Ekstrakt Herba Cistanche poboljšava status mitohondrijskog glutationa i disanje u srcima štakora, uz moguću indukciju razdvajajućih proteina

Uvod

Reperfuzija prethodno ishemijskog miokarda uzrokuje niz mitohondrijskih promjena, uključujući povećanu proizvodnju reaktivnih kisikovih vrsta (ROS), Ca2+preopterećenje i pad proizvodnje adenozin trifosfata (ATP), a sve to može dovesti do nekroze i/ili apoptozom posredovane stanične smrti (Redegeld i sur., 1992; Lemasters i sur., 1998). Kako mitohondriji igraju presudnu ulogu u određivanjuUtvrđujući sudbinu kardiomiocita nakon izazova ishemije/reperfuzije (I/R), zaštita od I/R ozljede miokarda stoga treba biti usmjerena prema očuvanju strukturnog i funkcionalnog integriteta mitohondrija. Održavanje mitohondrijskog energetskog metabolizma nakon I/R izazova posebno je važno jer kontraktilna funkcija srca gotovo u potpunosti ovisi o ATP-u koji stvaraju mitohondrije. Kardiomiociti koji su živi ali se ne kontrahiraju vrlo su malo korisni.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POJAČANJE IMUNITETA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Herba Cistanche, cijela osušena biljka odCistanche deserticolaYC Ma (Orobanchaceae), je parazitska biljka koja raste uglavnom u pustinjskim područjima sjeverne i sjeveroistočne Kine. Herba Cistanche, klasificirana kao biljka koja okrepljuje Yang u kineskoj medicini, propisuje se za nedostatak bubrega, ženski sterilitet i zatvor koji proizlazi iz suhoće crijeva kod senilnih pacijenata (Chen, 1998.). Prethodne studije u našem laboratoriju pokazale su da metanolekstrakt Herba Cistanchepovećava kapacitet stvaranja ATP-a miokarda (Leung & Ko, 2008.) i štiti od I/R ozljede miokarda kod štakora (Leung, 2006.). Dok je stimulacija kapaciteta stvaranja ATP-a bila usporedna s poboljšanjem mitohondrijskog transporta elektrona (Leung & Ko, 2008.), kardioprotekcija od I/R ozljeda koju je omogućio tretman Herba Cistanche bila je povezana sa smanjenjem smanjenja ATP-a u miokardu (Leung, 2006.). U ovoj studiji, kako bismo definirali ulogu mitohondrija u kardioprotektivnom djelovanju Herba Cistanche, istraživali smo učinak tretmana Herba Cistanche na status mitohondrijskog glutationa, sadržaj Ca2+, membranski potencijal i brzinu disanja u srcima štakora .

Materijali i metode

Biljni materijal

Herba Cistanche je kupljena od lokalnog (sa sjedištem u Hong Kongu) trgovca ljekovitim biljem (Lee Hoong Kee). Dobavljač je potvrdio autentičnost biljke, a uzorak vaučera (HKUST00301) pohranjen je na Odjelu za biokemiju Sveučilišta za znanost i tehnologiju u Hong Kongu (HKUST). Provedena je ekstrakcija biljke metanolom na temelju prethodnih studija koje su pokazale da takav ekstrakt pojačava mitohondrijsko stvaranje ATP-a i štiti od I/R ozljeda u srcu štakora (Leung, 2006; Leung & Ko, 2008). Ukratko, Herba Cistanche (400 g) izrezana je na male komadiće i ekstrahirana zagrijavanjem pod refluksom u 300 mL metanola na 60 stupnjeva tijekom 2 sata, kao što je prethodno opisano (Leung & Ko, 2008). Postupak je ponovljen dva puta. Sakupljeni ekstrakt je osušen isparavanjem otapala pod smanjenim tlakom; prinos je bio 42% (w/w) u odnosu na količinu sirove biljke. Ekstrakt je do upotrebe čuvan na 4 stupnja. Iako se kinesko bilje tradicionalno ekstrahira vodom za oralnu konzumaciju, metanol je korišten u našoj ranijoj studiji radi lakše obrade i skladištenja uzoraka (Yim & Ko, 2002.) i ustanovili smo da je ekstrakcija metanolom u svakom pogledu zadovoljavajuća.

Njega životinja i liječenje lijekovima

Odrasle ženke Sprague-Dawley štakora (8-10 tjedana starosti; 200-230 g) bile su smještene u prostoriji s kontroliranom vlagom, s 12-satnim ciklusom tamno/svjetlo, na približno 22 stupnja, a hrana i voda im je bila dopuštena ad libitum. Životinje su nasumično raspoređene u različite skupine, s pet životinja u svakoj skupini. Štakori su primiliEkstrakt Herba Cistancheintragastrično ({{0}}.2 g/mL u vodi) na 0.5g/kg ili 1.0 g/kg 3 uzastopna dana. Kontrolne (netretirane) životinje dobivale su samo vodu. Dvadeset i četiri sata nakon posljednje doze, tkivo srčane klijetke je dobiveno od anesteziranih životinja za biokemijsku analizu. Sve eksperimentalne protokole odobrio je Odbor za istraživačku praksu, HKUST.

Priprema mitohondrijskih frakcija

Mljeveno tkivo srčane klijetke (~{{0}}.6g) je homogenizirano u 10-strukom (w/v) suvišku ledeno hladnog pufera saharoze [0,32 M saharoze, 1 mM etilen diamin tetraoctene kiseline (EDTA), 50 mM Tris/HCl; pH 7,4] pomoću homogenizatora od teflona i stakla, pri 4000 okretaja u minuti, s 25-30 udaraca. Mitohondrijske pelete pripremljene su iz tkivnih homogenata centrifugiranjem na 800 × g na 4 stupnja tijekom 30 minuta, a čistoća je određena mjerenjem relativnih specifičnih aktivnosti sukcinat dehidrogenaze i laktat dehidrogenaze u supernatantu i talogu, kao što je prethodno opisano (Evans, 1992). Mitohondrijske pelete su suspendirane u 1 mL homogenizirajućeg pufera.

Mjerenje mitohondrijske razine reduciranog glutationa i oksidiranog glutationa

Razine mitohondrijskog reduciranog glutationa (GSH) određene su enzimski pomoću 5,59-ditiobis(2- nitrobenzojeve kiseline) (DTNB) i glutation reduktaze (GR), u protokolu modificiranom od Griffitha (198{{17} }). Alikvot (210 µL) mitohondrijske frakcije pomiješan je s 90 µL 10% (v/v) 5-sulfosalicilne kiseline (SSA) i smjesa je centrifugirana na 600 x g 10 min. Za mjerenje razine oksidiranog glutationa (GSSG), količine od 100 µL supernatanta SSA pomiješane su s 10 µL 20% (w/v) 2-vinilpiridina i 10 µL 60% (v/v) trietanolamina u epruvetama za centrifugiranje. Svaka epruveta ostavljena je stajati na sobnoj temperaturi najmanje 1 sat. Reakcijska smjesa koja je sadržavala 0,63 mM DTNB i 0,053 mM NADPH (reducirani nikotinamid adenin dinukleotid fosfat) u fosfatnom puferu (0,1 M, s 5 mM Na2 EDTA; pH 7,5) prethodno je inkubirana na 30 stupnjeva 2 minute. Alikvot (30 µL) ili supernatanta uzorka SSA (ukupni glutation) ili uzorka GSSG dodan je u jažicu mikrotitarske ploče 96-jažica i 180 µL prethodno zagrijane reakcijske smjese, koja sadrži 0,525 U/ mL GR, je zatim dodan. Promjene apsorpcije na 412 nm praćene su spektrofotometrijski tijekom 5 minuta. Koncentracije GSH i GSSG procijenjene su iz kalibracijskih krivulja korištenjem GSH i GSSG [otopljenih u 3% (w/v) SSA] kao standarda i izražene kao nmol/mg proteina. Razine GSH procijenjene su oduzimanjem dvostruke količine GSSG od ukupne količine GSH.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Mjerenje mitohondrijskog Ca2+ sadržaja

Mitohondrijski sadržaj Ca{{0}} mjeren je pomoću Ca2+-osjetljive fluorescentne sonde, Fluo-5N AM estera (Molecular Probes, Eugene, OR) pomoću Victor2 Multi-Label Counter-a (Model 1420; PerkinElmer, Turku, Finska), kako je opisano u Menze et al. (2005). Konstante disocijacije Ca2+ (vrijednosti Kd) određene su pomoću Ca2+ kalibracijskog kompleta važećeg u rasponu koncentracija 1-1000 µM; procijenjene vrijednosti Kd bile su 90-100 µM, s visokom pouzdanošću, prema podacima proizvođača kompleta. Alikvot (25 µL) mitohondrijske frakcije (0,5 mg proteina/mL konačne koncentracije) pomiješan je s 25 µL inkubacijskog pufera {100 mM KCl i 30 mM MOPS [3-(N-morfolino)propansulfonska kiselina]; pH7,2} u 96-crnoj mikrotitarskoj ploči s jažicom. Smjesa je inkubirana na 25 stupnjeva 15 minuta; Zatim je dodano 25 µL digitonina (50 µg/mL) i 25 µL Fluo-5N AM estera (1 µM u 0,005% (w/v) Pluronic F-127). Olakšavanjem prolaska membrane, digitonin je posredovao u mitohondrijskom ulasku fluorescentne boje. Otkrili smo da su razine Fluo-5N u mitohondrijskim pripravcima srca štakora povećane 20-puta u prisutnosti digitonina. Reakcijske smjese su inkubirane na 25 stupnjeva 30 minuta, a očitanja fluorescencije mjerena su na valnoj duljini ekscitacije od 488 nm i valnoj duljini emisije od 532 nm. Mitohondrijski sadržaj Ca2+ procijenjen je pomoću kalibracijske krivulje i izražen kao µmol/mg proteina.

Mjerenje potencijala mitohondrijske membrane

Membranski potencijal (ΔΨm) procijenjen je metodom modificiranom u odnosu na onu Bonavita et al. (2003), koristeći fluorescentnu boju, lipofilnu kationsku sondu 5,596,69- tetrakloro-1,193,39-tetraetilbenzimidazolilkarbocijanin jodid, obično nazvan JC-1. Alikvoti (50 µL) mitohondrijskih frakcija (podešenih na 1 mg proteina/mL) inkubirani su na 37 stupnjeva s 50 µL otopine supstrata (koja sadrži 6 mM piruvata i 6 mM malata), 25 µL prethodno obrađene otopine adenozin difosfata (ADP) (30 mM), i 25 µL 3 µM JC-1, u mraku. Vrijednosti ΔΨm dobivene su mjerenjem fluorescencije na 535 nm (FL1) naspram 580 nm (FL2), korištenjem Victor2 MultiLabel Counter-a. JC-1 stvara nakupine u mitohondrijima, što rezultira visokim vrijednostima fluorescencije FL2 i ukazuje na normalan mitohondrijski potencijal. Gubitak ΔΨm dovodi do smanjenja fluorescencije FL2 (agregati JC-1 u manjoj mjeri) i istodobnog povećanja fluorescencije FL1 (iz monomera JC-1). Podaci su izraženi kao omjeri FL1/FL2 vrijednosti fluorescencije. Karbonil cijanid m-klorfenilhidrazon (CCCP), ΔΨm-kolapsirajući agens, korišten je za validaciju testa.

Mjerenje disanja mitohondrija

Brzina disanja mitohondrija mjerena je na 37 stupnjeva pomoću Hansatech Oxygraph-Plus instrumenta opremljenog Clarkovom elektrodom za kisik (Sarasota, FL, SAD). Mitohondrijske frakcije (0.6mg proteina/mL) suspendirane su u respiratornom puferu koji je sadržavao 125 mM KCl, 20 mM MOPS, 10 mM Tris, 0,5 mM etilen glikol tetraoctene kiseline (EGTA) i 2 mM KH2PO4; pH 7,2. Nakon inkubacije na 37 stupnjeva tijekom 2 minute, svaki uzorak je primio 50 µL otopine supstrata (5 mM piruvata i 5 mM malata). Brzine respiracije mjerene su u prisutnosti (Stanje 3) 1 mM ADP i nakon fosforilacije cijelog ADP-a u ATP (Stanje 4). Omjer stopa respiracije u stanju 3:stanju 4 indeks je respiratorne kontrole, koji ukazuje na čvrstoću sprege između disanja i fosforilacije (Javadov i sur., 2005; Kuwabara i sur., 1997). Prije dodavanja otopine supstrata, brzina disanja u stanju 1 mjerena je do početka respiracije u stanju 2, a stopa respiracije u stanju 2 procijenjena je prije dodavanja ADP-a.

Statistička analiza

Podaci su analizirani jednosmjernom analizom varijance (ANOVA) za usporedbe više skupina. Vrijednosti najmanje značajne razlike (LSD) korištene su za utvrđivanje značajnih razlika između dviju skupina kada su p vrijednosti < 0.05.

PRIRODNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POBOLJŠANJE SEKSUALNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Rezultati

Kao što je prikazano na slikama 1 i 2, obrada metanolomekstrakt Herba Cistanche({{0}}.5 ili 1,0 g/kg/dan × 3) značajno je poboljšao status mitohondrijskog glutationa u srcima štakora, što je dokazano povećanjem razine GSH ovisno o dozi (11-30%) i smanjenjem razine GSSG (31%).

Liječenje Herba Cistanche ovisno o dozi smanjilo je mitohondrijske razine Ca2+ u srcima štakora u usporedbi s kontrolama; supresija je bila 41% pri dozi od 1.0 g/kg (Slika 3).

Tretman Herba Cistanche povećao je mitohondrijski ΔΨm, što je vidljivo smanjenjem (14-16%) u omjeru FL1/FL2. CCCP (100 µM) izazvao je kolaps ΔΨm, kao što je naznačeno povećanjem omjera FL1/FL2 (Slika 4).

Liječenje Herba Cistanchepojačano mitohondrijsko disanje, što je dokazano značajno višom stopom disanja u stanju 3 (84%) kod testnih životinja u usporedbi s kontrolama (Tablica 1). Razina disanja u stanju 2 i stanju 4 povećana je za 47 odnosno 80%, ali stimulacija disanja u stanju 4 bila je potpuno potisnuta 1 mM gvanozin-5'-difosfata, inhibitora razdvajanja proteina 2/3. Tretman Herba Cistanche nije utjecao na indeks respiratorne kontrole, procijenjen omjerom stopa disanja u stanju 3/stanju 4.

Rasprava

Mitohondriji izolirani iz srca štakora tretiranih Herba Cistancheom pokazali su poboljšani status glutationa, na što ukazuju povećane razine GSH i smanjene razine GSSG. Održavanje redoks statusa mitohondrijskog glutationa ključno je za kardioprotekciju od I/R ozljeda (Chiu & Ko, 2003). Sadržaj Ca2+ u citosolu povećava se tijekom ishemije miokarda, putem unosa Ca2+ uniportera unutarnje membrane (Ataka i sur., 1992.; Grover i sur., 1990.), što dovodi do mitohondrijskog Ca{{6} } akumulacija. Naši rezultati pokazuju da je tretman s ekstraktom Herba Cistanche poboljšao redoks status mitohondrijskog glutationa i smanjio mitohondrijsku razinu Ca2+, što može pružiti zaštitu od I/R ozljede miokarda (Leung, 2006.). Nemogućnost tretmana Herba Cistanche, pri višoj dozi od 1,0 g/kg, da dodatno smanji razine GSSG i Ca2+, može biti povezana s postojanjem samoograničavajućeg regulatornog mehanizma koji utječe na redoks potencijal glutationa i status kalcija u mitohondrijima.

Mitohondriji generiraju elektrokemijski gradijent protona preko unutarnje membrane, prijenosom elektrona. Ovaj gradijent koristi ATP sintaza za fosforilaciju ADP u ATP. Smanjeni potencijal mitohondrijske membrane, kao kod hipoksije/reoksigenacije nakon ozljede uzgojenih kardiomiocita (Chiu et al., 2008), rezultira smanjenjem stvaranja ATP-a. Liječenje Herba Cistanche, koje može povećati potencijal mitohondrijske membrane miokarda, vjerojatno pojačava stvaranje ATP-a, osobito tijekom postishemične reperfuzije. Opet, postojanje samoograničavajućeg regulatornog mehanizma može objasniti zašto učinci liječenja Herba Cistanche na potencijal mitohondrijske membrane ne ovise o dozi.

Tretman Herba Cistanche uvelike je povećao brzinu disanja u stanju 3 u mitohondrijima srca štakora, što je procijenjeno potrošnjom kisika. Ovo je otkriće u skladu s rezultatima dobivenim in vitro i situ mjerenjima mitohondrijskog kapaciteta stvaranja ATP-a (Leung & Ko, 2008.). Intrigantno, iako je tretman Herba Cistanche smanjio razinu ravnotežnog stanja miokardijalnog ATP-a (podaci nisu prikazani), tretman je povećao stvaranje mitohondrijskog ATP-a. Uključenost nespojenog disanja može objasniti ova proturječna opažanja. Nevezana oksidativna fosforilacija događa se kada se protoni pomiču kroz unutarnju membranu mitohondrija natrag u matriks mitohondrija, čime se raspršuje membranski potencijal koji stvara lanac prijenosa elektrona. To rezultira smanjenjem pokretačke sile protona koja pokreće stvaranje ATP-a (Garvey, 2003.). Kao posljedica toga, koncentracija Ca2+ i proizvodnja ROS-a u mitohondrijima dramatično su oslabljeni (Teshima et al., 2003.). Ovaj prijedlog je u skladu s rezultatima ove studije, koja je pokazala smanjenje mitohondrijskih razina Ca2+ u srcima tretiranim Herba Cistanche. Što se tiče nespojenog disanja, sinteza nespojenih proteina (UCP) može biti potaknuta liječenjem Herba Cistanche. Poznato je da UCP razdvajaju oksidativnu fosforilaciju, a ekspresija UCP1 u srcima transgenih miševa štiti od I/R-induciranog oštećenja miokarda (Hoerter et al., 2004). Učinak razdvajanja UCP-a bio je inhibiran difosfatima i trifosfatima purinskog nukleotida (kao što su ADP, ATP, gvanozin difosfat (GDP) i GTP) (Echtay et al., 2002.). U ovoj studiji, mitohondrijski parametri kao što su membranski potencijal i brzina disanja mjereni su u prisutnosti ADP (kao supstrata); razdvojni učinak UCP-a je stoga inhibiran. Međutim, kada je stopa respiracije mitohondrijskog stanja 4 mjerena u odsutnosti ADP-a, ta je stopa bila viša u mitohondrijima pripremljenim iz srca tretiranih Herba Cistancheom nego u srcima netretiranih kontrola. Stopa respiracije u stanju 4 odražava potrošnju kisika u mitohondrijima kada protoni iscure natrag u matriks mitohondrija putem mehanizma koji ne uključuje F1 F0 -ATPazu (Garvey, 2003.). Moguća uključenost UCP-a u povećanje respiracije stanja 4 izazvano Herba Cistanche potkrijepljena je nalazom da je ovo poboljšanje potisnuto BDP-om (Bento et al., 2007.).

Zaključno, liječenje Herba Cistancheom može poboljšati status mitohondrijskog glutationa, smanjiti mitohondrijsku razinu Ca2+ i povećati potencijal mitohondrijske membrane i brzinu disanja u srcima štakora. Poboljšanje statusa mitohondrijskog glutationa i funkcionalne sposobnosti, te navodna indukcija UCP-a, mogu biti povezani s kardioprotekcijom koju osiguravaLiječenje Herba Cistanchenakon I/R ozljede.

PRIRODNI EKSTRAKT BILJKE CISTANCHE TUBULOSA PHGS75% ECH 30% ACT 12%