih ostataka sialinske kiseline, koji, u u slučaju vrste GT1b, može se pojaviti iz 0, 2X4 ili 0,2X3 ili oboje. Budući da je izomer GT1b općenito češći od GT1, slike 6 i 7 prikazuju dodjelu iona i shemu fragmentacije specifičnu za GT1b.

Zbog simetrije lanca Gal-GalNAc-Gal, ne postoji mogućnost potpunog isključivanja drugih strukturnih izomera. Iako podaci HCD MS/MS pokazuju postojanje GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18: 0) u uzorku A3 ne može se isključiti moguća pojava drugih GQ1 i GT1 izomera. Međutim, naša otkrića pokazuju da tri izomera-GQ1d(d18:1/18:0), GT1b(d18:1/18:{{30}}) i GT1 (d18:1 /18:0) su definitivno prisutni u uzorku A3 i mogu se dalje proučavati kao molekularni markeri makroalbuminurije.

3. Materijali i metode

3.1. Kriteriji za upis predmeta

Kako bi se razvila i potvrdila metoda, procijenjena je skupina bolesnika s DM tipa 2 i zdravih kontrolnih subjekata u pilot studiji presjeka. Ukupno 30 pacijenata sa DM tipa 2 koji su pohađali Ambulantu za nefrologiju i Dijabetes i bolesti metabolizma podijeljeni su u 3 skupine premaalbumin u mokraći/omjer kreatinina(UACR) kako slijedi: 10 bolesnika s normoalbuminurijom (A1, definirano kao UACR < 30 mg/g), 10 s mikroalbuminurijom (A2, UACR 30–300 mg/g) i 10 s makroalbuminurijom (A3, UACR > 300 mg/g/ g). Deset zdravih kontrolnih ispitanika odgovarajuće dobi i spola (C) koji su odlazili na rutinske preglede u ordinaciju liječnika opće prakse bez poznate anamneze bubrežnih bolesti i bez DM (isključeno vrijednošću HbA1c manjom ili jednakom 5,6%) također je bilo uključeno u ovo istraživanje studija

Svi pacijenti uključeni u studiju imali su minimalno 5-godišnje trajanje DM, stabilnu funkciju bubrega najmanje 2 godine, dobru kontrolu krvnog tlaka (<130/80 mmHg), negative urinary sediment, and a negative urine culture. The exclusion criteria were represented by other causes of proteinuria (other glomerular diseases, neoplasia, or autoimmune diseases), hematuria, poor control of DM (HbA1c > 10%), liver diseases, and pregnant or lactating women. The patients had no indication for biopsija bubrega(nedostatak hematurije i drugih uzroka proteinurije, nema brzog pada GFR).

3.2. Etička izjava

Studija je provedena u skladu s Helsinškom deklaracijom, a protokol je odobrilo Etičko povjerenstvo u istraživanju ustanove (Odbor za humanističke studije-"Victor Babes" Sveučilište medicine i farmacije Temišvar, br. 15/12.09.2016. ; Županijska hitna bolnica, br. 100/23.11.2016.). Svi pacijenti i kontrolne skupine pristali su sudjelovati u studiji potpisivanjem obrasca za informirani pristanak.

3.3. Laboratorijske procjene

Urinarni gangliozid 30 pacijenata s DM tipa 2 ispitan je u pilot studiji presjeka usporednim testom s 10 zdravih kontrola. Biokemijski parametri odnosili su se na serumsku ureu i kreatinin, 24-satnu proteinuriju, UACR, sediment urina i urinokulturu. Svi pacijenti su bili negativni na urinarne infekcije. Sastav nativnih smjesa gangliozida detektiran je iz uzoraka urina prikupljenih 24 sata. Uzorci urina pacijenata i kontrola kratkotrajno su pohranjeni na -20 ◦C i odmrznuti prije analize.CKDdefiniran je prema KDIGO smjernici za evaluaciju iliječenje kronične bolesti bubrega. eGFR je izračunat pomoćukronična bolest bubregaformula jednadžbe epidemiološke suradnje (jednadžba kreatinina CKD-EPI 2009) [16].

3.4. Ekstrakcija i pročišćavanje gangliozida

Ekstrakcija gangliozida slijedila je metodu koju su razvili Svennerholm i Fredman [17] i modificirali Vukeli´c et al. [18]. Prethodno smo prilagodili ovaj protokol za ekstrakciju i pročišćavanje gangliozida iz tjelesnih tekućina i primijenili ga na gangliozide cerebrospinalne tekućine (CSF). Metoda je detaljno opisana u našoj prethodnoj studiji koja se odnosi na profiliranje i analizu fragmentacije gangliozida CSF-a spektrometrijom mase [19]. Ukratko, lipidi su ekstrahirani dva puta pomoću mješavine kloroforma (C)/metanola (M)/vode (W) do ukupnog volumenskog omjera 1:2:0.75 C/M/W, s "W" odgovarajućim na urin; stoga je smjesa sadržavala 4 mL C, 8 mL M i 3 mL uzorka urina. Kloroform i metanol analitičke čistoće nabavljeni su od Mercka (Darmstadt, Njemačka) i korišteni su bez daljnjeg pročišćavanja. Nakon potpunog odvajanja faza, slijedeći postupke opisane u [19], sakupljena je gornja faza koja sadrži polarne glikosfingolipide.

Pročišćavanje sakupljenih sirovih gangliozida postignuto je u nekoliko koraka [19]: uklanjanje istaloženih kompleksa protein-sol, nakon čega slijedi centrifugiranje, gel filtracija na koloni Sephadex G-25 (Sigma-Aldrich, Burlington, MA, SAD ) kako bi se uklonili kontaminanti niske molekularne težine, i konačno, noćna dijaliza na 4 ◦C protiv vode. Gangliozidi su ekstrahirani pod identičnim uvjetima iz svih alikvota urina, dajući mješavine A1 (normoalbuminurija), A2 (mikroalbuminurija), A3 (makroalbuminurija) i C (kontrola).

3.5. Priprema uzorka za spektrometriju mase

Pročišćeni ekstrakti gangliozida A1, A2, A3 i C ispareni su do potpune suhoće u sustavu SpeedVac Concentrator SPD 111 V (Savant, Düsseldorf, Njemačka) povezanom s vakuumskom pumpom. Za MS skrining, svaki suhi ekstrakt je otopljen u čistom metanolu kako bi se stvorila osnovna otopina i pohranjen na -20 ◦C. Prije MS analize, osnovne otopine su centrifugirane u modelu centrifuge Sigma 2–16 (Sartorius AG, Göttingen, Njemačka). Za Orbitrap MS infuziju, radni uzorci s koncentracijom od 5 pmol·µL -1 u čistom metanolu dobiveni su razrjeđivanjem alikvota iz osnovne otopine. Koncentracija gangliozida u infundiranoj otopini izračunata je za prosječnu molekulsku masu od 2000 g mol-1.

3.6. Orbitrap masena spektrometrija s nanoESI

MS eksperimenti izvedeni su na LTQ Orbitrap Velos Pro™ masenom spektrometru (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Njemačka) opremljenom offline nanoES izvorom ES 259 ​​(Thermo Fisher, Bremen, Njemačka).

Instrument je hibridni maseni spektrometar koji kombinira dvije različite vrste analizatora mase i pruža mnoštvo prednosti: visoku osjetljivost i točnost, dobru kvalitetu podataka i brzinu analize, potencijal detekcije manjih komponenti u složenim smjesama, malu potrošnju uzorka, te izbjegavanje unakrsnog ispitivanja i prijenosa s uzorka na uzorak.

Prvi analizator je dvotlačna linearna kvadrupolna ionska zamka koja može izolirati ion sa specifičnim omjerom mase i naboja (m/z) i aktivirati ga stavljanjem kinetičke energije u ion sa specifičnim m/z kako bi izazvati disocijaciju izazvanu kolizijom. Drugi analizator je Orbitrap, koji se sastoji od cilindrične vanjske elektrode i bačvaste unutarnje elektrode, koja hvata ione u kružnim orbitama oko unutarnje elektrode. Ima izvrsnu moć razlučivanja i nudi mogućnost sekvencioniranja složenih ionskih vrsta u višefaznim MS (MSn) eksperimentima učinkovitim tehnikama fragmentacije.

Borosilikatne kapilare (duge 10 cm) izvučene su Sutter p-97 izvlakačem za mikropipete kako bi se proizvele kapilare u elektrospreju s veličinom vrha 10 µm i duljinom suženja od 4 mm. Volumen od 10 µL otopine u koncentraciji od 5 pmol·µL -1 u metanolu uveden je u stražnji dio emitera, a platinasta žica od 0,25 mm umetnuta je u otopinu. Vrijednosti potencijala primijenjene na platinastu žicu i stožac stalno su podešene kako bi se postigla učinkovita ionizacija komponenata. NanoESI proces je pokrenut postavljanjem instrumentalnih parametara kako slijedi: nanoESI napon, 0,80 kV; napon konusa, 40–60 V; temperatura desolvatacije, 80 ◦C; RF razina S-leće, 60%. Ove vrijednosti MS parametara pojačale su ionizaciju i postojano prskanje i, u isto vrijeme, smanjile fragmentaciju unutar izvora labilnog Neu5Ac ostatka vezanog za oligosaharidnu jezgru molekule gangliozida.

Svi maseni spektri (MS i tandem MS) dobiveni su u HR modu, detekciji negativnih iona i unutar 200–2000 m/z raspona. MS skenovi su snimljeni s rezolucijom postavljenom na 60.000. Masenim spektrometrom upravljao je i kontrolirao ga LTQ Tune Plus v2.7 (Thermo Scientific, Bremen, Njemačka), a MS prikupljanje i obrada podataka postignuto je pomoću softvera Xcalibur 3.0.63 (Thermo Scientific, Bremen, Njemačka).

MS/MS eksperimenti su izvedeni u LTQ pomoću CID u kolizijskoj ćeliji koristeći helij 5.0 čistoće pri tlaku od 50 psi kao kolizijski plin. MS/MS skenovi snimljeni su s rezolucijom postavljenom na 20,000. Odabir iona i fragmentacija izvedeni su ručno. Prekurzorski ioni odabrani su unutar izolacijske širine od 1 m/z jedinice i fragmentirani HCD-om korištenjem promjenjive energije sudara unutar raspona 30-80 eV kako bi se povećala pokrivenost fragmentarnih iona.

TIC-ovi i maseni spektri dobiveni kombinacijom akumuliranih skeniranja obrađeni su korištenjem softvera Xcalibur 2.1 (Thermo Scientific, Waltham, MA, SAD), koji omogućuje izdvajanje spektara, kao i njihovo izglađivanje i oduzimanje.

Prije pokusa, m/z ljestvica je eksterno kalibrirana korištenjem namjenske reference komercijalno poznate kao Pierce® ESI Negative Ion Solution tvrtke Thermo Scientific (Waltham, MA, SAD). U načinu rada s negativnim ionima, ovaj je standard dao spektar s poštenom ionskom pokrivenošću m/z raspona skeniranog u MS i tandem MS eksperimentima.

Za optimizaciju nanoESI MS i MS/MS uvjeta u načinu rada s negativnim ionima, usporedbu i procjenu podataka, izmjerene su sljedeće standardne frakcije gangliozida, koje su komercijalno dostupne: GM1 (goveđi mozak); GD1a, GD1b, GT1b i GQ1b (svinjski mozak); i GM3 i GD3 (goveđe mlijeko) iz Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL, SAD), kao i cijeli ekstrakt gangliozida iz goveđeg mozga, komercijalno poznat kao Cronassial mix, iz Abano Terme (Padova, Italija).

3.7. Skraćenica od Gangliosides

Za dodjelu gangliozida primijenjen je sustav kratica koji je 1980. uveo Svenner-holm [20], zajedno s preporukama Komisije za biokemijsku nomenklaturu IUPAC-IUB iz 1998. [21] kako slijedi:

LacCer-Gal 4Glc 1Cer; GM3-II3 - -Neu5Ac-LacCer; GD3-II3 - -(Neu5Ac)2-LacCer; GT3-II3 - -(Neu5Ac)3-LacCer; GM2-II3 - -Neu5Ac-Gg3Cer; GD2-II3 - -(Neu5Ac)2-Gg3Cer; GM1a ili GM1-II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GalNAc-GM1b-IV3 - -Neu5Ac-Gg5Cer; GD1a-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -Neu5Ac-Gg4Cer; GD1b-II3 - -(Neu5Ac)2- Gg4Cer; GT1b-IV3 - -Neu5Ac, II3 - -(Neu5Ac)2-Gg4Cer; GQ1b-IV3 - -(Neu5Ac)2, II3 - - (Neu5Ac)2-Gg4Cer; nLM1 ili 30 -nLM1-IV3 - -Neu5Ac-nLc4Cer; LM1 ili 30 -isoLM1-IV3 - - Neu5Ac-Lc4Cer; nLD1-disialo-nLc4Cer.

3.8. Interpretacija MS podataka

Budući da do danas nije dostupan namjenski računalni softver, baze podataka ili druge IT usluge koje bi pomogle u tumačenju gangliozidnog skrininga i tandemskog masenog spektra, u ovoj studiji otkriveni molekularni ioni dodijeljeni su vrstama gangliozida točnim izračunom mase i na temelju informacija koje smo prethodno stekli o ovoj vrsti glikosfingolipida i poznatim putovima biosinteze. U tumačenju MS i MS/MS podataka i izračunima mase pomogao nam je veliki inventar gangliozidnih molekularnih i iona fragmenata koje smo do danas identificirali i karakterizirali u različitim ljudskim tkivima i tekućinama koristeći napredne MS pristupe. Ove strukture predstavljaju naše izvorne baze podataka, koje su bile uključene u naše prethodno objavljene studije [12,19,22–31]. Nove vrste prijavljene u ovom radu upotpunjuju naš trenutno postojeći zapis gangliozida.

Dodjeljivanje iona oligosaharidne okosnice slijeda generiranih unutar HCD MS/MS slijedilo je općeprihvaćenu nomenklaturu [24,25].

4. Zaključci

U ovoj smo studiji razvili pristup koji se temelji na HR MS i tandem MS za određivanje gangliozida u DKD-u komparativnim testom urinarnih ekstrakata normalnih, mikro- i makroalbuminuričnih pacijenata, kao i zdravih kontrola, provedenih u identičnoj otopini i instrumentalni uvjeti. Konačni cilj našeg istraživanja bio je utvrditi promjene koje se javljaju u sastavu i strukturi bubrežnih gangliozida izraženih u DKD u odnosu na kontrolnu skupinu iu različitim stadijima bolesti.

Visoka osjetljivost, ponovljivost, razlučivost i točnost mase koju pruža MS platforma optimizirana za ovu svrhu omogućila nam je da utvrdimo da se čini da stupanj sijalilacije eksprimiranih vrsta igra važnu ulogu u napredovanju bolesti, predstavljajući marker DKD-a , čak i u stadiju normoalbuminurije pacijenata s DM tipom 2. Dodatno, uočene modifikacije u sastavu Cera pokazuju da se, uz strukturu glikana, lipidni dio također može smatrati molekularnim otiskom za stadije DKD.

U naprednijoj fazi istraživanja, MS/MS by HCD korišten je za strukturnu analizu vrste s mogućom ulogom biomarkera. U slučaju uzorka A3, molekularni ioni, za koje je, prema izračunu mase, utvrđeno da odgovaraju GQ1(d18:1/18:0) i GT1(d18:1/18:{{1 0}}), izolirani su i podvrgnuti fragmentaciji u ćeliji za sudar instrumenta. Cilj ovih eksperimenata bio je prikupiti informacije o detaljnoj strukturnoj konfiguraciji molekule. Optimizirani uvjeti sekvenciranja, posebno raspon energije sudara i tlak plina sudara, inducirali su specifična cijepanja glikozidnih veza, što je rezultiralo stvaranjem fragmentiranih iona detektiranih kao relevantni signali u tandemskom masenom spektru. Nađeno je nekoliko iona kao dijagnostika za određene izomere povezane s lokalizacijom dijelova Neu5Ac u ugljikohidratnom lancu molekule gangliozida. Na temelju ovih strukturno informativnih sekvenci iona, otkrili smo da GQ1d(d18:1/18:0), GT1 (d18:1/18:0) i GT1b(d18:1/18: 0) izomeri prisutni su u uzorku A3 i povezani su s makroalbuminurijom.

Dobiveni rezultati zahtijevaju daljnju potvrdu nekih hipoteza u longitudinalnim studijama provedenim na većim kohortama kako bi se dokazao odnos uzročnosti između složenosti gangliozida otkrivenih u urinubolesnika s DKD-omi vrlo rano zahvaćanje bubrega u tijeku DM tipa 2, čak i u stadiju normoalbuminurije. Međutim, smatramo da sadašnji nalazi otvaraju smjer istraživanja prema istraživanju uloge sijalilacije, O-acetilacije i O-fukozilacije gangliozida, kao i njihovih modifikacija O-GalNAc i CH3COO−, u napredovanju bolesti. Još jedan koristan aspekt ovih rezultata je mogući razvoj postupaka za ranu dijagnozu DKD na temelju profiliranja gangliozida korištenjem napredne masene spektrometrije.

Reference

1. Ghaderian, SB; Beladi-Mousavi, SS Uloga dijabetes melitusa i hipertenzije u kroničnoj bolesti bubrega.J. Ren. inj. Pret.2014, 3, 109–110. [CrossRef] [PubMed] 

2. Johansen, KL; Chertow, GM; Foley, RN; Gilbertson, DT; Herzog, CA; Ishani, A.; Israni, AK; Ku, E.; Tamura, MK; Li, S. Godišnje izvješće o podacima o sustavu bubrežnih podataka SAD-a za 2020.: Epidemiologija bolesti bubrega u Sjedinjenim Državama.Am. J. Kidney Dis.2021, 77, A7–A8. [CrossRef] [PubMed] 

3. Lin, YC; Chang, YH; Yang, SY; Wu, KD; Chu, TS Ažuriranje patofiziologije i liječenja dijabetičke bolesti bubrega.J. Med. Izv.2018, 117, 662–675. [CrossRef] [PubMed] 

4. Vallon, V.; Thomson, SC Bubrežna funkcija u modelima dijabetičkih bolesti: tubularni sustav u patofiziologiji dijabetičkog bubrega.Annu. Rev. Physiol.2012, 74, 351–375. [CrossRef] 

5. Milas, O.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Dumitrascu, V.; Velciov, S.; Gluhovschi, C.; Bob, F.; Popescu, R.; Ursoniu, S.; Jianu, DC; et al. Proupalni citokini povezani su s oštećenjem podocita i disfunkcijom proksimalnih tubula u ranom stadiju dijabetičke bubrežne bolesti u bolesnika s dijabetesom melitusom tipa 2.J. Diab. Komplicirano.2020, 34, 107479. [CrossRef] 

7. Petrica, L.; Ursoniu, S.; Gadalean, F.; Vlad, A.; Gluhovschi, G.; Dumitrascu, V.; Vlad, D.; Gluhovschi, C.; Velciov, S.; Bob, F.; et al. Razine mRNA povezane s podocitima u urinu koreliraju s disfunkcijom proksimalnih tubula u ranoj dijabetičkoj nefropatiji dijabetes melitusa tipa 2.Diabetol. Metab. Sindr.2017, 9, 31–43. [CrossRef] 

7. Kwak, DH; Rho, YI; Kwon, OD; Ahan, SH; Pjesma, JH; Choo, YK; Kim, SJ; Choi, BK; Jung, KY Smanjenje gangliozida GM3 u streptozocinom izazvanim dijabetičkim glomerulima štakora.Life Sci.2003, 72, 1997–2006. [CrossRef] 

8. Masson, E.; Troncy, L.; Ruggiero, D.; Wiernsperger, N.; Lagarde, M.; El Bawab, S. a-serija gangliozida posreduje u učincima krajnjih produkata napredne glikacije na proliferaciju pericita i mezangijskih stanica: uobičajeni posrednik za retinalnu i renalnu mikroangiopatiju?Dijabetes2005, 54, 220–227. [CrossRef] 

10. Zador, Z.; Deshmukh, GD; Kunkel, R.; Radin, NS; Shayman, JA Uloga akumulacije glikosfingolipida u bubrežnoj hipertrofiji dijabetes melitusa izazvanog streptozocinom.J. Clin. Istražite.1993, 91, 797–803. [CrossRef]

10. Ene, CD; Penescu, M.; Angel, A.; Neagu, M.; Budu, V.; Nicolae, I. Praćenje dijabetičke nefropatije pomoću cirkulirajućih gangliozida.J. Immunoass. Immunochem.2016, 37, 68–79. [CrossRef]