Istraživanje mehanizma Cistanche formule koja regulira piroptozu posredovanu upalom NLRP3 u liječenju kroničnog prostatitisa
Jun 05, 2025
Cilj:
Ova studija imala je za cilj istražitimehanizam kojim se biljna formula na bazi Cistancheregulira aktivacijuNLRP3 upalai inhibirapiroptozau liječenjuKronični prostatitis tipa III (CP/CPPS).
Metode:
(1) Pokus na životinjama:
Pedeset mužjaka SD štakora nasumično je raspoređeno u pet skupina: kontrolne, modelne i skupine tretirane formulom Cistanche naniska (4,9 g/kg), srednja (9,8 g/kg) i visoka (19,6 g/kg)doze, s 10 štakora u svakoj skupini. Osim kontrolne skupine, svi štakori su inducirani sProstatitis tipa IIIputem intraprostatske injekcije ekstrakta proteina prostate u kombinaciji s CFA. Nakon uspješnog modeliranja, štakori su svakodnevno primali intragastričnu primjenu ili normalne fiziološke otopine (kontrolne i modelne skupine) iliFormula na bazi Cistancheza 30 dana.
Upala tkiva prostate procijenjena je pomoćuHematoksilin-eozin (HE) bojenje. SerumIL-1iIL-18mjereni su premaELISA, dok markeri oksidativnog stresa (MDA, TRAVNJAK, iGSH-Px) procijenjeni su biokemijski.NLRP3 izrazu tkivu prostate otkriven je od straneimunohistokemija, iRazine proteina NLRP3, kaspaze-1 i GSDMDanalizirani su pomoćuWestern blot.
(2) Stanični eksperiment:
Epitelne stanice ljudske prostate (RWPE-1)bili su podijeljeni na kontrolu, model,Cistanche formula, iInhibitor NLRP3 (MCC950)skupine. Osim kontrolne skupine, sve su stanice stimulirane sLPS (100 ng/mL, 4 h)iATP (5 mmol/mL, 30 min)izazvati piroptozu. Nakon modeliranja, kontrolne i modelne skupine dobile su prazan serum, dok jegrupa Cistancheprimljeno6,25 ug/mL seruma koji sadrži lijek. Skupina inhibitora je tretirana saMCC950.
PI unosiEkspresija kaspaze-1procijenjeni su putemprotočna citometrija. oslobađanje LDHmjeren je biokemijski.Razine supernatanta IL-1 i IL-18su kvantificirani ELISA testom.Western blotkorišten je za otkrivanjeNLRP3, kaspaza-1 i GSDMDizraz.
Rezultati:
(1) Pokus na životinjama:
U usporedbi s kontrolnom skupinom, modelna skupina pokazala je značajnu upalnu infiltraciju stanica, epitelnu degeneraciju i intersticijski edem u tkivu prostate. TheSkupine tretirane cistankompokazalo je smanjenje ovih patoloških promjena ovisno o dozi.
Razine IL-1 i IL-18 u serumusu značajno povećani u skupini modela (P<0.01) i značajno smanjen uCistanche skupine niske, srednje i visoke doze (P<0.01).
razine MDAbili su povišeni u skupini modela (P<0.01), ali značajno smanjen tretmanom Cistanche (P<0.01).
Razine SOD i GSH-Pxsmanjeni su u skupini modela (P<0.05) i značajno povećan u svim skupinama liječenim Cistancheom (P<0.01, P<0.05).
Imunohistokemijapokazao povišenimNLRP3 izrazu modelnoj skupini, što je značajno smanjeno liječenjem Cistancheom.
Western blotrezultati su otkrili povećane razine proteinaNLRP3, kaspaza-1 i GSDMDu grupi modela (P<0.01), a sve je značajno inhibirao Cistanche (P<0.01).
(2) Stanični eksperiment:
TheStopa preuzimanja PI, Ekspresija kaspaze-1, ioslobađanje LDHsu značajno povećani u skupini modela (P<0.01), ali značajno smanjen u obaCistancheiMCC950grupe (P<0.01).
IL-1 i IL-18 razineu supernatantu bili su značajno povišeni u modelnoj skupini (P<0.01) i značajno smanjen uCistancheiskupine inhibitora (P<0.01).
Western blotpokazala je značajno povećanu ekspresiju proteina NLRP3, kaspaze-1 i GSDMD u skupini modela (P<0.01), koji su znatno smanjeni uCistancheiskupine inhibitora (P<0.01).
Zaključak:
TheBiljna formula na bazi cistanheima terapijski učinak naKronični prostatitis tipa IIIpoinhibiraju aktivaciju inflamasoma NLRP3, čime se smanjujeAktivacija kaspaze-1, sprječavanjeGSDMD cijepanje i piroptoza, i suzbijanjeoslobađanje proupalnih citokina. Ovi nalazi sugeriraju daCistanchemože biti obećavajućeprirodni biljni lijek za CP/CPPS, ponudaprotuupalno, antioksidativno, ipiroptoza-inhibitorefekte putem modulacijeNLRP3/kaspaza-1/GSDMDsignalni put.
ključne riječi: kronični prostatitis; Guihuang formula;NLRP3 inflamatom; piroptoza ; programirana stanična smrt
cistanche ima koristi od zdravlja prostate
Biljna formula na bazi cistanhe za kronični prostatitis: Eksperimentalna studija mehanizma i učinkovitosti
Kronični prostatitis (CP)jedno je od najčešćih stanja u urologiji i muškom zdravlju. Epidemiološke studije pokazuju da otprilike8.4%odraslih muškaraca u Kini ima simptome prostatitisa [1]. PremaNacionalni instituti za zdravlje (NIH)klasifikaciji, prostatitis je kategoriziran u četiri tipa, saProstatitis tipa III (sindrom kronične boli u zdjelici, CP/CPPS)račun za više od90%svih kroničnih slučajeva [2]. Prostatitis tipa III dovodi do boli u zdjelici i disfunkcije mokraćnog sustava te je često popraćen psihičkim tegobama kao što su tjeskoba i depresija, što značajno narušava kvalitetu života [3-4].
U tradicionalnoj kineskoj medicini (TCM), kronični prostatitis odgovara sindromima kao što su "Lin sindrom" ili "Jing Zhuo", a prvenstveno je uzrokovan patogenim čimbenicima kao što suvlaga, vrućina, zastoj krvi i stagnacija[5–7]. TheGuihuang formula, koji se tradicionalno koristi za liječenje CP/CPPS-a s vlažnom toplinom i zastojem krvi, modificiran je u ovoj studiji za korištenjeCistanchekao središnju komponentu, tvoreći romanBiljna formula na bazi cistanhe. Ova modificirana formula ima za cilj poboljšati urinarne simptome i upalu zdjelice s obojeklinička učinkovitost i sigurnost [8–10].
Cistanche tubulosa u pustinji
pilule na bazi cistanche formule sa 75% glikozida
Usluga podrške tvrtke Wecistanche-Kontaktirajte nas da biste dobili veleprodajnu cijenu
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com
Whatsapp/telefon:+86 15292862950
Pozadina i mehanizam
Naše prethodne studije pokazale su da je biljna formula na bazi Cistanche značajno ublažila lezije slične prostatitisu u modelima štakora smanjenjem patološke upale i suzbijanjem proupalnih citokina. Ovaj učinak je povezan s inhibicijomPI3KiNF-κBsignalni putovi [11].
Daljnja pozornost usmjerena je premaNLRP3 upala, multiproteinski kompleks koji regulira upalne reakcije. Aktivacija inflamasoma NLRP3 dovodi do oslobađanja upalnih citokina kao što su IL-1 i IL-18, pridonoseći upalnoj kaskadi u CP/CPPS [12-13]. Istražujući je liCistanchemože modulirati aktivaciju inflamasoma NLRP3 ključno je za razumijevanje njegoveprotuupalni mehanizamu liječenju kroničnog prostatitisa.
1. Materijali
1.1 Životinje i stanice
Muški SD štakori (stari 6 tjedana, 240–260 g) dobiveni su od SPF (Beijing) Biotechnology Co., Ltd. [SCXK (Jing) 2019-0010], smješteni u SPF uvjetima sa slobodnim pristupom hrani i vodi. Sobna temperatura održavana je na (23±2) stupnja, a vlažnost na (60±5)%. Sve postupke na životinjama odobrio je Odbor za etiku životinja bolnice Xiyuan, Kineske akademije kineskih medicinskih znanosti (Etički broj: 2020XLC005-3). normalne epitelne stanice prostate (RWPE-1, ATCC, kataloški br. IM-H299) korišteni su za in vitro eksperimente na prolazu 5.
1.2 Biljna formula
TheFormula na bazi Cistanchesastoji se od sljedećih tradicionalnih biljaka (u gramima):
Cistanche 12 g
Curcuma longa (kurkuma) 10 g
Angelica sinensis 12 g
Magnolia officinalis 10 g
Boswellia carteri (tamjan) 5 g
Commiphora myrrha (Smirna) 5 g
Lonicera japonica (Orlovi nokti) 15 g
Hedyotis diffusa 15 g
Plantago asiatica (biljka trputac) 15 g
Citrus reticulata (kora mandarine) 10 g
Biljne granule osigurao je Farmaceutski odjel bolnice Xiyuan, a proizveo ih je Kangrentang Pharmaceutical Co., Ltd. (broj serije: 19018391).
SEO ključne riječi:
Cistanche za kronični prostatitis, biljni lijek za CPPS, TCM za sindrom boli u zdjelici, Cistanche upala prostate, prirodne protuupalne biljke za muškarce, Cistanche imunološka modulacija.
1.3 Reagensi i setovi
Komplet za analizu BCA proteina (Beyotime, br. kat. P0010)
IL-1 i IL-18 ELISA kompleti (Bioswamp, kat. br. ZN2877, ZN2883)
Komplet za ispitivanje piroptoze/kaspase-1 (imunokemija, br. kat. 9145)
NLRP3 antitijela (Novus, kat. br. NBP2-12446)
CFA (potpuni Freundov adjuvans, Sigma, kat. br. C104202)
Uobičajeni reagensi: ksilen, apsolutni etanol, neutralna guma (Sinopharm)
Kompleti protiv oksidativnog stresa: SOD, MDA, GSH-Px, LDH (Nanjing Jiancheng, Cat# A001-3, A003-2, BC1190, 20121225)
Protutijela: Anti-GSDMD, Caspase-1, GAPDH (Abcam, Cat# ab219800, ab179515, ab8245)
MCC950 (inhibitor NLRP3, Selleck, kat. br. S8930)
PYCARD/ASC antitijela (Thermo, Cat# PA5-95826)
1.4 Instrumenti
Optički mikroskop (Nikon Eclipse Ti-SR, Japan)
Mikrotom (Leica RM2016, Šangaj)
Digitalni dijapozitiv skener (3D HISTECH Pannoramic MIDI, Mađarska)
Hlađena centrifuga velike brzine (Thermo Fisher IECCL31R, SAD)
Oprema za elektroforezu (CAVOY PP-1150, MP-8001, MP-3030, Peking)
Shaker inkubator (Qilinbeier TS-2000A, Jiangsu)
Kriogeni mlin (Jingxin JXFSTPRP-CL-BSC, Šangaj)
CO₂ inkubator (Sanyo MCO-20AIC, Japan)
Čitač mikropločica (Bio-Rad DNM-9602, Peking)
Biokemijski analizator (Rayto Chemray 800, Shenzhen)
Protočni citometar (Beckman CytoFLEX S, SAD)
2. Metode
2.1 Uspostavljanje modela
(1) Životinjski model
Na temelju prethodnog iskustva modeliranja, štakorski model autoimunogKronični prostatitis tipa IIIosnovao jeintraprostatična injekcijapročišćenog ekstrakta proteina prostate pomiješanog s potpunim Freundovim adjuvansom (CFA) [14]. Uspješno modeliranje određeno je patološkim značajkama uključujući: zadebljanje kapsule prostate, nestanak žljezdanih nabora, uništenje acina, značajan stromalni edem, zamućenu strukturu, masivnu infiltraciju limfocita, monocita i plazma stanica. Uočena je hiperplazija glatkih mišićnih stanica i vezivnog tkiva u septama prostate, s primjetnimvaskularna dilatacija i kongestija. Biokemijski je model potvrdiopovećani leukocitiismanjena lecitinska tijelau homogenatu prostate.
(2) Model ćelije
Slijedeći literaturna izvješća i prethodne predeksperimente [15-17], ametoda stimulacije u dva korakakorišten je za aktiviranjeNLRP3 upalau RWPE-1 ćelija. Korak 1: Stanice su tretirane sLPS (100 ng/mL)tijekom 4 sata za početak inflammasome pripreme. Korak 2: Stanice su zatim tretirane saATP (5 mmol/mL)30 minuta kao aktivacijski signal. Optimalni uvjeti modela ispitani su pomoćuStopa preuzimanja PIkao biljeg.
2.2 Grupiranje
(1) Animal Study Groups
Štakori su nasumično podijeljeni napet grupapomoću tablice nasumičnog broja:
Kontrolna skupina
Grupa modela
Cistanche formula skupine niske doze
Cistanche formula skupina srednje doze
Cistanche formula skupina visokih doza
Svaka grupa se sastojala od 10 štakora. Sve skupine osim kontrolne bile su podvrgnute modeliranju. Theekvivalentna ljudska dozaformule temeljene na Cistancheu izračunato je kao 109 ÷ 70 × 6.3=9.8 g/kg zasrednje doze, saniska dozana 4,9 g/kg ivisoka dozana 19,6 g/kg [11]. Izdan 3 nakon modeliranjaliječene skupine primale su dnevnu intragastričnu primjenu odgovarajućih dozaBiljna formula na bazi cistanheza30 uzastopnih dana, dok su kontrolna i modelna skupina dobivale jednake količine fiziološke otopine.
(2) Grupe za proučavanje stanica
RWPE-1 ćelija podijeljeno je u četiri grupe:
Kontrolna skupina: kultivirano sa praznim serumom
Grupa modela: tretirano s LPS (100 ng/mL, 4 h) i ATP (5 mmol/mL, 30 min)
grupa Cistanche: tretirano sa6,25 ug/mL ljekovitog seruma Cistanche formula
Grupa MCC950: model +NLRP3 inflamasomski inhibitor MCC950
2.3 Prikupljanje uzoraka
Nakon 30 dana tretmana štakori su anestezirani izofluranom. Krv je sakupljena iz trbušne aorte i centrifugirana na 3000 okretaja u minuti tijekom 10 minuta kako bi se izolirao serum, koji je pohranjen na -80 stupnjeva zaELISAi biokemijske analize.
Lijevi režanj prostate: fiksiran u 4% paraformaldehidu za histopatologiju, imunohistokemiju i imunofluorescenciju.
Desni režanj prostate: sačuvano utekući dušikzaWestern blot analiza.
2.4 Detekcija indeksa životinja
2.4.1 HE bojenje
Bojanje hematoksilinom i eozinom (HE) korišteno je za promatranje upalne infiltracije u tkivima prostate. Morfološke promjene u žlijezdama, kanalima i intersticijskim strukturama procijenjene su pod svjetlosnim mikroskopom.
2.4.2 ELISA za IL-1 i IL-18
Za kvantificiranje korišteni su ELISA setoviIL-1iIL-18razine u serumu štakora. Uzorci su obrađeni prema standardnom ELISA protokolu i analizirani na450 nmpomoću čitača mikropločica.
2.4.3 Biokemijska detekcija MDA, SOD, GSH-Px
Serumske razine odMDA, TRAVNJAK, iGSH-Pxmjereni su korištenjem komercijalnih setova za procjenu oksidativnog stresa u tkivima prostate.
2.4.4 Imunohistokemija (IHC) za NLRP3
Sekcije tkiva prostate podvrgnute su deparafinizaciji, vraćanju antigena, blokiranju i inkubaciji santi-NLRP3 antitijela (1:1000). Provedeno je DAB bojenje i obojeno hematoksilinom. Ekspresija NLRP3 promatrana je mikroskopski.
2.4.5 Imunofluorescencija za GSDMD
Smrznuti dijelovi prostate su inkubirani saanti-GSDMD antitijela (1:100), nakon čega slijedi fluorescentno sekundarno antitijelo i DAPI nuklearna kontraboja. Ekspresija GSDMD vizualizirana je pomoću fluorescentne mikroskopije.
2.4.6 Western blot za NLRP3, kaspazu-1, GSDMD
Protein je ekstrahiran iz tkiva prostate zaWestern blot analiza. Razine izražavanjaNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), iKaspaza-1 (1:2000)otkriveni. -aktin je služio kao interna kontrola. Kvantifikacija je provedena pomoćuSlikaJsoftver.
2.5 Detekcija mobilnog indeksa
2.5.1 Protočna citometrija za unos PI
Stanice su isprane, resuspendirane na 1×106 stanica/mL i obojene propidijevim jodidom (PI). Stope preuzimanja PI analizirane su pomoćuprotočna citometrijaiFlowJosoftver.
2.5.2 Test otpuštanja LDH
Nakon tretmana,LDHrazine u supernatantima kulture procijenjene su kao marker oštećenja stanične membrane pomoću kolorimetrijskog testa na490 nm.
2.5.3 Protočna citometrija za kaspazu-1
Stanice su fiksirane, permeabilizirane i obojene saAntitijelo kaspaza-1 (1:1000). Ekspresija je mjerena pomoćuprotočna citometrija.
2.5.4 ELISA za IL-1 i IL-18 u supernatantu
Za otkrivanje su prikupljeni mediji kultureIL-1iIL-18razine putem ELISA-e. Sadržaj proteina u staničnim lizatima kvantificiran je korištenjem BCA testa za normalizaciju razine citokina.
2.5.5 Western blot za NLRP3, kaspazu-1, GSDMD
Western blot je proveden na lizatima stanica s antitijelima protivNLRP3 (1:1000), GSDMD (1:2000), iKaspaza-1 (1:2000). Detekcija je provedena pomoću ECL-a i sustava za oslikavanje. -aktin je korišten kao kontrola opterećenja.
2.6 Statistička analiza
Podaci su analizirani pomoćuGraphPad Prism 8.0. Rezultati se izražavaju kaosrednja vrijednost ± SD. Grupne usporedbe napravljene su pomoćut-testovi nezavisnog uzorkailiJednosmjerna ANOVA. A P-vrijednost < 0,05se smatralo statistički značajnim.
