Aktivacija receptora aril ugljikovodika putem 6-formilindolo[3,2-b]karbazola ublažila je akutnu ozljedu bubrega potiskivanjem upale i apoptoze
Mar 20, 2022
Sažetak:Akutnaozljeda bubrega(AKI) je multifaktorska bolest različite etiologije. Aril ugljikovodični receptor (AhR) je transkripcijski faktor aktiviran ligandom koji odgovara na ligande da inducira ili potisne ekspresiju gena, regulirajući tako raznolik spektar bioloških ili patofizioloških učinaka. Međutim, učinak AhR na AKI ostaje nepoznat. Učinjena je jedna intraperitonealna injekcija 50 postotnog glicerola za induciranje rabdomiolize u C57BL/6J miševa. Bilateralnibubrežnipedikule su zatvorene 30 minuta i zatim uklonjene radi stimulacijebubrežniI/R ozljeda. Upotrijebljen je 6-formilindolo[3,2-b]kar-bazol (FICZ), produkt fotooksidacije triptofana s visokim afinitetom za AhR. In vitro studija provedena je na HK-2 stanicama. Željezni mioglobin i FICZ otopljeni su u mediju u različitim skupinama stanica. Liječenje agonistom AhR FICZ značajno je ublažilo povišenje serumskog kreatinina i ureje u AKI. Inducirano modeliranjem AKIoštećenje bubregaje prigušen od strane FICZ-a. AhR se uglavnom eksprimira u proksimalnim tubularnim stanicama i može se aktivirati primjenom FICZ-a. U međuvremenu, AKI je potaknuo proizvodnju proupalnih citokina kod ozlijeđenihbubrega, dok je FICZ kočio njihove izraze. Nadalje, FICZ je učinkovito preokrenuo staničnu apoptozu u modelima AKI. Mehanički gledano, AKI je stimulirao aktivaciju NF-κB i JNK puteva ububrega, dok je FICZ značajno potisnuo ove odgovarajuće ekspresije proteina. Za in vitro studiju, FICZ je također inhibirao upalu i apoptozu u mioglobinom ili H/R-stimuliranim HK-2 stanicama. Ukratko, agonizam AhR od strane FICZ-a ublažio je rabdomiolizu i I/R-induciran AKI. FICZ je inhibirao upalu i apoptozu potiskivanjem puteva NF-κB i JNK u proksimalnim tubularnim stanicama.
Ključne riječi:akutna ozljeda bubrega, apoptoza, aril ugljikovodični receptor, upala, bubrežne tubularne epitelne stanice
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BUBREŽNE/BUBREŽNE BOLESTI
UVODAkutnaozljeda bubrega(AKI) odnosi se na brzo opadanjebubrežna funkcijau nekoliko sati do nekoliko dana zbogbubrežniinsuficijencija perfuzije, nefrotoksični lijekovi ili otrovi, opstrukcija urinarnog trakta i drugi uzroci.1 Klinički uzroci AKI uglavnom uključuju ishemijsko-reperfuzijsku ozljedu, nefrotoksične tvari (kao što su lijekovi, kontraktivni agensi i sadržaj mišićnih stanica oslobođen rabdomiolizom) i sepsu. Svake godine u svijetu oko 13,3 milijuna ljudi boluje od AKI.2 AKI, sa svojom visokom smrtnošću i troškovima, predstavlja veliki teret.3 Glavni patofiziološki mehanizmi uključuju ozljedububrežnikrvožilni sustav,4,5 stres endoplazmatskog retikuluma,6,7 oštećenje mitohondrija,8 apoptoza,9 oksidativni stres i upala.10 Rabdomioliza (RM) je sindrom karakteriziran nekrozom mišića i otpuštanjem sadržaja mišićnih stanica u cirkulaciju, pri čemu AKI je najčešća komplikacija11; Ishemija-reperfuzija (I/R) jedna je od glavnih patofiziologija AKI, koja čini 60 posto svih uzroka AKI.12 Trenutačno ne postoji učinkovito liječenje za AKI uzrokovano oba gore navedena razloga osim za uklanjanje etiologije, suportivnu liječenje, ibubrežninadomjesna terapija.
Aril ugljikovodični receptor (AhR) se transkribira i prevodi iz AHR gena. Kod ljudi, AhR se izražava u različitim organima, uključujući pluća, timus,bubreg,jetre, crijeva, itd.13 Nevezani AhR nalazi se u citosolu u proteinskom kompleksu koji također sadrži dimer proteina toplinskog šoka 90 (HSP90) i ko-šaperone AIP i p23.14 Nakon vezanja na ligand, AhR se aktivira i ulazi u jezgri, gdje se veže na AhR nuklearni translokator (ARNT) i potiče transkripciju mnogih različitih gena nizvodno.15 Ligandi za AhR su izuzetno raznoliki i mogu se klasificirati kao egzogeni ili endogeni. Ligandi s različitim izvorima i strukturama vežu se za AhR s različitim afinitetima i mogu potaknuti različite fiziološke ili patološke učinke.16 Prethodne studije pokazale su da AhR sa svojim nizvodnim putovima ima protuupalne funkcije,17 anti-apoptozu,18 regulaciju staničnih ciklusa19 i regulaciju imunitet,20 koji su važne komponente patogeneze AKI. Endogeni ligandi za AhR su uglavnom iz metabolizma triptofana. 6-formilindolo[3,2-b]karbazol (FICZ), produkt fotooksidacije triptofana, ima visok afinitet s AhR.21 Prethodno je FICZ pokazao zaštitne učinke u različitim modelima bolesti.{{ 19}} Iako su istraživači otkrili da je AhR aktiviran uremičnim toksinima imao štetne učinke kod bolesnika s kroničnimbolesti bubrega(CKD),25 nijedna studija nije mjerila njegove promjene ekspresije kod AKI. Također nije jasno ima li FICZ abubrežnizaštitni učinak kod rabdomiolize i AKI izazvane I/R, budući da AhR može aktivirati potpuno različite nizvodne učinke.
Pokusi na životinjamaSvi eksperimentalni protokoli i postupci na životinjama provedeni su u skladu s Etičkim načelima u pokusima na životinjama koje je usvojilo Sveučilište za pokuse u Sichuanu i odobrilo Etičko povjerenstvo za brigu i korištenje životinja Sveučilišta u Sichuanu. Muški miševi C57BL/6 (10-12 tjedana, težina između 25 i 27 g) kupljeni su od Laboratorijskog centra za životinje Sveučilišta Sichuan (Chengdu, Kina). Miševi su držani na konstantnoj temperaturi (23 ± 2 stupnja) i uvjetima svjetla/tame (12/12 sati), sa slobodnim pristupom vodi i hrani. Prije daljnjeg istraživanja miševi su bili prilagođeni ovom okruženju 1 tjedan. U modelu rabdomiolize, miševi su nasumično podijeljeni u četiri skupine: kontrolna (n {{10}}), FICZ (n=3), glicerol (n=6) i glicerol plus FICZ (n=6). Miševima u skupini koja je primala glicerol ubrizgano je 50 posto glicerola otopljenog u 0,9 posto fiziološke otopine (9 μL/g tjelesne težine) u stražnje udove obostrano kako bi se izazvala rabdomioliza - kod smanjene AKI. U međuvremenu, miševi u kontrolnoj skupini primili su isti volumen fiziološke otopine intramuskularnom injekcijom. Što se tiče glicerol plus FICZ skupine, FICZ je otopljen u 2,5 posto PEG400 i razrijeđen u 0,9 posto fiziološke otopine da se daje intraperitonealno u dozi od 100 ug/kg/dan četiri uzastopna dana prije injekcije glicerola. Miševima u FICZ skupini davane su intraperitonealno iste doze FICZ-a četiri uzastopna dana, bez injekcije glicerola.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI ZATAJENJE BUBREGA/BUBREGA
U modelu bubrežne ishemije-reperfuzije, miševi su nasumično podijeljeni u četiri skupine: kontrolna (n=6), FICZ (n=3), I/R (n=6) i I /R plus FICZ (n=10). Ozljeda u I/R skupini izazvana je stezanjem bubrežnih peteljki netraumatskim mikrovaskularnim stezaljkama tijekom 30 minuta, nakon čega je uslijedila 24-satna reperfuzija nakon uklanjanja stezaljke. Okluzija i reperfuzija potvrđene su promjenama bojebubrega. Miševi u kontrolnoj skupini podvrgnuti su istim kirurškim zahvatima osim stezanja peteljki. Što se tiče skupine I/R plus FICZ, FICZ je primijenjen kako je gore spomenuto četiri uzastopna dana prije I/R modeliranja. Slično tome, miševi u FICZ skupini dobili su iste doze FICZ-a četiri uzastopna dana i prošli su sve kirurške postupke kao i kontrolna skupina. Dvije serije miševa su eutanazirane injekcijom pentobarbital natrija (50 mg/kg, ip) i žrtvovane 24 sata nakon modeliranja. Serum ibubreguzorci su prikupljeni i pohranjeni na -80 stupnjeva za daljnju analizu.
Biokemijske analize serumaUzorci krvi odmah su centrifugirani na 1509,3 g tijekom 20 minuta kako bi se izolirao serum za testiranje. Razine serumskog kreatinina (sCr), uree i kreatin kinaze (CK) detektirane su automatskim biokemijskim analizatorom (Mindray BS-240). Razine sCr modeliranih skupina koje su porasle do dva puta u odnosu na njihove kontrolne vrijednosti bile su pokazatelj uspješnog modeliranja AKI.
Histološka procjenaBubrežna tkiva su fiksirana u 10 posto neutralnom puferiranom formalinu, uklopljena u parafin i izrezana na 4 μm debljine. Sekcije su obojene periodnom kiselinom-Schiff (PAS) nakon deparafinizacije i rehidracije. Sekcije obojene PAS-om ispitivane su pod svjetlosnim mikroskopom pri povećanjima od ×200 ili ×400. Deset polja nasumično je odabrano pri povećanju od ×200 iz svakog odjeljka, a dva odjeljka nasumično su odabrana iz svakog uzorka od najmanje tri u svakoj skupini za polukvantitativnu analizu. Histopatološke promjene procijenjene su postotkom ozlijeđenih/oštećenihbubrežnitubula, kao što je naznačeno tubularnom dilatacijom, lizom, prekidom i stvaranjem odljeva. Ozljeda tkiva ocijenjena je na ljestvici {{0}}, pri čemu 0, 1, 2, 3 i 4 odgovaraju 0 posto,<25%, 26%-50%,="" 51%-75%="" and="">76 posto ozlijeđenih/oštećenihbubrežnitubulima odnosno.26
Imunofluorescentno bojenjeMiš se smrznuobubregtkiva, ugrađena u OCT, izrezana su na 4-µm debele dijelove na kriostatu i pohranjena na -80 stupnjeva do bojenja. Fosfatno puferirana fiziološka otopina (PBS) koja sadrži 5 posto konjskog seruma primijenjena je 1 sat na sobnoj temperaturi kako bi se blokirala nespecifična vezna mjesta. Zatim su rezovi inkubirani s primarnim antitijelima u vlažnoj komori na 4 stupnja preko noći. Nakon ispiranja s PBS-om, odgovarajuće sekundarno protutijelo korišteno je 1 sat, izbjegavajući svjetlost. Uzorci su zatim isprani PBS-om, obojeni DAPI-jem (D8200, Solarbio) i na kraju postavljeni pokrovnim stakalcima. Primarna antitijela su zamijenjena PBS-om u negativnim kontrolama. Sekundarna protutijela (1:500 razrjeđenje; Jackson ImmunoResearch) usklađena s primarnim protutijelima primijenjena su za izvoz fluorescentnih signala. Slike su snimljene i analizirane softverom za mikroskopiju ZEN 2012 (plavo izdanje).
ImunohistokemijaBubrežna tkiva su fiksirana u formalinu, dehidrirana, umetnuta u parafin, izrezana na 5 µm debljine, i nakon toga postavljena na stakalce. Stakalca su zatim blokirana 2,5 posto normalnim kozjim serumom i inkubirana s primarnim antitijelima na 4 stupnja. Stakalca su isprana tri puta u PBS-u, a za bojenje smo koristili VECTASTAIN ABC Kit (Vector). Slike su snimljene pomoću softvera za mikroskopiju ZEN 2012 (plavo izdanje).
TUNEL bojenjeBubrežna tkiva su fiksirana u formalinu, uklopljena u parafin i izrezana na 4 µm debljine. Terminalno deoksinukleotidil transferaza posredovano dUTP nick end označavanjem (TUNEL) izvedeno je korištenjem DeadEnd™ Fluorometric TUNEL sustava (G3250, Promega). Za nuklearno bojenje, rezovi su inkubirani s DAPI (D8200, Solarbio) u razrjeđenju od 1:500. Slike su prikazane fluorescentnom mikroskopijom pri povećanju od ×400. Prebrojali smo pozitivne stanice i pregledali najmanje 10 polja po sekciji u svakom uzorku.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI FUNKCIJU BUBREGA/BUBREGA
Western blot analizaThetkivo bubregas ili HK{{0}} stanice homogenizirane su puferom za lizu radioimune precipitacije (RIPA) (P0013B, Beyotime Biotechnology) koji sadrži 1‰ inhibitore proteinaze (Keygen Biotech). Nakon centrifugiranja (18 894.2 g, na 4 stupnja) tijekom 15 minuta, supernatant je sakupljen, a koncentracije proteina su određene kompletom za analizu proteina bicinhoninske kiseline (Beyotime Institute of Biotechnology) prema uputama proizvođača. Proteinski lizat s jednakim količinama odvojen je s 10 posto - 12 posto SDS-PAGE nakon čega je uslijedio prijenos na poliviniliden difluoridnu membranu (Bio-Rad). Membrane su blokirane s 5 posto nemasnog suhog mlijeka (w/v) u tris-puferiranoj fiziološkoj otopini s 0,1 posto Tween-20 (TBS-T) tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, a zatim inkubirane s odgovarajućim primarnim protutijelima preko noći na 4 stupnja. Nakon ispiranja tri puta s TBS-T u intervalima od 5- minuta, membrane su inkubirane s HRP-konjugiranim sekundarnim protutijelima na sobnoj temperaturi tijekom 1 sata. Proteinske mrlje na membranama vizualizirane su Immobilon Western Chemiluminescent HRP supstratom (Millipore Corporation) s Bio-Rad Chemi Doc MP. Analiza denzitometrije provedena je pomoću softvera ImageJ 6.0 (National Institutes of Health), a -aktin je korišten kao kontrola opterećenja.
Kvantitativna PCR analiza u stvarnom vremenuUkupna RNA iz smrznutogbubreguzorci su izolirani kompletom za izolaciju ukupne životinjske RNA (Foregene). Koncentracija izolirane mRNA određena je pomoću determinatora ScanDrop 100 (Analytik Jena), a cDNA su sintetizirane pomoću kompleta reagensa PrimeScript™ RT (Takara Bio). Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu proveden je pomoću iTaq™ Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) u PCR sustavu (CFX Connect; Bio-Rad) nakon obrnute transkripcije. Slijedovi primera navedeni su u tablici S1. Relativne količine gena izračunate su metodom 2−∆∆Ct u usporedbi s razinama ekspresije -aktina.
Kultura stanica i liječenjeLjudska bubrežna proksimalna tubularna stanična linija (HK-2 stanica) bila je ljubazan dar od prof. Xueqing Yu (Guangdong Provincial People's Hospital) i uzgojena u mediju (DMEM)/F12 (SH30023. 01B, Hyclone) s dodatkom 10 posto fetalni goveđi serum (SH30084.03, Hyclone), na 37 stupnjeva u vlažnoj atmosferi od 5 posto CO2 i 95 posto zraka. U modelu mioglobina, stanice u stanju eksponencijalnog rasta podijeljene su u četiri skupine: FICZ skupina, inkubirana sa 100 nmol/L FICZ tijekom 24 sata; skupina mioglobina, inkubirana s 200 μmol/L željeznog mioglobina tijekom 24 sata; skupina Mb plus FICZ, inkubirana s FICZ na 100 nmol/L uz primjenu tretmana mioglobinom; i kontrolne skupine, stanice su inkubirane samo s potpunim medijem u kontrolnoj skupini. Željezni mioglobin pripremljen je kao što je prethodno opisano.26,27 U modelu hipoksije/reoksigenacije (H/R), podijelili smo HK-2 stanice u tri skupine. Stanice u H/R skupini uzgajane su u uvjetima hipoksije (1 posto O2, 94 posto N2 i 5 posto CO2) u mediju bez seruma 12 sati kako bi se izazvala hipoksija. Zatim su stanice prebačene natrag u uobičajeni medij kulture s kisikom na 6 sati radi reoksigenacije. Kontrolne stanice su inkubirane u potpunom mediju kulture u običnom inkubatoru. Primjena FICZ-a (100 nmol/L) u skupini H/R plus FICZ dana je neposredno prije operacije H/R.
Analiza aneksin V-FITC/propidijum jodidPrimijenili smo komplet za analizu apoptoze Annexin V-FITC (AO2001- 02PH, SUNGENE). HK-2 stanice su nasađene u ploče sa šest jažica. Nakon što su bile izložene različitim medijima tijekom 24 sata, zalijepljene stanice su odvojene pomoću tripsina. Zatim su stanice resuspendirane u puferu za vezanje i obojene s 5 μL Annexin V-FITC i 5 μL propidijevog jodida (sobna temperatura, 15 minuta, izbjegavajući mrak). Apoptotične stanice identificirane su protočnim citometrom.
Statistička analizaPodaci su dati kao srednja vrijednost ± SD. Statističke vrijednosti za usporedbe više skupina analizirane su jednosmjernom ANOVA-om, a usporedba u parovima provedena je SNK testom. Sve statističke analize provedene su u SPSS 21.0. P < 0.05="" smatra="" se="" statistički="">
REZULTATI
AhR agonist FICZ oslabio je AKIKako bismo provjerili pruža li FICZ renoprotektivni učinak, uspostavili smo modele AKI izazvane rabdomiolizom i ishemijom/reperfuzijom (I/R). Zatim smo procijenili bubrežnu funkciju i patološke promjene u bubrežnom tkivu. Nema značajnih poremećaja u serumskim razinama kreatinina, ureje, CK, metaboličke aktivnosti jetrenih enzima
u skupini FICZ (Slika 1A-C; Tablica S3). Kao što je prikazano na slici 1A-B, primjena FICZ-a značajno je smanjila značajan porast razine kreatinina i uree u serumu 24 sata nakon injekcije glicerola ili I/R operacije, bez utjecaja na razinu CK u serumu kod miševa s rabdomiolizom (Slika 1C). U međuvremenu, bojenje PAS pokazalo je da je FICZ učinkovito ublažio patološko oštećenje karakterizirano tubularnom dilatacijom, oteklinom, stvaranjem odljeva i gubitkom ruba četke u usporedbi s onim kod modela AKI u oba modela (Slika 1D-E). Imunofluorescentno bojenje i rezultati PCR-a u stvarnom vremenu pokazali su da upotreba FICZ-a značajno smanjuje ekspresiju i transkripciju lipokalina povezanog s neutrofilnom želatinazom (NGAL), biomarkera oštećenja bubrega, u ozlijeđenihbubrega(Slika 2A-D). Slično, FICZ je također inhibirao razinu mRNA izazvanu glicerolomozljeda bubregamolekule 1 (KIM1) nakon ubrizgavanja glicerola (Slika 2A).
Dalje smo ispitali transkripciju i ekspresiju AhR ububregtkiva. Na slici 3, rezultati rt-PCR, western blottinga, imunohistokemije i imunofluorescentnog bojenja inhibirali su značajno smanjenje razine mRNA i proteina AhR u obje skupine za modeliranje AKI. Intraperitonealna injekcija FICZ-a značajno je stimulirala njegovu transkripciju i ekspresiju u skupinama glicerol plus FICZ i I/R plus FICZ. Kako bubrežne tubularne epitelne stanice igraju vitalnu ulogu u AKI,28 testirali smo može li se AhR eksprimirati u tubularnim epitelnim stanicama. Rezultati imunokemije pokazali su da je AhR uglavnom izražen u bubrežnim tubulima (Slika 3C-D). Osim toga, presjeci bubrežnog tkiva obojeni su lektinom, markerom za proksimalne tubularne epitelne stanice, AhR i DAPI za jezgre. Kao što je prikazano na slici 3E-F, AhR se spojio s lektinom, što ukazuje da se AhR uglavnom eksprimira u proksimalnim tubularnim epitelnim stanicama. Uzeto zajedno, FICZ štiti od rabdomiolize i AKI izazvanog I/R-om putem aktivacije AhR-a u ozlijeđenihbubrega.
FICZ je smanjio proizvodnju proupalnih citokina u bubrezima AKI miševaKako bi se procijenilo je li FICZ uspio pokrenuti upalu izazvanu AKI, q-PCR je korišten za otkrivanje razina transkripcije proupalnih čimbenika u bubrezima. Razine mRNA IL-1, IL-6 i TNF- u bubrežnom tkivu značajno su porasle injekcijom glicerola ili I/R ozljedom, dok je primjena FICZ-a značajno smanjila te transkripcije gena (Slika 4A). Dosljedno, povećanje IL-1, IL-6 i TNF- izazvano modeliranjem AKI-a učinkovito je oslabljeno liječenjem FICZ-om (Slika 4B-C). Ovi rezultati sugeriraju da bi FICZ mogao ublažiti upalu bubrega u modeliranju AKI.
FICZ je smanjio apoptozu stanica u bubrezima AKI miševaUz upalu, stanična apoptoza je još jedna važna značajka u patogenezi AKI. Primijenili smo TUNEL bojanje kako bismo istražili učinak FICZ-a na apoptozu bubrega kod miševa izazvanih I/R. Kao što je prikazano na slici 5B, FICZ je značajno smanjio broj TUNEL-pozitivnih stanica ububregaI/R miševa. Osim toga,
rezultati imunohistokemijskog bojenja pokazali su da je ekspresija cijepane kaspaze-3, vitalnog izvršitelja koji modificira proteine povezane s apoptozom, značajno smanjena primjenom FICZ-a u modelu rabdomiolize (Slika 5A). U međuvremenu, FICZ bi mogao smanjiti razine mRNA kaspaze-3 u modelima rabdomiolize i I/R induciranog AKI. Osim toga, rezultati Western blota pokazali su da FICZ može smanjiti ekspresiju cijepane kaspaze-3 i Bax, te povećati razinu Bcl-2 ububregaAKI miševa (Slika 5C). Ukratko, ovi su nalazi pokazali da je FICZ pokazao antiapoptotske učinke ububregaAKI miševa.
FICZ je potisnuo NF-κB i JNK signalizaciju u bubrezima AKI miševa
Aktivacija signalnih putova dodatno je ispitana Western blotting analizom kako bi se otkrio protuupalni i antiapoptotski mehanizam FICZ-a ububregaAKI miševa. Kao što je prikazano na slici 6, razine fosforilacije IκB i P65 u bubrezima AKI miševa bile su očito više od onih skupina tretiranih s FICZ-om. Nadalje, prethodne studije su razjasnile da JNK signalizacija može modulirati apoptozu i djelovati s NF-κB signalizacijom.29 Otkrili smo da je fosforilacija JNK bila izrazito viša u usporedbi s odgovarajućim kontrolnim skupinama, dok ih je tretman FICZ-om učinkovito preokrenuo. Uzeti gore, ovi rezultati impliciraju da su putevi NF-κB i JNK pridonijeli protuupalnoj i anti-apoptotskoj aktivnosti FICZ-a u bubrezima AKI miševa.
FICZ je zaštitio HK-2 stanice od stimulacije mioglobina i H/R ozljede inhibicijom upale i apoptozeSvjedočili smo može li aktivacija AhR pomoću FICZ-a potisnuti upalu i apoptozu u stanicama epitela ljudskih proksimalnih tubula (HK-2) stimuliranih mioglobinom. Prvo, potvrdili smo da su in vitro ekspresije AhR u stanicama stimuliranim mioglobinom ili H/R ozlijeđenim stanicama bile značajno smanjene, dok ih je FICZ poništio (Slika 7B-D). Stopa apoptoze stanica svake skupine u modelu mioglobina detektirana je protočnom citometrijom (Slika 7A). U usporedbi s kontrolnom skupinom, nije bilo povećanja apoptoze i nekroze HK-2 stanica u FICZ skupini. Nasuprot tome, nakon stimulacije mioglobinom, HK-2 stanice pokazale su veliki broj apoptotskih stanica što čini 12,3 posto. Dok je skupina Mb plus FICZ pokazala značajno manje apoptotskih stanica. Osim toga, FICZ je smanjio ekspresiju cijepane kaspaze-3 i Bax u mioglobinom stimuliranim ili H/R ozlijeđenim HK-2 stanicama (Slika 7BD). Nadalje, povišenje proupalnih čimbenika izazvano mioglobinom ili H/R značajno je poništeno FICZ-om (Slika 7B-D). Dosljedno, razine fosforilacije P65 i JNK bile su znatno više nakon stimulacije mioglobinom ili H/R ozljede, dok ih je liječenje FICZ-om učinkovito ublažilo (Slika 7B-D). Stoga su ti rezultati pokazali da AhR agonist FICZ štiti HK-2 stanice od mioglobina i H/R putem inhibicije upale i apoptoze.
RASPRAVA
U trenutnoj studiji otkrili smo da bi agonizam AhR-a od strane FICZ-a mogao oslabitioštećenje bubregakod rabdomiolize i AKI izazvane ishemijom/reperfuzijom. AhR je uglavnom bio prisutan u proksimalnim tubularnim epitelnim stanicama, dok je AhR agonist FICZ mogao zaštititi proksimalne tubularne epitelne stanice od AKI reguliranjem upale i stanične apoptoze putem NF-κB i JNK signalnih putova. Prethodne studije su otkrile da su uremični toksini, poput indoksil sulfata, bili agonisti AhR.30 Pacijenti s CKD-om bili su izloženi tim uremičnim toksinima, stoga je AhR aktivirao i bolesnike i miševe s CKD-om.25,31 Nedavne studije su otkrile da endogeni metaboliti iz crijevne mikrobiote32 ili uremijski metabolizam mogao bi aktivirati AhR33,34 u bubrezima KBB miševa i štakora, koji su pokazali različite trendove od naših nalaza kod AKI miševa. Međutim, različiti ligandi za AhR mogu utjecati na različite nizvodne signalne putove.35 Osim toga, prethodna istraživanja o AKI pokazala su da leflunomid može aktivirati AhR u AKI izazvanom I/R-om i poboljšati patološko oštećenje bubrega reguliranjem imuniteta i inhibicijom upale.36 MiR{{ 11}}b je aktivirao AhR putem inhibicije AhR represora i zaštitio bubreg od ozljede izazvane cisplatinom.37 Baicalin je ublažio induciranu aristolohičnom kiselinom Iozljeda bubregakroz indukciju CYP1A1/2 u jetri ovisnu o AhR.38 Naši su rezultati bili u skladu s ovim prethodnim nalazima o AKI. Nadalje, agonist AhR FICZ pokazao je zaštitne učinke u različitim modelima bolesti poput metaboličkog sindroma,39 autoimunog uveitisa,22 kolitisa,23 psorijaze,24 itd.
Prema nedavnim rezultatima Huanga i suradnika,22 eksperimentalno modeliranje autoimunog uveitisa aktiviralo je puteve NF-κB i STAT1/3 i pojačalo ekspresiju nizvodno proupalnih čimbenika IL-1, IL-6 i TNF - . U međuvremenu se povećala apoptoza stanica. Uz liječenje agonistom AhR, pronađena je smanjena ekspresija proupalnih citokina i inhibicija puta NF-κB. Aktivacija AhR također je dovela do inhibicije stanične apoptoze. Ovi su rezultati bili u skladu s našim eksperimentom. Također su otkrili da je aktivacija AhR pomaknula polarizaciju makrofaga s M1 na M2. Sugerirao je da bi AhR mogao sudjelovati u imunološkoj regulaciji, što je bilo još jedno moguće objašnjenje za regulaciju nizvodno proupalnih citokina. Bilo je nekoliko izvješća o negativnoj korelaciji između AhR i podjedinice RelA (P65) ekspresije NF-κB u različitim stanicama. Koimunoprecipitacija je provedena s ukupnim staničnim ekstraktima stanica Hepa1c1c7. Budući da i AhR i NF-κB mogu biti podvrgnuti nuklearnoj translokaciji ovisnoj o signalu, a nije pronađeno da je ARNT povezan s P65, stoga je pretpostavljeno da je povezanost AhR i P65 primarno u citoplazmatskom odjeljku.40 Transkripcijske aktivnosti AhR i NF-κB su modulirani transkripcijskim koaktivatorima. Kao što je ranije objavljeno, došlo je do djelomičnog preklapanja između njihovih koaktivatora. Posljedično, moguće je da postoji natjecanje za vezanje koaktivatora, tako da kada se aktivira jedan put, drugi put će biti potisnut kroz natjecanje za dostupnost koaktivatora.41 Negativna korelacija ponovno je potvrđena epigenetskim istraživanjem.42 U međuvremenu, NF -κB utječe na JNK, vjerojatno putem reaktivnih kisikovih vrsta (ROS).29 Mitohondrijski ROS bi mogao promicati aktivaciju NF-κB, a JNK doprinosi stvaranju ROS-a, što zauzvrat stimulira aktivaciju JNK. Iako je detaljan mehanizam potrebno dodatno istražiti, može se pretpostaviti da postoji pozitivna korelacija između NF-κB i JNK putova.
CISTANCHE ĆE POBOLJŠATI BOLOVE BUBREGA/BUBREGA
Prethodno istraživanje43,44 otkrilo je da su kod rabdomiolize i AKI izazvane I/R, upala i apoptoza stanica bile značajno povećane u modelnim skupinama, dok su putovi NF-κB i JNK bili aktivirani. Ovi su nalazi bili u skladu s našim rezultatima. Glavni mehanizmi AKI uključivali su hipoksiju, odgovor na oksidativni stres i upalu. Mogli bi potaknuti staničnu smrt (apoptozu, autofagiju, nekrozu) ili remodeliranje tkiva. Ozljeda ili smrt stanice oslobađaju tvari s molekularnim uzorcima povezanim s oštećenjem (DAMP) i molekularnim uzorcima povezanim s patogenom (PAMP), što dodatno pogoršava upalu.45 Interakcije DAMP-a i PAMP-a sa senzorima urođenog imunološkog sustava također pojačavaju upalni odgovor.46 U u međuvremenu je stanična smrt uključujući apoptozu također bila uključena u patogenezu AKI. Ekspresije obitelji kaspaza su regulirane na gore, a višestruki antiapoptotski i proapoptotski regulatori povezani s mitohondrijima mijenjaju se tijekom AKI.26,47,48 Uzeti zajedno, upala i stanična apoptoza potiču jedna drugu i oboje imaju vitalne uloge u AKI. Otkrili smo da aktivacija AhR pomoću FICZ-a ublažava upalu i apoptozu putem inhibicije puteva NF-κB i JNK.
Međutim, postoji još nekoliko problema koje treba istražiti. Naša studija uglavnom je istraživala renoprotektivne učinke aktivacije AhR pomoću FICZ-a i njegov mogući mehanizam kod rabdomiolize i AKI izazvane I/R. Osim toga, koristili smo preventivnu primjenu FICZ-a miševima prije modeliranja AKI. Iako se način primjene široko koristio u prethodnim studijama, 49-51 razlike su postojale između pokusa na životinjama i kliničke prakse. U budućnosti, kako se ekspresija AhR mijenja nakon razvoja AKI i točnije unutarstanične lokalizacije AhR treba dalje istražiti. Iako je smanjenje fosforilacije NF-κB i JNK pod djelovanjem FICZ-a jasno, potrebni su daljnji eksperimenti s relevantnim sredstvima za blokiranje. Štoviše, da bi se bolje objasnio mehanizam, miševi s izbacivanjem AhR i prekomjernom ekspresijom potrebni su za in vivo studiju, dok su prekomjerna ekspresija i šutnja AhR potrebni za in vitro studiju. Nadalje, kako različiti ligandi utječu na različite signalne putove AhR-a treba daleko više istražiti.
