Gossipitrin, prirodni flavonoid, prigušuje neuronsko i mitohondrijsko oštećenje izazvano željezom 1. dio

Obratite seoscar.xiao@wecistanche.comza više informacija

Sažetak:Poremećaj homeostaze željeza važan je čimbenik u gubitku mitohondrijske funkcije u neuronskim stanicama, što dovodi do neurodegeneracije. Ovdje smo procijenili zaštitno djelovanje gossypitrina(Gos), prirodnog flavonoida, na oštećenje neuronskih stanica izazvanih željezom pomoću mišjih hipokampalnih STANICA HT-22 i mitohondrija izoliranih iz štakorskog mozga. Gos je uspio spasiti HT22 stanice od oštećenja izazvanog 100 uM Fe()citrat (EC50 8.6 uM). Ta je zaštita bila povezana s prevencijom odtapanja potencijala mitohondrijske membrane izazvanog željezom i iscrpljivanja ATP-a. U izoliranim mitohondrijama Gos (50uM) je izazvao gotovo potpunu zaštitu od mitohondrijske otekline izazvane željezom, gubitka mitohondrijske transmembranske potencijale i iscrpljivanja ATP-a. Gos je također spriječio Fe(II.)-citrat-induciranu mitohondrijsku lipidnu peroksidaciju s ICs0 vrijednošću (12,45 μM) koja je bila oko devet puta niža od one za tert-butil hidroperoksid izazvanuoksidacija. Nadalje, flavonoid je bio učinkovit u inhibiranju razgradnje 2-deoksiriboze od 15 i 1,5 mM. Također je s vremenom smanjio koncentraciju Fe(II), istovremeno povećavajući stopu potrošnje O2 i narušavajući smanjenje Fe(II) askorbatom. Gos-Fe(I) kompleksi otkriveni su UV-VIS i IR spektroskopijama, s prividnom Gos-iron stoihiometrijom 2:1. Rezultati sugeriraju da Gos općenito ne djeluje kao klasični antioksidans, ali izravno utječe na željezo, održavajući ga u željeznom obliku nakon poticanja Fe(II) oksidacije. Metalni ioni stoga ne bi mogli sudjelovati u reakciji fentonskog tipa i fazi širenja lipidne peroksidacije. Stoga se Gos može koristiti za liječenje neuronskih bolesti povezanih s oksidativnim stresom izazvanim željezom i mitohondrijskim oštećenjem.

Kliknite ovdje da biste saznali više

Ključne riječi: gossypitrin; željezo; HT-22 ćelije; mitohondrije;neurodegeneracija; neurozaštita

1. Uvod

Željezo je bitan kofaktor u mnogim ključnim biološkim procesima kao što su sinteza i obnova DNA, transport kisika, stanično disanje, ksenobitički metabolizam i sinteza hormona [1. Međutim, na visokim unutarstaničnim razinama može povećati stanične reaktivne vrste kisika s modifikacijom staničnih redoks potencijala [2,3]. Željezna dishomeostaza uočena je u gotovo svakom neurološkom stanju kao što su Parkinsonova bolest (PD), Alzheimerova bolest (AD), Huntingtonova bolest (HD), multipla skleroza, Friedreichova ataksija, epilepsija, sindrom nemirnih nogu i moždani udar [4,5]. Osobito, u intracerebrralnom krvarenju, gdje dolazi do rupture mikrovaskulatura, a oslobođena krv proizvodi izloženost živčanih stanica željezom izvedenom iz krvi, glavni mehanizmi neurodegeneracije su proizvodnja ROS-a izazvana željezom i hemom, upala i ekscitotoksičnost [6,7]. In vitro i in vivo eksperimentalni modeli krvarenja u mozgu pokazali su prisutnost feroptoze, oblika regulirane nekroze ovisnog o željezu [8]. Nadalje, sve veći dokazi upućuju na to da je poremećaj homeostaze željeza neophodan u gubitku mitohondrijske funkcije u neuronskim stanicama [9,10], što bi pak moglo dovesti do neurodegeneracije [11-14. Nedavno je zabilježena veza između ranog početka parkinsonove bolesti s disregulacijom metabolizma željeza i mitohondrijskih oštećenja [15]. Suživot relativno visokih količina željeza i ROS-a u mitohondrijskim odjeljcima čini ovu organelu osjetljivom na hidroksil radikalno posredovana oštećenja. Farmakološki agensi usmjereni na regulaciju moždanog željeza i mitohondrijsko oštećenje posredovano željezom stoga mogu biti terapijski korisni protiv neurodegeneracije. Utvrđeno je da nekoliko sredstava za keliranje željeza pokazuje neuroprotektivna djelovanja u različitim eksperimentalnim modelima [16-19]. S druge strane, bilo je mnogo izvješća o neurozaštitničkom potencijalu prirodnih polifenola zbog njihovih antioksidativnih djelovanja temeljenih na kombinaciji kelacije željeza i aktivnosti čišćenja slobodnih radikala [20,21]. Naša je skupina primijetila da polifenoli koji sadrže katehol poput mangiferina, guttiferona-A i rapanona djeluju s željezom, in vitro i in vivo, poništavajući tako svoju katalitičku ulogu u promicanju ROS [22-28]. Također smo nedavno izvijestili o snažnim antioksidativnim učincima gossypitrina(Gos), prirodnog flavonoida (slika 1), što ukazuje na njegovu potencijalnu uporabu kao neuroprotektivnog sredstva [29]. Ipak, malo se zna o mehanizmima uključenim u ove antioksidativne učinke. Prisutnost planarnog šesteročlanog cikličkog sustava s elektronskom delokalizacijom, moiety katehola i još tri aromatične hidroksilne skupine (od kojih su dvije uz karbonilnu skupinu), snažno sugeriraju da bi ova molekula mogla djelovati kao sredstvo za keliranje željeza jer su to strukturne značajke koje pogoduju kelaciji željeza flavonoidima 30]. Stoga je svrha ovog istraživanja procijeniti sposobnost Gosa da zaštiti HT-22neuronske stanicei izolirane mitohondrije mozga štakora iz željeza posredovanih željezomoksidativna oštećenja. Provedene su i druge studije u sustavima bez stanica/mitohondrija kako bi se dodatno okarakterizirala priroda Interakcije Gos-željezo.

2. Rezultati

2.1. Gos spašava stanice HT-22 od smrti stanica izazvanih Fe(I)-induciranim

Fe(II)(100 μM) smanjila je preživljenje STANICA HT-22 na 17,4% nakon 24 sata izloženosti, prema procjeni MTT testa. Gos je spriječio smrt hipokampalnih stanica na način ovisan o dozi. EC50 je iznosio 8,64± 1,58 μM (slika 2A, umetnuto). Potpuna zaštita stanica uočena je sa 100 μM Gos je bila učinkovitija od Troloxa(500 uM), poznatog hidrotopivnog antioksidansa, koji je spriječio staničnu smrt za 74%.

Izlaganje HT-22 željezu za 2 h (prije izvršenja stanične smrti) izazvalo je rasipanje potencijala mitohondrijske membrane, kako je procijenjeno zadržavanjem rodamina 123 unutar organela (slika 2B) i iscrpljivanjem ATP-a (slika 2C). To sugerira moguću povezanost između toksičnih učinaka posredovanih željezom na mitohondrije i održivosti stanica. Gos je spriječio oštećenje mitohondrija ovisno o dozi uzrokovano željezom, slijedeći obrasce održivosti neurona koji su pokazali da može spriječiti smrt stanica HT-22 izazvanu željezom mitohondrijskom zaštitom.

Slika 2.Ide zaštita od oštećenja neuronskih stanica izazvanih željezom. Učinci Gosa na preživljavanje hipokampalnih neurona dna dna miša HT-22 (A), potencijal stanične mitohondrijske membrane (B) i stanične atp razine (C). Gos(0-100 μM) ili Trolox(500 μM) su-inkubirani za 24 h (održivost) ili 2h (potencijal mitohondrijske membrane i ATP razine) sa 100 μM FeCl2/1 mM citrat. Uvjeti analize opisani su u odjeljku 4. Oštećene kontrolne ćelije (bez Gosa) sadržavale su DMSO (0,001%), plus smjesu željeza i citrata. Rezultati se izražavaju kao postotak smrti stanica u odnosu na neoštećenu kontrolu (koja kao vozilo sadrži DMSO0,001%). Vrijednosti su sredstvo ± S.D. tri različita eksperimenta. Različiti simboli ukazuju na statističke razlike pri p<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Cistanche može poboljšati imunitet

2.2. Gos spašava mitohondrije štakora i mozga iz mitohondrijske litohondrijske litohondije izazvane željezom Mitohondrije mozga inkubirane Fe()-citratom (50 μM) podvrgnute su izraženoj lipoperoksidaciji izraženoj povećanjem stvaranja reaktivne tvari tiobarbiturne kiseline (slika 3A). Gos je inhibirao mitohondrijske lipidne peroksidacije posredovane željezom na način ovisan o koncentraciji (vrijednost IC50 od 12,45±1,24 μM) (slika 3A, umetak). Učinci Gosa na mitohondrijski lipid peroksid (300 μM) izazvan tirt-butil hidroperoksidom (IC50 vrijednost>100 μM) pokazuju da je učinkovitiji u sprječavanju lipidne peroksidacije izazvane željezom od peroksidacije lipida izazvane peroksidijom peroksidacijom peroksida induciranog peroksidom peroksidacijom peroksidacijom peroksida induciranog peroksidom peroksidacijom peroksida peroksidacijom peroksidacijom peroksida izazvanog peroksidom peroksidacijom peroksida induciranog peroksidijom peroksidacijom peroksida induciranog peroksidijom peroksidacijom peroksidacijom peroksida induciranog peroksidacijom peroksida (IC50>100 μM) pokazuju da je učinkovitija u sprječavanju lipidne peroksidacije izazvane željezom od peroksidacije lipida izazvane peroksidijom peroksidacijom peroksidacijom peroksida izazvanom peroksidijom peroksidacijom

Slika 3. Gos inhibira stvaranje malondialdehida u mitohondrijama, izazvanih 50 uM Fe()-citrat(A)ili 300μM tert-butil hidroperoksid(B). Ratbrain mitohondrije(1 mg/mL)inkubirane su u reakcijskom mediju koji sadrži saharozu od 125 mM,65 mM KCl,10mM HEPES pufer (pH 7,4), 2 mM sukminat i 2,5 uM rotenona, sa ili bez Gosa (1-50 uM). Eksperimenti su započeli dodavanjem 50μM Fe(II) ili 300 μM tert-butil hidroperoksida, osim neoštećene Kontrole (sive šipke). Razdoblje inkubacije bilo je 20 min na 28°CC. Vrijednosti su sredstvo ±S.D. (n=6). Različiti simboli ukazuju na statističke razlike pri p<0.05 when="" comparing="" all="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" posthoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.3.Gos sprječava mitohondrijsko rasipanje mitohondrijskih oteklina posredovanih željezom i iscrpljivanje ATP-a

Slika 4A pokazuje da je 50μM Fe(I)-citrat kompleksno inducirano mitohondrijsko oticanje izraženo smanjenjem apsorbancije na 540nm (linija f u odnosu na liniju a). Bio je povezan sa spontanom i potpunom depolarizacijom △Y (slika 4B, linef naspram retka a) i iscrpljivanjem ATP-a (slika 4C, Fe()/citratni stupac). Gos je inhibirao proces oticanja izazvan željezom i rasipanje AY-a na način ovisan o koncentraciji (slika 4A, B linije b-e). Vrijednosti apsorbancije (srednja vrijednost ± SD na 7 min) s ploče A bile su: 0,482±0,013 (redak a), 0,459± 0,011 (redak b),0,445± 0,007 (redak c),0,435± 0,015(redak d), 0,360±0,011(redak e) i 0,338±0.012(redak f). Vrijednosti fluorescencije s ploče B(srednja vrijednost ± SD pri 7 min) iznosile su 15,03±1,71 (linija a),19,41±2,07 (redak b),22,29±2,58 (redak c),45.505±4.47(linija d), 118.468±5.76 (linija e) i 146.201±5.83 (linija f). Statistički značajne razlike utvrđene su između linije f i ostalih linija, pri p<0.05. the="" naturally="" occurring="" flavonoids="" also="" prevented="" iron-mediated="" atp="" depletion="" in="" a="" concentration-dependent="" manner(figure="" 4c).="" a="" strong="" interaction="" of="" gos="" with="" iron="" is="" suggested="" as="" the="" key="" mechanism="" for="" neuroprotection="" against="" iron-induced="" damage,="" both="" in="" ht-22="" neuronal="" cells="" and="" in="" brain="" mitochondria.="" to="" further="" characterize="" this="" gos-iron="" interaction,="" different="" experiments="" on="" a="" cell/mitochondria-free="" system="" were="">

Slika 4. (A) Indukcija prijelaza mitohondrijske propusnosti, gubitak (B)mitohondrijske membrane (AH) i (C) smanjenje razine ATP-a izazvano 50 μM Fe(II)-citratom. A je procijenjeno pomoću fluorescencijske sonde safranine (5 uM). Inhibitorni učinci Gos 50,25, 10 i 1μM prikazani su u linijama (b),(c), (d) i (e). Linije (a) i(f)predstavljaju neoštećene kontrole (bez željeza) i oštećene kontrole (bez Gosa). Dodani su mitohondrije štakorskog mozga (RBM-0,5 mg/mL), Fe(II) i μM CCCP gdje su označene strelicama. Različiti simboli na grafikonu(C)označavaju statističke razlike atp<0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.(if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

2.4. Gos inducira fe(II)-citratnu autoksidaciju i O, potrošnja

Gos je smanjio fe() koncentraciju (1-min predinkubaciju) u reakcijskom mediju koji sadrži 2 mM citrata (bez mitohondrija) na način ovisan o dozi (slika 5A, crni krugovi). Razdoblje predincubacije od 5 minuta (slika5A, crvene kutije)još je više smanjilo koncentraciju Fe(II). Gos je također povećao stopu potrošnje O2, vjerojatno zbog oksidacije Fe(ll) na Fe(II.II)(slika 5B,C). Ovi rezultati sugeriraju da bi Gos mogao ukloniti Fe(II) iz citratnog kompleksa i oksidirati ga u željezni oblik u procesu koji zahtijeva O2 kao akceptor elektrona. U skladu s tim, Gos bi mogao ometati stvaranje "OH radikala inaktiviranjem Fe(Il) potrebnih za reakciju tipa Fenton-Haber-Weiss, koja može pokrenuti lipidnu peroksidaciju mitohondrijske membrane.

Slika 5. (A) Gos stimulira Fe(III.l) autoksidaciju u nedostatku mitohondrija mozga štakora u standardnom mediju dopunjenom s 1 mM citratom, a 5 mM1,10-fenantrolin.1,10-fenantrolin dodan je 1 ili 5 minuta nakon razdoblja inkubacije Gos-Fe(II), a apsorbancije su pročitane na 510nm. Vrijednosti su prosjek od tri određivanja. * statistička razlika na p<0.05 when="" comparing="" 1="" vs.="" 5min="" incubation.="" (b)effects="" of="" gos="" on="" o,="" consumption="" mediated="" fe(il)="" autoxidation="" in="" a="" standard="" medium="" supplemented="" with="" 1="" mm="" citrate="" under="" the="" following="" conditions:(a)="" no="" gos,(b)10="" um="" gos，="" （c）="" 30μm="" gos，="" （d）50="" μm="" gos，and="" （e）100μm="" gos.="" fe（ii）="" （50μm）="" was="" added="" where="" indicated="" by="" the="" arrow.="" results="" are="" representative="" of="" three="" experiments.="" (c)="" oxygen="" consumption="" rate="" (nmol="" o2/min/ml)1="" min="" after="" fe()="" addition.legends="" are="" the="" same="" as="" in(b).="" different="" symbols="" indicate="" statistical="" differences="" at=""><0.05 when="" comparing="" all="" pairs="" of="" experimental="" groups="" (in="" the="" same="" cell="" type)="" according="" to="" the="" anova="" and="" post="" hoc="" newman-keuls="" tests.="" (if="" the="" symbols="" are="" different="" among="" groups="" indicate="" statistical="" differences,="" when="" they="" are="" equal,="" there="" is="">

Ovaj je članak izvađen iz molekula 2021, 26, 3364. https://doi.org/10.3390/molecules26113364 https://www.mdpi.com/journal/molecules