Obrazac ekspresije -tubulina, inversina i njegovog ciljnog raščupanja-1 i morfologija primarnih cilija u normalnom razvoju i bolestima ljudskih bubrega

edmund.chen@wecistanche.com

Sažetak:Prostorno-vremenska ekspresija -tubulina, inverzije i razbarušenih-1 (DVL-1) proteina povezanih s Wnt-signalnim putem i primarna morfologija cilija analizirani su u razvojububrega(14.–38. tjedana razvoja), zdravo postnatalno (1.5- i 7-godina) i patološki promijenjeno ljudskobubrezi,uključujući multicističnu displastičnububrega(MCDK), žarišnu segmentalnu glomerulosklerozu (FSGS) i nefrotski sindrom finskog tipa (CNF). Analiza je provedena dvostrukom imunofluorescencijom, elektronskom mikroskopijom, semikvantitativnom i statističkom metodom. Citoplazmatska koekspresija -tubulina, inverzija i DVL-1 primijećena je u proksimalnim uvijenim tubulima (pct), distalnim uvijenim tubulima (dct) i glomerulima (g) analiziranih tkiva. Tijekombubregrazvoja, ukupna ekspresija -tubulina, inverzije i DVL-1smanjena, dok se u postnatalnom razdoblju blago povećala. Najveća ekspresija -tubulina i inverzije karakterizira dct i g, dok visoka DVL-1 karakterizira pct. - obrasci ekspresije tubulina, inverzije i DVL-1 u MCDK, FSGS i CNFbubregaznačajno razlikovao od zdrave kontrole. U usporedbi sa zdravimbubrega, patološki promijenjenbubregaimao dismorfne primarne cilije. Različita dinamika ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 tijekombubregRazvoj bi mogao ukazivati ​​na to da je prebacivanje između kanonske i nekanonske Wnt-signalizacije bitno za normalnobubregmorfogeneza. Nasuprot tome, njihovo poremećeno izražavanje u patološkimbubregamože biti povezan s abnormalnim primarnim trepetljikama, što dovodi do kroničnogbolesti bubrega.

Ključne riječi:ljudski razvoj bubrega; -tubulin; inverzin; DVL-1; MCDK; FSGS; CNF; bubreg, bubrežni

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI

Uvod 

Razvoj definitivne ili metanefričkebubregapočinje tijekom petog gestacijskog tjedna (GW), koji se zatim kontinuirano diferencira kako bi se formirali trajni bubrezi [1,2]. Signalne interakcije između metanefričkog mezenhima i pupoljka uretera osiguravaju pravilnobubregrazvoj tijekom nefrogeneze. Ukratko, ureteralni pupoljak inducira prijelaz mezenhima u epitel (MET) u metanefričkom mezenhimu, koji se kondenzira i formirabubrežnivezikule, nakon čega slijede tjelešca u obliku zareza i S-oblika, i konačno dovode do stvaranja glomerula [3]. Zauzvrat, mezenhim izaziva daljnje grananje pupoljka uretera. Metanefrični bubrezi postaju funkcionalne jedinice za izlučivanje u 11. tjednu ljudskog razvoja. Međutim, nefrogeneza je dovršena unutar 34. do 36. tjedna fetalnog razvoja, kada su završena višestruka grananja, ali se daljnji proces diferencijacije bubrega nastavlja u postnatalnom razdoblju [4,5]. Poremećaji ovih složenih interakcija rezultiraju različitim kongenitalnim abnormalnostima bubrega i mokraćnog trakta (CAKUT), uključujući displaziju, policističnu bubrežnu bolest, multicističnu displastičnubolest bubrega(MCDK), što posljedično dovodi do kroničnogbolest bubrega(CKD) [6].

U ovoj studiji bili smo usredotočeni na primarni izgled trepetljika i Wnt-signalni put, koji igra važnu ulogu tijekom normalne nefrogeneze i ububregproces popravka, nakon akutnog ili kroničnogbolest bubrega[7]. Postojanje primarnih cilija tijekom nefrogeneze i veliki broj razvojnihbubregdefekti koji se javljaju u pacijenata s cilijarnom bolešću ukazuju na to da je prava primarna funkcija cilija neophodna za normalnobubregorganogeneza [8,9]. Primarni cilij je mikrotubulna organela važna za homeostazu tkiva, gdje je -tubulin osnovna komponenta [10]. Gubitak acetilacije -tubulina u besmrtnim stanicama pokreće prijelaz epitela u mezenhim (EMT), što implicira da je acetilirani -tubulin važan u stabilizaciji mikrotubula [11]. Tijekom ljudskog razvoja, primarni Wnt put posredovan cilijama omogućuje staničnu proliferaciju, diferencijaciju i morfogenezu tkiva [12]. Značajan broj djece s oslabljenom funkcijom primarne cilije i poremećenim Wnt-signalnim putem razvija KBB, gdje je kongenitalnabubrežniporemećaji su odgovorni za gotovo polovicu slučajeva [13]. Najčešća kongenitalna cistična bolest u djece je multicistična displastikabolest bubrega(MCDK) [14]. Višestruke ciste koje ne komuniciraju [15] i nemaju normalububrežniparenhima su karakteristični mikroskopski nalazi za MCDK. Fokalna segmentalna glomeruloskleroza (FSGS) jedna je od najčešćih glomerularnih bolesti koje dovode do terminalnog stadijabolest bubrega[16]. U početku je FSGS karakterističan kao žarišni, koji zahvaća samo manji dio glomerula i segmentalni, koji uključuje promjene samo u segmentu glomerularnog kruga [17]. Kongenitalni nefrotski sindrom finskog tipa (CNF) rijedak je autosomno recesivno naslijeđenbolest bubregapredstavljena prenatalnim izbijanjem opsežnog gubitka proteina [18], povezanog s cistogenezom proksimalnih tubula [19]. Mnogi oblici primarnih glomerularnih bolesti razvijaju proteinuriju kao rezultat oštećenja glomerularne filtracijske barijere [20]. Značajan broj studija ukazuje na to da ozljeda i disfunkcija podocita imaju intrinzičnu ulogu u patogenezi KBB proteinurije [21]. Studija Vukojevića i sur. pokazuje povećani broj trepljastih i slabo diferenciranih podocita u CNF [22]. Prethodne studije pokazale su da Wnt/-katenin signalni put ima temeljnu ulogu u moderiranju disfunkcije podocita s proteinurijom [23]. Postoje dva glavna Wnt-signalna puta, jedan poznat kao kanonski ovisan o -kateninu, a drugi nekanonski neovisan o -kateninu. Tijekom mišabubregrazvoja, kanonska Wnt-signalizacija aktivna je na vrhovima pupoljaka uretera iu tijelima u obliku slova S [24]. Nadalje, Wnt putem kanonske signalizacije ima važnost u održavanju MET-a tijekom nefrogeneze [25]. Naime, vezanje proteinskog kompleksa koji sadrži Dvl na membranski receptor obavezno je za aktivaciju Wnt puta, dok onesposobljavanje ključnih komponenti ovog puta rezultira ranom perinatalnom smrtnošću zbog nepostojanja nefrogene zone ububreg[25]. 

Utvrđeno je da je protein ključan kao molekularni prekidač između kanonskih i nekanonskih Wnt signalnih putova inverzija [26]. Iako su otkrivene interakcije različitih proteina s inverzijom, njezina točna funkcija još nije u potpunosti razjašnjena. ububrežniepitelnih stanica, inverzija se nalazi u primarnim cilijama, djelujući kao cilijarni protein [27]. Osim toga, inverzija tvori stabilan kompleks s tubulinom u kulturamabubrežnistanice, te se kolokaliziraju in vivo [27,28]. Čini se da inverzija igra ključnu ulogu u ranoj morfogenezi pronefričkog sustava i određivanju lijevo-desne simetrije tijekom razvoja [29,30]. Značajan događaj i za kanonske i za nekanonske Wnt-signalne putove u regrutiranju citoplazmatskog Dvl na staničnu membranu. Budući da su prethodna otkrića pokazala da se inverzija i Dvl kolokaliziraju u epitelnim stanicama bubrega, može se nagađati da bi inverzija također mogla imati ulogu u nekanonskoj signalizaciji. Disregulacija Wnt-signalizacije posredovana inverzijom izaziva nenormalnu proliferaciju u tubulima [31]. Genetski testovi otkrili su mutaciju DVL-1 u bolesnika s autosomno-dominantnim Robinowovim sindromom, predstavljajući heterogene poremećaje u nekih bolesnika povezanih s urogenitalnim ibubrežnianomalije [32].

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNU/BUBREŽNU DIJALIZU

Razvojni obrazac ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 istražen je na različitim životinjskim modelima. Tako je njihova ekspresija u pronefrosima Xenopus laevis potvrđena intravitalnom mikroskopijom [31], dok su konfokalnom mikroskopijom i masenom spektrometrijom pronađeni u staničnim linijama izvedenim iz mišjih proksimalnih tubularnih stanica [33]. Osim toga, svjetlosna mikroskopija i dvostruka imunofluorescencija otkrile su njihovu prisutnost u dijelovima miševabubrega[34]. Studije na miševima s inverznim nokautom izvijestile su o povećanim, difuznim cistama ububrežnimedula i korteks povezani sa situs visceralnom inverzijom [35]. U ljudi je mutacija inverzije bila predstavljena infantilnom nefronoftizom koja je dovela do prekida trudnoće [36]. Unatoč brojnim studijama obubrežni-tubulin, inverzija i DVL-1 obrazac ekspresije i funkcija, prema našim saznanjima, ekspresija ovih proteina u ljudskom fetalnom i postnatalnom ljudskom tkivu još nije istražena i dovedena u korelaciju. Osim toga, nije bilo prijavljenih dokaza koji bi razmatrali izraženost inverzije i DVL-1 u ranom ljudskom razvoju. Stoga je ova studija imala za cilj analizirati prostorni i vremenski obrazac ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 tijekom fetalne i postnatalne faze zdravih ljudibubrega, kao i ububregtkiva MCDK, FSGS i CNFbubregakako bi se utvrdila moguća karika koja nedostaje između tih entiteta. Naime, predlažemo da bi poremećeni obrasci ekspresije -tubulina, inverzije i DVL-1 proteina mogli biti temeljni proces cistogeneze i abnormalna funkcija primarnih cilija koja dovodi do kroničnogbolesti bubrega. 

Rezultati

Analiza razvojnog i postnatalnogbubregtkiva izvedena je na izrazito diferenciranim strukturamabubreg:proksimalne zavijene tubule (pct), distalne zavijene tubule (dct) i glomerule (g). Tijekom analiziranih razvojnih faza i u postnatalnombubregtkiva, -tubulin, inverzija i DVL-1 pokazali su pozitivne obrasce ekspresije, ali s razlikama u intenzitetu, distribuciji i količini. Analiza patološkogtkivo bubregaMCDK, FSGS i CNF provedeno je na punom broju slika pozitivnih stanica u usporedbi s kontrolom zdravog bubrežnog tkiva.

2.1. Svjetlosna mikroskopija, elektronska mikroskopija i imunohistokemija (-Tubulin) zdravog i patološki promijenjenog postnatalnog tkiva ljudskog bubrega

2.1.1. Zdravo postnatalno svjetlo bubrega

mikroskopija postnatalnogbubregtkivo pokazuje dobro definiranebubregstrukture, s jasnom razlikom između medule i korteksa i formiranjem pct, dct i g u kortikalnoj regiji. Imunohistokemijsko bojenje -tubulina otkriva prisutnost jedne primarne resice u središtu apikalne stanične površine svake tubularne stanice i u 0.018 posto ± 0,00014 posto SD na površini glomerularnih stanica. Elektronska mikroskopija pokazuje prisutnost samo jedne primarne resice koja proizlazi iz bazalnog tijela na površini apikalne stanice tubula (Slika 1a).

2.1.2. CNF

Većina analiziranih g je manja i lobulirana (80 posto), dok je manjina normalne veličine ili hipertrofična (20 posto, n=100). Nađe se segmentna ili globalna skleroza g, dok su pct i dct djelomično prošireni i obloženi atrofičnim epitelom. Ultrastrukturno se uočava gubitak mikrovila i smanjenje visine stanica s multifragmentacijom jezgri. U podocitima, nožni procesi su difuzno izgubljeni. Tubularne primarne trepetljike su neorganizirane, osobito u cistama proksimalnih tubula, pokazujući promjene u duljini i citoplazmatskom položaju (Slika 1b).

2.1.3. MCDK

U bubrežnom tkivu mogu se naći sporadični nezreli i zreli g.Bubregtkivo je ispunjeno brojnim ovalnim cistama. Stanice stupastog epitela prekrivaju ciste i okružene su rastresitim vezivnim tkivom. Imunohistokemijsko bojenje na -tubulin pokazuje više dugih i neorganiziranih primarnih cilija na površini epitelnih stanica (Slika 1c).

2.1.4. FSGS

U 90 posto g nalazi se opsežna segmentna skleroza (n=100), povezana s intersticijskom fibrozom i znakovima tubularnog oštećenja. U elektronskom mikroskopu nalazi se smanjenje visine epitelnih stanica uz gubitak mikrovila, dok endotelne stanice i mezangijske regije imaju pravilnu ultrastrukturu. U elektronskom mikroskopu se na površini distalne tubularne stanice uočava izuzetno duga i dislocirana (decentralizirana) resica (Slika 1e). Podociti pokazuju difuzni gubitak nožnih nastavaka s opsežnim tkivom mikrovilusa. Imunohistokemijsko bojenje na a-tubulin pokazuje više dugih i neorganiziranih primarnih cilija na površini epitelnih stanica (Slika 1c).

2.2. Imunohistokemijsko bojenje na 心tubulin, inverziju i DVL-1- i statistička analiza razvijenih i zdravih postnatalnih ljudskih bubrega

U 14., 15. i 16. gestacijskom tjednu dolazi dobubregtkivo je prikazano s različitim razvojnim stupnjevima formiranja nefrona: od metanefričkih čašica,bubrežnimjehurićima stadijima upravljaju nefronima u obliku slova S, tvoreći tako nefrogenu zonu u vanjskom korteksu (Slika 2). Razlikovanje pct, dct i g može se uočiti u kortikalnim regijama bližebubregmedula. Tijekom 22. GW dijelovi medule i korteksa postali su jasno prepoznatljivi, dok su u 38. GW,bubregstrukture se pojavljuju kao visoko diferencirane, sadrže zrele oblike pct, dct i g

2.2.1. a-Tubulin

Tijekom razvoja, a-tubulin je snažno izražen u svim razvojimabubregstrukture, prvenstveno vizualizirajući oblik primarnih cilija na površinama parijetalnih epitelnih stanica Bowmanove kapsule, g, pct i dct. Unutarbubregtkivo, 82-97 posto pct stanica izražava a-tubulin, dok u dct ekspresija pada s 99 posto na 72 posto u 38. GW (vidi sliku 3, tablica 1). Među različitim razvojnim stadijima, najjača ekspresija a-tubulina nalazi se u g 16. GWbubrega, koji sadrži 93 posto pozitivnih stanica. gipke 14., 15. i 22. GW (vidi sliku 3a,b, tablica 1), oko 70 posto g stanica eksprimira a-tubulin, dok je najmanja ekspresija opažena u 38. GW (p < 0,01)="" s="" 34="" posto="" pozitivnih="" stanica="" (slika="" 3c).="" u="">bubregtkivo (1.5- godina i 7- godinabubrega), najjača imunoreaktivnost na a-tubulin uočena je na apikalnoj staničnoj površini pct i dct (Slika 3d-f). Ekspresija a-tubulina također je prisutna u perinuklearnoj citoplazmi dct i parijetalnim epitelnim stanicama Bowmanove kapsule. a-tubulin boji svebubrežnistrukture s prosjekom od 50 posto pozitivnih stanica u pct, 94 posto u dct i 85 posto u g (Slika 3f). Dct boje se značajno razlikuju od pct (p < 0,0001).="" sve="" istraživane="" strukture="" boje="" se="" pozitivno="" na="" a-tubulin,="" sa="" 77="" posto="" pozitivnih="" stanica="" u="" pct,="" 72="" posto="" u="" dct="" i="" 58="" posto="" u="" g="">

Slika 3. Imunofluorescentno bojenje -tubulina i DAPI u tkivima ljudskog bubrega u razvoju i postnatalnom (a–e). Bubrezi 14., 15./16., 38. GW (a–c);bubregadjece od 1.5- i 7- godine (d,e). Pozitivno bojenje -tubulina (strelice) prikazano je u svakoj strukturi u korteksu kroz razvojne i postnatalne faze (a–e), proksimalne uvijene tubule (pct), distalne uvijene tubule (dct) i glomerule (g). Pojedinosti primarnih cilija u pct (d) i dct (a–c,e) prikazane su kao umetci većeg povećanja (bijeli okvir). Povećanje ×40, skala 100 µm. Distribucija -Tubulin pozitivnih stanica po strukturi kroz različite faze razvoja iu postnatalnom razdoblju prikazana je na grafikonu (f). Grafikon (g) (ukupni broj stanica pozitivnih na proteine ​​u promatranim strukturama) prikazuje ekspresiju proteina povezanu s vremenom razvoja (linearna regresija) i međuodnos -Tubulina i DVL-1 kroz razvoj i sazrijevanje (dvosmjerna ANOVA praćena SIDAK-ov posthoc test). Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± SD.

Distribucija -tubulin-pozitivnih stanica po strukturi kroz različite faze razvoja iu postnatalnom razdoblju prikazana je na grafikonu (f). Grafikon (g) (ukupni broj stanica pozitivnih na proteine ​​u promatranim strukturama) prikazuje ekspresiju proteina povezanu s razvojnim vremenom (linearna regresija) i međuodnos -tubulina s DVL-1 kroz razvoj i sazrijevanje (dvosmjerna ANOVA praćena Sidakov post hoc test). Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± SD.

2.2.2. Dvostruko imunofluorescentno bojenje na inverziju i DVL-1 i DAPI nuklearno bojenje u postnatalnim bubrezima u razvoju i zdravim Inverzijska ekspresija u bubrežnom tkivu u razvoju i postnatalnom tkivu

U 14., 15. i 16. GW, inverzija pokazuje jaku granularnu ekspresiju u g, i blagu granularnu ekspresiju u citoplazmi pct i dct (slika 4a,b), dok u 22. i 38. GW (vidi sliku 4c), snažno pozitivna ekspresija uočena je u g (Tablica 1). Između 14. i 22. GW, oko 50 posto stanica ekspresira verziju. U 16. GW, pct stanice izražavaju inverziju u 73 posto stanica, dok se smanjuju na 29 posto stanica (p < 0,05)="" u="" 38.="" gw="" (vidi="" sliku="" 4f).="" pozitivna="" ekspresija="" inverzije="" nalazi="" se="" u="" približno="" 80-90="" posto="" dct="" i="" g="" stanica="" u="">bubregtkiva 14. i 16. GW, s najnižom ekspresijom u dct 38. GW (p < 0.05,="" p="">< 0,0001,="" respektivno)="" gdje="" je="" 66="" posto="" stanica="" bilo="" pozitivno.="" u="">bubrega, pct jako boji apikalnu staničnu membranu, dok dct boji uglavnom bazalnu staničnu membranu i perinuklearnu citoplazmu (Slika 4d,e). U toj smo fazi kod svih ispitivanih naišli na izraženu inverzijububrežnistrukture, uključujući pct, dct i g, sa srednjom ekspresijom pozitivnih stanica od 92 posto za pct, 88 posto za dct i 90 posto za g (Slika 4f). Nismo uočili značajnu razliku u snazi ​​signala ekspresije inverzije između struktura. Najveća ekspresija inverzije nalazi se u g, s prosjekom od 94 posto pozitivnih stanica (Slika 4f). Značajna razlika pronađena je usporedbom bojenja g (gdje se 94 posto stanica boji pozitivno) s pct, gdje se 58 posto stanica boji pozitivno (p < 0.01)="" i="" s="" dct,="" gdje="" je="" 49="" posto="" stanica="" pozitivan="" (p="">< 0,0001,="" slika="">

Ekspresija DVL-1 u bubrežnom tkivu u razvoju i postnatalnom razdoblju

Blaga do jaka ekspresija DVL{{0}} opažena je u citoplazmi pct, dct i g u fetalnom razdoblju (vidi sliku 4a–c, tablica 1). U pct, 76–86 posto stanica izražava DVL-1 u 14.–22. GW, dok je u 38. GW 57 posto pozitivnih stanica (Slika 4g). U dct 14. i 15. GW, 68–70 posto stanica izražava DVL-1, u 16. i 22. GW broj pozitivnih stanica pada na 42–5{{41} } posto, dok je kod 38. GW ekspresija (p < 0,001),="" uočena="" u="" 19="" posto="" dct="" stanica.="" ekspresija="" dvl-1="" raste="" u="" g="" tijekom="" fetalnih="" faza:="" u="" 14.="" gw="" iznosi="" 6="" posto,="" dok="" se="" u="" 15.,="" 16.="" i="" 22.="" gw="" povećava="" na="" 10="" posto="" (p="">< 0,01).="" u="" 38="" gw,="" 14="" posto="" g="" stanica="" izražava="" dvl-1="" (slika="" 4="" g).="" u="" postnatalnom="" razdoblju="" imunoreaktivnost="" dvl-1="" raspršena="" je="" u="" citoplazmi="" (tablica="" 1)="" i="" pct="" i="" dct="" (slika="" 4d,e).="" signal="" se="" nalazi="" u="" svim="" istraživanim="" strukturama,="" ali="" najviše="" u="" perinuklearnoj="" citoplazmi.="" intenzitet="" ekspresije="" dvl-1="" značajno="" je="" veći="" u="" pct="" u="" usporedbi="" s="" dct="" i="" g="" (p="">< 0,01).="" 39–45="" posto="" stanica="" u="" pct="" i="" dct="" izražava="" dvl-1,="" dok="" je="" u="" g="" 21="" posto="" stanica="" pozitivno="" (slika="" 4="" g).="" nismo="" pronašli="" značajnu="" razliku="" između="" postotka="" imunoreaktivnih="" stanica="" u="">bubrežnistrukture. Postotak DVL-1 imunoreaktivnih stanica je 34 posto u pct, 36 posto u dct odnosno 27 posto u g (Slika 4g).

Slika 4. Dvostruko imunofluorescentno bojenje inverzije (zeleno), DVL-1 (crveno) i DAPI (plavo) u bubrežnom tkivu u razvoju i postnatalnom tkivu (14.–38. GW, 1.5- i {{6 }}godišnja bubrežna tkiva). Pozitivno bojenje (strelice) prikazano je u svakoj strukturi tijekom svih faza razvoja (a-c) i postnatalnog razdoblja (d,e). Spojeni mikrofoni zajedno sa strukturama od interesa u korteksu: proksimalni uvijeni tubuli (pct), distalni uvijeni tubuli (dct) i glomeruli (g). Kolokalizacija inverzije/DVL-1 (vrh strelice) prikazana je na spojenim mikrofotografijama. Negativna kontrolna bojanja prikazana su kao umetci na inverziji i DVL-1 (a). Eritrociti se mogu vidjeti kao jako obojene stanice blizu dct. Pojedinosti su prikazane kao umetci većeg povećanja. Povećanje ×40, skala 100 µm. Dinamička pozitivna stanična distribucija inverzije i DVL-1 u strukturama bubrega (pct, dct, g) tijekom razvojnih i postnatalnih faza prikazana je na grafikonima (f,g). Grafikon (h) prikazuje ekspresiju proteina (ukupan broj pozitivnih stanica u strukturama) povezanu s vremenom razvoja (linearna regresija) i međuodnos inverzije na DVL-1 kroz razvoj i sazrijevanje (dvosmjerna ANOVA praćena Sidakovim post hoc testom ). Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± SD.

Zajednička ekspresija inverzije i DVL-1 opažena je u citoplazmi bubrega g, dct i pct tijekom razvoja (vidi sliku 4a–c, spajanje). U postnatalnom razdoblju, ko-ekspresija inverzije i DVL-1 karakterizira različite stanične odjeljke tubularnih stanica u pct i dct, dok je ko-ekspresija u g karakterizirana jakom prevalencijom inverzije (vidi sliku 4d, spajanje ). U 7-godišnjim postnatalnim bubrezima, ko-ekspresija inverzije i DVL-a-1 se vidi u tubularnim stanicama dct i pct, a u g gdje ekspresija inverzije malo prevladava u usporedbi s DVL-1 (Slika 4e, spajanje).

2.2.3. Razlike u ekspresiji -tubulina, inverzije i DVL-1 između različitih razvojnih faza bubrega i postnatalnih bubrega

Broj -tubulin-pozitivnih stanica u pct tkivu bubrega fetusa bio je statistički značajno veći u usporedbi s tkivom bubrega djece stare 7- godine (13. (p < 0).0{="" {11}}1),="" 15.="" (p="">< 0.0001)="" i="" 16.="" (p="">< 0.00001)="" gw).="" dct="" ranih="" fetalnih="" stadija="" (13.,="" 15.,="" 16.="" i="" 22.="" gw)="" imao="" je="" više="" pozitivnih="" stanica="" u="" usporedbi="" s="" bubrežnim="" tkivom="" djece="" od="" 38.="" gw="" i="" 1{19}}="" godine="" (p="">< 0,0001,="" slika="" 3f).="" uspoređujući="" različite="" razvojne="" stupnjeve,="" pronašli="" smo="" niže="" razine="" ekspresije="" inverzije="" u="" postocima="" 13.="" (p="">< 0,0001),="" 15.="" (p="">< 0,00001),="" 22.="" (p="">< 0,001)="" i="" 38.="" (p="">< 0,0001)="" gw="" u="" usporedbi="" s="">bubrežnitkivo 15-godišnjeg djeteta. U dct, statistički značajno niža ekspresija inverzije pronađena je usporedbom bubrežnog tkiva od 16. GW do 38. GW (p < 0.0001).="" nadalje,="" manja="" ekspresija="" inverzije="" u="" dct="" uočena="" je="" u="" tkivu="" bubrega="" 7--godišnjeg="" djeteta;="" uspoređujući="" 13.,="" 15.="" (p="">< 0,001,="" oba),="" 16.="" i="" 1.5--godišnje="" bubrežno="" tkivo="" s="" dct="" 7--godišnjeg="" bubrežnog="" tkiva="" (p="">< 0,00001,="" redom,="" slika="" 4f).="" opaženi="" signal="" ekspresije="" dvl-1="" kroz="" različite="" faze="" otkrio="" je="" da="" je="" pct="" od="" 13.="" (p="">< 0,01),="" 15.,="" 16.="">< 0.001,="" respectively)="" and="" 22nd="" (p="" <="" 0.0001)="" gw="" had="" higher="" expression="" of="" immunoreactive="" cells="" compared="" to="" the="" pct="" of="" 7-year-old="" children="" kidney="" tissue.="" dvl-1="" immune-expression="" in="" dct="" of="" the="" kidney="" from="" 13th="" and="" 15th="" gw="" was="" significantly="" higher="" than="" in="" the="" 38th="" gw="" tissue="" (p="" <="" 0.0001,="" respectively,="" figure="">

2.2.4. Odnos između ekspresije -tubulina i inverzije u DVL-1 u bubrežnom tkivu u razvoju i postnatalnom razdoblju

- Ekspresija tubulina i inverzije uspoređena je s ekspresijom DVL-1 kroz razvojne faze iu postnatalnom tkivu bubrega. -tubulin je imao statistički veću ekspresiju u svim promatranim stadijima, u usporedbi s ekspresijom DVL-1 (p < 0.001,="" slika="" 3g).="" kroz="" sve="" promatrane="" faze="" inverzija="" je="" imala="" veću="" izraženost="" u="" usporedbi="" s="" dvl-1="" (p="">< 0,0001,="" slika="">

2.2.5. Usporedba imunohistokemijskog bojenja na -Tubulin, verzija i DVL-1- i statistička analiza patološki promijenjenog bubrežnog tkiva (MCDK, CNF, FSGS) -Tubulin Razlika u bojanju -tubulina u MCDK, FSGS i CNF bila je statistički značajna u usporedbi na zdravo postnatalno tkivo bubrega kao kontrolnu skupinu (p < 0.0001,="" respektivno).="" displastična="" bubrežna="" tkiva="" imala="" su="" značajno="" veću="" ekspresiju="" u="" usporedbi="" s="" kontrolnom="" skupinom,="" dok="" su="" fsgs="" i="" cnf="" pokazali="" značajno="" nižu="" ekspresiju="" -tubulina="" u="" usporedbi="" sa="" zdravom="" kontrolom="" (slika="">

Inverzija

Inverzija je izražena u citoplazmi neorganiziranih epitelnih stanica i tubula MCDK (Slika 5a). U CNF ekspresija inverzije karakterizira g i dct, dok se manje intenzivno pokazuje u pct cistama (Slika 5b). U FSGS je inverzija jako izražena u g i dct, ali manje intenzivno u pct cistama (Slika 5c). Prostorna ekspresija inverzije pokazala je statistički značajno veću stopu bojenja u zdravim bubrežnim tkivima (Slika 5g) u usporedbi s MCDK, FSGS i CNF (p < 0,0001,="">

Slika 5. Dvostruko imunofluorescentno bojenje inverzije (zeleno), DVL-1 (crveno) i DAPI (plavo) u patološkim tkivima bubrega u MCDK (a), CNF (b) i FSGS (c): tubule (t) , glomeruli (g), pct cista (c), visina pct epitelnih stanica (*). Struktura i lokalizacija stanica inverzije i DVL-1 (vrhovi strelica) prikazani su u spojenim odjeljcima s detaljima u umetcima većeg povećanja. Negativna kontrolna bojanja prikazana su kao umetci na inverziji i DVL-1 (a). Povećanje ×40, skala 10{{20}} µm. Odnos -tubulina (d) i inverzije (e) s ekspresijom DVL-1 u MCDK, FSGS i CNF (dvosmjerna ANOVA praćena SIDAK-ovim post hoc testom). Razlika u visini epitelnih stanica (f) FSGS, CNF i MCDK pct u usporedbi sa zdravom kontrolom (jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post hoc testom, n=50). Razlika u ukupnom postotku -tubulina u pozitivnim stanicama, inverzija i DVL-1 u MCDK, CNF i FSGS u usporedbi sa zdravom kontrolom (g–i), jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post hoc testom). Podaci su prikazani kao srednje vrijednosti ± SD. Značajne razlike označene su p-vrijednošću (* p < 0,05,="" **="" p="">< 0,01,="" ****="" p="">< 0,0001).="" dvl-1="" dvl-1="" je="" vrlo="" blago="" izražen="" samo="" u="" neorganiziranim="" tubulima="" mcdk,="" dok="" u="" cnf="" njegova="" ekspresija="" karakterizira="" dct="" i="" g="" (slika="" 5a,b).="" u="" fsgs-u="" se="" dvl-1="" promatra="" kao="" blaga="" reaktivnost="" u="" g,="" dct="" i="" pct="" (slika="" 5c).="" zdrava="" bubrežna="" tkiva="" obojena="" na="" dvl-1="" pokazala="" su="" značajno="" višu="" stopu="" bojenja="" (slika="" 5h)="" za="" razliku="" od="" mcdk="" i="" fsgs="" (p="">< 0,0001,="" oboje),="" dok="" nije="" pronađena="" značajna="" razlika="" za="">

2.2.6. Odnos između ekspresije -tubulina i inverzije na DVL-1 u patološki promijenjenom tkivu bubrega (MCDK, CNF, FSGS)U MCDK, FSGS i CNF, -tubulin je obojen značajno jače nego DVL-1 (p < 0.0001,="" slika="" 5d).="" inverzija="" je="" bila="" značajno="" više="" obojena="" u="" usporedbi="" s="" dvl-1="" u="" mdck="" (p="">< 0,0001)="" i="" u="" fsgs="" (p="">< 0,01,="" slika="">

2.2.7. Razlike u visini epitelnih stanica proksimalnih uvijenih tubula između zdrave kontrole i patološki promijenjenog bubrežnog tkiva (MCDK, CNF, FSGS)Visina pct epitelnih stanica (n {{0}} po skupini) uspoređena je između stanica tubula u zdravom tkivu bubrega i patološki promijenjenom tkivu bubrega (Slika 5b,c,f). Prosječna visina epitelnih stanica u HC-u iznosila je 12,91 µm ± 1,847 µm i bila je značajno viša u usporedbi s CNF-om i FSGS-om (p < 0.0001).="" prosječna="" visina="" stanica="" u="" cnf="" pct="" bila="" je="" 9,011="" µm="" ±="" 1,453="" µm,="" dok="" je="" u="" fsgs="" bila="" 8,114="" µm="" ±="" 0,9248="" µm.="" pct="" epitelne="" stanice="" mcdk="" nisu="" pokazale="" značajne="" promjene="" u="" visini="" (12,17="" µm="" ±="" 1,476="" µm)="" u="" usporedbi="" s="">

2.2.8. Razlike u duljini primarne cilije između zdrave kontrole i patološki promijenjenog bubrežnog tkiva (MCDK, CNF, FSGS)

Primarna duljina resica (n= 50 po skupini) uspoređena je između HC i patološki promijenjenog tkiva bubrega (Slika 6c). Zdravo tkivo bubrega i MCDK obojeni su -tubulinom kako bi se potvrdila specifičnost bojenja -tubulina resica (Slika 6a,b). U zdravom bubrežnom tkivu primarni resica bio je dugačak 5,065 µm ± 1,229 µm, dok su u MCDK CNF i FSGS bili značajno duži (p<0.0005, respectively).="" primary="" cilium="" length="" in="" mcdk="" was="" 9.908="" µm="" ±="" 2.434="" µm,="" in="" cnf="" 13.65="" µm="" ±="" 3.218="" µm,="" while="" in="" fsgs="" was="" significantly="" longer,="" 18.29="" µm="" ±="" 4.717="" µm,="" when="" compared="" to="" hc=""><0.0001) and="" other="" pathological="" kidney="" tissues="" of="" mcdk=""><0.0001) and="" cnf=""><>

Rasprava

Cilj našeg istraživanja bio je istražiti imunohistokemijsku ekspresiju a-tubulina, inverziju i DVL-1 u fetalnombubrežnitkivo i postnatalno tkivo bubrega. Nadalje, željeli smo istražiti je li ekspresija i uzorak bojenja a-tubulina, inverzije i DVL-1 poremećen kod različitih bolesti bubrega u usporedbi sa zdravom kontrolom. Naime, usprkos velikom interesu drugih istraživača za ulogu a-tubulina, inverzije i DVL-1 tijekom razvoja bubrega, većina prethodnih studija koristila je životinje ili in vitro eksperimentalne modele. Koliko je nama poznato, ovo je prva studija koja je pokazala ekspresiju i lokalizaciju a-tubulina zajedno s inverzijom i DVL-1 u fetalnim i postnatalnim ljudskim bubrezima, te koja je istraživala ekspresiju spomenutih proteina u bubrezima bolesti, kao što su MCDK, FSGS i CNF. Također smo analizirali promjene u dužini i izgledu cilija svjetlosnom i elektronskom mikroskopijom, jer je naša prethodna studija već pokazala da poremećaji cilija mogu biti povezani s cistogenezom u FSGF i CNF [19].

U kanonskom Wnt-signalnom putu, vezanje Wnt liganada na receptore regrutira Dvl [37]. Procesi MET-a i putanje polariteta ravnih stanica tijekom ranih faza morfogeneze bubrega kontrolirani su Wnt signalizacijom. Posredovanjem Wnt puta, primarne cilije kontroliraju staničnu proliferaciju, diferencijaciju i morfogenezu tkiva [12] kroz organiziranje staničnog citoskeleta i stanične orijentacije kao i produljenje tubularne strukture [2,38]. U našoj studiji, -tubulin, inverzija i DVL-1 bili su svi prisutni u strukturama bubrega, i svi kolokalizirani ne samo tijekom fetalnog razvoja bubrega, već iu tkivu bubrega od 1.5- i {{9 }}godišnja djeca. Ovi su nalazi u skladu s aktivacijom Wnt-signalnog puta za koji je dokazano da se javlja već tijekom tubulogeneze [39]. Dodatno, naši su rezultati otkrili da su ekspresija -tubulina i inverzija recipročno povezani s DVL-1 i da pokazuju statistički značajnu razliku između njihovih obrazaca ekspresije. To je u korelaciji s eksperimentalnim modelima, budući da mutacija cijele obitelji proteina Dvl kod miševa rezultira nedostatkom procesa gastrulacije, dok mutacije koje ne uključuju cijelu obitelj proteina pokazuju nedostatke u smještaju nodalnih resica zajedno s defektima organa [40] . Prethodni nalazi sugeriraju da inverzija ima ulogu u migraciji stanica u Xenopus pronephros. Budući da je taj segment u korelaciji s Henleovom petljom i distalnim tubulima sisavaca, to bi moglo ukazivati ​​na važnost inverzije tijekom razvoja bubrega i kod ljudi [41]. U skladu s tom premisom, prethodne studije otkrile su da mutacija inverzijskog gena može rezultirati nefronoftizom tipa 2, koja je posredovana abnormalnom ekspresijom DVL-1 [42]. Unatoč tome što je uloga primarne cilije kontroverzna u regulaciji Wnt-signalnog puta, otkrili smo da je -tubulin kolokaliziran s inverzijom i DVL-1 u analiziranim uzorcima bubrega. Nadalje, prethodne studije su ukazale da primarni cilija zajedno s inverzijom regulira degradaciju Dvl utječući na Wnt-signalni put [43]. Kod bolesti bubrega kod ljudi povezanih s razvojem cista, uočena je abnormalna lokalizacija i funkcija primarnih cilija [19]. Slično, ova studija također je potvrdila morfološke promjene formiranja primarnih cilija u patološkim stanjima kao što su CNF, FSGS i MCDK. Prethodni nalazi potvrdili su da prekomjerna aktivacija kanonskog puta Wnt nakon oštećenja bubrega dovodi do nepovratnih strukturnih promjena bubrežnog tkiva [44]. Naprotiv, primarni cilium je dobio ulogu prebacivanja s kanonskog na nekanonski Wnt put u pomaganjububrežnipopravak. Nadalje, utvrđeno je da prekomjerna aktivacija kanonskog puta Wnt u tkivu transplantiranog bubrega ima pozitivnu prediktivnu vrijednost prema fibrozi bubrega [45]. Ako kanonski put Wnt prevladava nauštrb nekanonskog, to podržava teoriju fibroze bubrega kao ishoda. Naša otkrića smanjene ekspresije -tubulina i inverzije u CNF-u i FSGS-u upućuju na neaktivnost nekanonskog puta Wnt, posebno jer oba stanja imaju tendenciju da dovedu do završne fazebubrežna bolest.Naime, vjeruje se da bi normalna lokalizacija i funkcija primarne cilije mogla biti čimbenik u održavanju pravilnog Wnt puta i, prema tome, preduvjet za normalan razvoj. Nasuprot tome, ako je Wnt put pojačan, to može rezultirati nereguliranom staničnom proliferacijom i diferencijacijom što dovodi do karcinogeneze [46]. Kao što je prethodno opisano, kanonski put Wnt obavezan je za pokretanje MET-a i formiranje nefrona, dok njegov poremećaj može dovesti dobubrežnihipoplazija [47]. Naši rezultati podržavaju ovu ideju otkrivajući najnižu ekspresiju DVL-1 s najvećom ekspresijom -tubulina u MCDK u usporedbi sa zdravom kontrolom. Ovi rezultati mogu implicirati najnižu aktivaciju kanonskog puta Wnt, što bi mogao biti temeljni uzrok izostanka stvaranja nefrona. Nasuprot tome, najviša ekspresija -tubulina s najnižom ekspresijom DVL-1 mogla bi objasniti nalaze višestrukih cista budući da ne postoji organizirana elongacija i stanična polarizacija vođena nekanonskim putem Wnt. Prethodne studije također su pokazale da inverzija inhibira kanonski Wnt signalni put ciljanjem Dvl za razgradnju [26]. Utvrđeno je da je ovaj korak u njihovoj interakciji neophodan za inhibiciju kanonske Wnt-signalizacije u održavanju normalnog tubularnog produljenja i pozicioniranja. Inverzijska mutacija rezultira pojačanom regulacijom kanonske Wnt signalizacije, koja je naknadno izazvala abnormalnu proliferaciju u tubularnim stanicama. Dokazano je da je ovaj korak ključan u cistogenezi [42], dok nokaut inverzije kod miševa dovodi do policistične bolesti bubrega [48]. Prema teoriji obubrežnicistogeneze, inverzija se smatra "mikoproteinom", zbog svoje lokalizacije na primarnim cilijama ububrežnitubularne stanice. U našem istraživanju primarne trepavice bile su prisutne na površini apikalne stanice tubularnih stanica u svim analiziranim stadijima, dok je tijekom fetalnih stadija ekspresija -tubulina bila jača nego u postnatalnom razdoblju.

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA

Prethodne studije pokazale su da na funkciju primarnih cilija može utjecati disregulacija -tubulina tijekom razvoja, što može dovesti do cistogeneze, abnormalnog razvoja bubrega i moguće kronične bolesti bubrega u djetinjstvu [31,49]. Ovo je u skladu s našim nalazima o skraćenim i dismorfnim primarnim cilijama uočenim u MCDK ili s višestrukim i izrazito izduženim ili dislociranim cilijama pronađenim u proširenim tubulima CNF i FSGS u usporedbi sa zdravom kontrolom. Kako bismo podržali činjenicu da se kanonski i nekanonski Wnt-signalni putovi, regulirani primarnim cilijama, smatraju obaveznim za normalan razvoj bubrega, pronašli smo značajno niže bojenje inverzije i DVL-1 u MCDK u usporedbi sa zdravom kontrolom [31,49]. Različita dinamika ekspresijskog obrasca -tubulina, inverzije i DVL-1 tijekom različitih faza razvoja bubrega može ukazivati ​​na prebacivanje između kanonskog i nekanonskog Wnt-signalnog puta tijekom normalne morfogeneze bubrega. Predlažemo da njihova razmjena određuje transkripciju u kanonskom putu ili redoslijed migracije stanica i polarizaciju tijekom razvoja bubrega u nekanonskom signalnom putu. Njihova ravnoteža i izraženost u svim istraživanim strukturama bubrega ukazuje na njihovu važnu ulogu u normalnom razvoju bubrega. Tijekom normalnog razvoja bubrega (od 13. GW do 38. GW), ukupna ekspresija -tubulina, inverzije i DVL-1 se smanjuje kako tkivo bubrega poprima zrelu morfologiju. U bubrežnom tkivu starom 1.5- i 7-godinu, -tubulin i inverzija pokazali su blagi porast ekspresije što podupire činjenicu da nekanonski put Wnt ostaje aktivan nakon rođenja. Naprotiv, DVL-1 ustraje sa smanjenim uzorkom ekspresije što bi moglo dodati zaključku da je kanonski put Wnt utišan u zdravom tkivu bubrega. Kao rezultat patoloških stanja bubrega, epitelne stanice bubrega mogle bi reagirati ponovnom pojavom EMT-a i fibroze [50] povezane s reaktivacijom kanoničkog puta Wnt [44]. Stoga bi poremećaji -tubulina, inverzije i DVL-1 koji se nalaze u bolesnim bubrezima mogli biti temeljni patološki mehanizam i rezultat prelaska s nekanonskog na kanonski Wnt put u bubregu u razvoju, aludirajući na prelazak između reverzibilnog i ireverzibilnog bubrega šteta. Nadalje, promjene u njihovom prenatalnom i postnatalnombubrežniObrazac ekspresije mogao bi biti povezan s oštećenjem funkcije bubrega u odrasloj dobi, što dovodi do urođenih bolesti i kroničnog zatajenja bubrega.

4. Materijali i metode

4.1. Ljudski uzorci

Uzorci fetalnog tkiva bubrega prikupljeni su nakon gubitka trudnoće u 14., 15., 16., 22. i 38. GW na Klinici za ginekologiju i porodništvo KBC-a Split. Sav dobiveni fetalni materijal pregledao je patolog, a za ispitivanje su korištena samo tkiva bez znakova abnormalnosti, maceracija ili intrauterine smrti i s normalnim kariogramom. Medicinski kartoni majki ispitani su prije uzimanja uzorka, au slučaju zdravstvenih problema koji bi mogli utjecati na ishod trudnoće, bubrežna tkiva su isključena iz studije. Zrelost je određena opsegom glave, opsegom abdomena i duljinom femura [51] u korelaciji s menstrualnim kalendarom pacijentica. Uzorci bubrežnog tkiva starog 1.5- i 7-godinu prikupljeni su nakon slučajnih smrti. Uzorci su dobiveni na Zavodu za patologiju KBC-a Split. Uzorci multicistično displastičnih bubrežnih tkiva (MCDK) dobiveni su nakon gubitka trudnoće, žarišne segmentalne glomeruloskleroze (FSGS) i nefrotskog sindroma finskog tipa (CNF) dobiveni su zbog nefrektomije. Sav prikupljeni materijal pregledan je i evaluiran od strane patologa, koji je klasificirao dijagnoze. Protokol studije odobrilo je Etičko povjerenstvo Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu (20. svibnja 2016.) u skladu s Helsinškom deklaracijom i njezinim ažuriranjima (klasifikacijski br.: 003-08/16-03/0001, registarski broj: 2181-198-03-04-16-0024, 20. svibnja 2016.) [52].

4.2. Imunohistokemija

Prikupljeni uzorak tkiva fiksiran je s 4 posto paraformaldehida u fosfatno puferiranoj fiziološkoj otopini (PBS) tijekom 24 sata na 22 ◦C. Nakon dehidracije u 100 postotnom etanolu, uzorci su uklopljeni u parafin, kao što je prethodno opisano [53]. Uzorci su izrezani na dijelove debljine 5 µm korištenjem mikrotoma i zatim postavljeni na stakalce mikroskopa. Kako bi se potvrdila očuvanost tkiva, svaki 10. rez je obojen hematoksilinom i eozinom [54]. Depart-feminizacija i imunohistokemija provedene su kako je prethodno opisano [2,55,56]. Nakon ispiranja u PBS-u, mikroskopska stakalca inkubirana su preko noći s primarnim antitijelima u vlažnoj komori na 22 ◦C (StainTray sustav za bojenje stakalca; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD). Primarna korištena protutijela bila su zečja monoklonska anti-alfa tubulinska protutijela (razrjeđenje 1:1000; ab179484, Abcam, Cambridge, UK), zečja poliklonska antiinverzijska protutijela (razrjeđenje 1:100; ab65187, Abcam, Cambridge, UK), mišje monoklonsko DVL -1 antitijela (razrjeđenje 1:150; sc-8025, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, SAD) i zečja poliklonska anti-gama tubulinska antitijela (kako bi se potvrdilo primarno bojenje specifično za cilije alfa- tubulin, razrjeđenje 1:500; ab11321, Abcam, Cambridge, UK). Nakon ispiranja u PBS-u, sekundarna protutijela primijenjena su sat vremena kako je navedeno: magareći anti-zečji IgG H&L, Alexa Fluor 488 (razrjeđenje 1:400; ab150073, Abcam, Cambridge, UK) i kozji anti-mišji IgG H&L, TRITC (razrjeđenje 1:400; ab6786, Abcam, Cambridge, UK) 4',6-diamidino-2-fenilindol dihidroklorid (DAPI) korišten je za bojanje jezgri i nakon 2-minutne inkubacije, stakalca isprani su u PBS-u i prekriveni medijem za postavljanje i pokrovnim stakalcima. Nespecifično bojenje je spriječeno upotrebom bloka proteina (ab64226; Abcam, Cambridge, UK) prije primarne primjene protutijela. Kao negativna kontrola proveden je predadsorpcijski test, dok je specifičnost sekundarnih protutijela provjerena izostavljanjem primarnih protutijela iz postupaka bojenja.

4.3. Elektronska mikroskopija

Fiksacija odbubregtkiva izvedena je u 4 postotnom paraformaldehidu tijekom 24 sata, nakon čega je uslijedila postfiksacija u 1 postotnom osmij tetroksidu tijekom 1 sata. Proces dehidracije proveden je nizom etanola i završen ugradnjom u LX 112 smolu [22]. Tanki rezovi od jednog mikrometra obojeni su toluidinskim plavim i proučavani kako bi se odabrali ultratanki rezovi. Ultratanki rezovi debljine 0.05 mikrometara ispitani su nakon bojenja uranil acetatom i olovnim citratom. Za dobivanje mikrofotografija korišten je mikroskop JEOL 1200 EX.

4.4. Genetska analiza

Kao što je prethodno opisano [19], pomoću leukocita iz periferne krvi ekstrahirana je genomska DNA. Nađena je homozigotna missense mutacija u genu NPHS1 (c.1096A > C; p.Ser366Arg) što je potvrdilo dijagnozu kongenitalnog nefrotskog sindroma finskog tipa (CNF) [57].

CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE INFEKCIJE

4.5. Analiza podataka

Analiza presjeka provedena je na FL fluorescentnom mikroskopu pomoću 3 FL fluorescentna kanala (Olympus BX51, Tokyo, Japan). Slike su snimljene digitalnim fotoaparatom DP71 (Olympus, Tokyo, Japan) pri velikom povećanju (×40). Samobubrežnikorteks koji sadrži proksimalne uvijene tubule (pct), distalne uvijene tubule (dct) i glomerule (g) bili su od interesa. Slike su potom obrađene softverom ImageJ (Rasband, WS, ImageJ, Nacionalni instituti za zdravlje SAD-a, Bethesda, MD, SAD, https://imagej.nih.gov/ij/ (pristupljeno 15. listopada 2018.), 1997.–2021. ) i Adobe Photoshop (Adobe Inc., San Jose, Kalifornija, SAD) za daljnju procjenu. Prije brojanja stanica korišten je alat ImageJ podijeljenih kanala. Nakon toga, izvorna imunofluorescentna mikroskopska fotografija oduzeta je crvenim ili zelenim kanalom (ovisno o tome koji je izvorni kanal bio) pomoću alata ImageJ za izračun slike kako bi se spriječilo curenje signala. Vrijednosti ispod razine praga 50 smatrane su negativnima. Brojali smo imunoreaktivne signale u stanicama s najmanje 20 struktura (pct, dct ili g) po stadiju ili ukupnom pozitivnom broju stanica po mikro fotografiji multicistične displastikebubregtkiva, FSGS i CNF. Stanice smo klasificirali kao pozitivne ako se signal imunofluorescencije nakupio na bilo kojoj razini membrane, citoplazme ili jezgre iznad vrijednosti 50 izmjerene na ImageJ softveru pomoću naredbe praga. Negativne stanice su kategorizirane kao stanice bez ikakve imunoreaktivnosti. Dva neovisna istražitelja analizirala su podatke.

4.6. Semikvantitativna analiza

Intenzitet -tubulina, inverzije i signala bojenja DVL-1 procijenila su dva neovisna istraživača pomoću softvera ImageJ. Ukupni intenzitet signala izmjeren je nakon što je slika postavljena na 8-bitnu vrstu; nakon toga je procijenjen intenzitet bojenja markera u 20 pct, dct i g mjerenjem ocrtane površine strukture. Ako su rezultati između evaluatora bili različiti, treći neovisni istraživač razjasnio je dvojbu. Maksimalni intenzitet signala za -tubulin bio je 84,125 ± 3,214 SD, za inverziju 71,50 ± 2,715 SD, a za DVL-1 80,916 ± 1,875 SD. Najveća zasićenost boje signala na fotografijama mikroskopa označena je kao 3 (66,66–99,99 posto ukupnog intenziteta slike signala), zatim 2 (33,33–66,66 posto) za srednji intenzitet signala i 1 (0,33 posto –33,33 posto) za niski intenzitet signala (Tablica 1.).

4.7. Statistička analiza

Za određivanje razlika između stadija i struktura učinjen je Kruskal–Wallisov test, a zatim Dunnov post hoc pomoću softvera GraphPad Prism (Graphpad Software Inc., San Diego, Kalifornija, SAD, www.graphpad.com (pristupljeno 15. listopada). 2018.)). Broj pozitivnih stanica izražen je u postocima kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD), dok je statistička značajnost priznata pri p < 0,05.="" broj="" analiziranih="" struktura="" bio="" je="" 4200="" u="" 35="" uzoraka,="" s="" ukupnim="" brojem="" od="" 135="" 256="" prebrojanih="" stanica.="" koristili="" smo="" 2-way="" anova="" sa="" sidakovim="" post="" hoc="" testom="" da="" testiramo="" razlike="" u="" ekspresiji="" -tubulina,="" inverziji="" i="" dvl-1="" u="" različitim="" razvojnim="" fazama.="" za="" proučavanje="" ekspresije="" proteina="" s="" obzirom="" na="" vrijeme="" razvoja="" koristili="" smo="" linearnu="" regresiju.="" jednosmjerna="" anova="" praćena="" tukeyjevim="" post="" hoc="" testom="" korištena="" je="" za="" istraživanje="" razlika="" u="" ekspresiji="" -tubulina,="" inverzije="" i="" dvl-1="" u="">bubregtkiva u usporedbi s tkivima MCDK, FSGS i CNF. Razlike u ekspresiji proteina između MCDK, FSGS i CNF istraživane su 2-way ANOVA-om praćenom Sidakovim post hoc testom. Jednosmjerna ANOVA praćena Tukeyjevim post hoc testom korištena je za procjenu razlika u duljini cilija i visini epitelnih stanica pct između zdrave kontrolne i patološkebubregtkiva. Podaci su prikazani kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (SD) sa statističkom razlikom priznatom na p <>