Eksperiment 3 Učinak feniletanol glikozida Cistanche Deserticola na perimenopauzalni model štakora Ⅲ

Pokus 3 Učinak feniletanol glikozida Cistanche deserticola na perimenopauzalni model štakora

1 Eksperimentalni materijali

1.1 Pokusne životinje

Wistar štakori, SPF stupanj, ženke, dobavljač Shandong Lukang Pharmaceutical Co., Ltd., broj certifikata za štakore za ovu seriju: 0017216; laboratorijski certifikat broj SYXK (Yu) 2010-001.

1.2 Eksperimentalni lijekovi

Cistanche deserticola feniletanol glikozidpripremljen je prema metodi Eksperimenta 1, a sadržaj je dosegao 66,47%. Gengnian'an kapsula, sastojci: Rehmannia glutinosa, Rehmannia glutinosa, Alisma, Ophiopogon japonicus, Scrophulariaceae, kora božura, Poria cocos, sedef, curculigo, Schisandra chinensis, magnetit, Polygonum multiflorum vinova loza, Uncaria, plutajuća pšenica, polygonum multiflorum . Funkcije i indikacije:Njegujte yin i obuzdajte yang, ublažiti nevoljei smiriti um. Koristi se kod valunga i znojenja u menopauzi, vrtoglavice, tinitusa, razdražljivosti i nesanice. Specifikacije: 0.3g po kapsuli. Upotreba i doziranje: Oralno, 3 kapsule odjednom, 3 puta dnevno. Proizvođač: Shanxi Tianxing Pharmaceutical Co., Ltd. Broj proizvodne serije: 121104. Broj odobrenja: Nacionalno odobrenje za lijek br. Z14021848.

Sojini izoflavoni i vitamin E meke kapsule, popis sastojaka: sojin izoflavon u prahu, vitamin E, suncokretovo ulje, želatina, glicerin, voda, tartrazin, titanijev dioksid. Kultni sastojci i sadržaj: Svakih 100 g sadrži 55,2 mg sojinih izoflavona (izračunato kao genistein) i 608,5 mg vitamina E. Zdravstvene funkcije: Povećava gustoću kostiju. Upute i doziranje: Uzimati 1 kapsulu 2 puta dnevno s toplom vodom. Specifikacije: 500mg×100 kapsula. Proizvođač: Weihai Ziguang Biotechnology Development Co., Ltd. Broj proizvodne serije: 13070302. Broj odobrenja: National Food Health G20080032.

KOLIKO JE POTREBNO DA CISTANCHE DJELUJE?

1.3 Eksperimentalni reagensi

Natrijeva karboksimetilceluloza, Tianjin Hengxing Chemical Reagent Manufacturing Co., Ltd., broj serije: 20120418; penicilin natrij za injekcije, North China Pharmaceutical Co., Ltd., specifikacija: 4 milijuna jedinica, broj proizvodne serije: c1206807;

Otopina formaldehida (analitički čista), Yantai Shuangshuang Chemical Co., Ltd., broj proizvodne serije: 20130902; 0,9% natrijev klorid injekcija, Henan Shuanghe Huali Pharmaceutical Co., Ltd.; specifikacija: 250ml, broj proizvodne serije: 13082405B;

Kloralhidrat, Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute, broj serije 20120827; Štakor E2 ELISA pribor za otkrivanje, R&D Company, serijski broj: 20140101A; Komplet za detekciju štakora T ELISA, R&D Company, serijski broj: 20140101A; Štakor LH ELISA set za otkrivanje, R&D Company, serijski broj: 20140101A; Komplet za otkrivanje FSH ELISA štakora, R&D Company, serijski broj: 20140101A;

2 Eksperimentalne metode

2.1 Modeliranje i primjena lijekova

Metoda modeliranja: Uzmite 100 ženki wistar štakora s tjelesnom težinom od 210~230g, nasumično odaberite 12 štakora kao praznu skupinu i podvrgnite se lažnoj operaciji, a preostale štakore će se koristiti za stvaranje menopauze modeli. Nakon što su štakori izvagani, štakori su anestezirani intraperitonealnom injekcijom 10% kloral hidrata (0,3 ml/100 g) i fiksiran im je abdominalni položaj. Zatim su štakori podrezani ispod zadnjeg rebra na leđima na sjecištu srednje aksilarne linije i oko 2 cm od bočne strane kralježnice, a zatim dezinficirani. Koža i leđni mišići su zarezani oko 1cm, au vidnom polju reza vidi se mliječnobijela sjajna masna masa u koju je usađen jajnik. Malom pincetom nježno uhvatite masnu masu i izvucite je iz reza, odvojite masnu masu i vidjet ćete skupinu tankih, nepravilnih, žuto-crvenih jajnika. Prilikom rezanja, najprije podvežite jajovod (uključujući mast) ispod jajnika tankim koncem, potpuno uklonite lijevi jajnik i uklonite 80% desnog jajnika. Nakon operacije rogovi maternice vraćeni su u trbušnu šupljinu, mišići i koža su zašiveni, a na isti način su odstranjena oba jajnika. Nakon operacije, životinje su pažljivo uzgajane i intramuskularno im je injicirano 200,000 u/kg penicilina (0,1 ml svaka) kako bi se spriječila infekcija, jednom dnevno tijekom 3 uzastopna dana. 5 dana nakon operacije započet je pregled vaginalnog brisa štakora jednom po jednom, jednom dnevno tijekom 5 uzastopnih dana. Štakori s estrusnim reakcijama u razmazu su odbačeni. Odabrana su 72 potpuno kastrirana štakora i nasumično podijeljena u 6 skupina. U eksperimentalne svrhe, to su modelna skupina, skupina Gengnianan, skupina sojinih izoflavona i skupina velikih, srednjih i malih doza Cistanche deserticola feniletanol glikozida.

Metoda pripreme: Metoda pripreme: {{0}}.5% CMC Metoda pripreme: Izvažite 4g natrijeve karboksimetilceluloze i pomiješajte s destiliranom vodom da dobijete 800ml. Doze velikih, srednjih i malih doza skupine feniletanol glikozida Cistanche deserticola bile su 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg, odnosno 33,33 mg/kg (volumen primjene 1 ml/100 g). Način pripreme: Odvažite 1333,3 mg, 666,7 mg odnosno 333,3 mg ukupnih flavonoida maline, otopite ih s malom količinom 0,5% CMC-a, zatim dovedite volumen do 100 ml, dobro promiješajte i to je to. Gengniangan kapsule (450 mg/kg, pomiješane s destiliranom vodom do 45 mg/ml, 1 ml/100 g, što odgovara 10 puta većoj kliničkoj dozi); Način pripreme: Uzmite 15 kapsula Gengnianan, prvo ih otopite s malom količinom 0,5% CMC-a, zatim dovedite volumen na 100 ml i dobro promiješajte, što je doza suspenzije kapsula Gengnianan (450 mg/kg). Meke kapsule sojinog izoflavona vitamina E (166,67 mg/kg, koristite destiliranu vodu da dobijete 16,67 mg/ml, 1 ml/100 g, što odgovara 10 puta većoj kliničkoj dozi); Metoda pripreme: uzmite 4 meke kapsule sojinog izoflavona vitamina E, prvo otopite s malom količinom 0,5% CMC-a, zatim podesite volumen na 120 ml i dobro promiješajte da dobijete dozu suspenzije meke kapsule sojinog izoflavona vitamina E (16,67 mg/kg). ).

Metoda primjene: Životinje u svakoj skupini dobile su odgovarajuće lijekove 10. dan nakon operacije. Skupina s slijepom probom i modelna skupina su davane istim volumenom 0,5% otopine CMC (volumen sonde bio je 1 ml/100 g), a skupina koja je primala Gengnianan je davana suspenzijom Gengnianan kapsule (450 mg/kg, što je ekvivalentno 10 puta većoj kliničkoj dozi). ). ), skupini koja je primala izoflavone iz soje peroralno je primijenjena suspenzija meke kapsule vitamina E izoflavona iz soje (166,67 mg/kg, što je ekvivalentno 10 puta većoj kliničkoj dozi), te velika, srednja i mala dozaCistanche deserticola feniletanol glikozidskupinama su oralno primijenjene prema skupini. Velike, srednje i male doze feniletanol glikozida Cistanche deserticola (doze su 133,33 mg/kg, 66,67 mg/kg i 33,33 mg/kg, volumen doze je 1 ml/100 g), primijenjene jednom dnevno intragastričnom primjenom, kontinuirano . lijek 30 dana.

2.2 Predmeti promatranja i metode otkrivanja

Horizontalno-vertikalni rezultati kretanja štakora u svakoj skupini izmjereni su 29 dana nakon primjene. 2 sata nakon posljednje želučane primjene (natašte 15 sati), izvadite očne jabučice za prikupljanje krvi, odvojite serum iplazma, te izmjeriti sadržaj E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP u serumu, te sadržaj -EP u plazmi; štakori su secirani. Uklonite timus, slezenu, maternicu i preostalih 20% tkiva jajnika, izvažite njihovu vlažnu težinu i izračunajte indeks organa za timus, slezenu i maternicu (indeks organa=mokra težina organa mg/težina štakora g) , a zatim ukloniti mozak. Za hipotalamus i hipofizu, homogenati tkiva pripremljeni su iz hipotalamusa, hipofize i 1/2 maternice, a sadržaj estrogenskih receptora u hipotalamusu, hipofizi i homogenatima tkiva maternice i androgena određen je sadržaj receptora u homogenatima hipotalamičkog tkiva. Timus, slezena, maternica i jajnik su fiksirani u 10% otopini formaldehida, uklopljeni u parafin, izrezani i obojeni HE. Thehistomorfološke promjeneu svakoj skupini promatrani su pod svjetlosnim mikroskopom.

2.2.1 Ispitivanje metodom otvorenog polja

Eksperimentalni uređaj je kubična otvorena kutija visine 40 cm te duljine i širine 80 cm. Okolni zidovi i dno su crni. Dno se sastoji od 25 blokova jednake površine, podijeljenih bijelim linijama. Tijekom eksperimenta, štakor je stavljen u kvadratić u sredini otvorene kutije, a rezultat vodoravne aktivnosti broja blokova koje je štakor prešao na dnu unutar 5 minuta (mogu se prebrojati kvadrati sa sve četiri šape), i koliko su puta stražnji udovi stajali uspravno (dvije prednje šape bile su u zraku). (ili držanje za zid) rezultat vertikalne aktivnosti. Izmet se mora potpuno ukloniti nakon svakog eksperimenta, a svaki štakor se mjeri jednom 2 sata nakon primjene. Ovaj eksperiment je proveden u tihoj sobi.

2.2.2 Metoda određivanja kompleta

Uzmite uzorke seruma: Koristite epruvete bez pirogena i endotoksina. Izbjegavajte bilo kakvu stimulaciju stanica tijekom operacije. Nakon uzimanja krvi, centrifugirajte je na 3000 okretaja u minuti 10 minuta kako biste brzo i pažljivo odvojili serum i crvena krvna zrnca. Uzmite uzorke plazme: antikoagulirane epruvete s antikoagulansom heparina. Centrifugirajte na 3000 okretaja u minuti 30 minuta i uzmite supernatant. Pribavite uzorke homogenata tkiva: dodajte odgovarajuću količinu fiziološke otopine u tkivo i zgnječite ga. Centrifugirajte na 3000 okretaja u minuti 10 minuta i uzmite supernatant.

Metoda određivanja štakorskog (Rat) estradiola (E2) ELISA kompleta ista je kao u eksperimentu 2. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pmol/L.

Metoda određivanja štakorskog (štakorskog) testosterona (T) ELISA kompleta ista je kao metoda određivanja estradiol ELISA kompleta. Koncentracije standarda (S{{0}}S5) su {{10}}, 2{{20}}, 40, 80, 160 i 320 pg /mL. Metoda određivanja kompleta za otkrivanje luteinizirajućeg hormona (LH) štakora (LH) ELISA je ista kao metoda određivanja kompleta za otkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 3, 6, 12, 24 i 48 ml/ml. Metoda određivanja štakorskog (Rat) folikul-stimulirajućeg hormona (FSH) ELISA kita ista je kao metoda određivanja estradiola ELISA kita. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 0,75, 1,5, 3, 6 i 12 IU/L. Metoda određivanja kompleta za otkrivanje hormona koji otpušta gonadotropin (GnRH) štakora (štakora) ELISA je ista kao metoda određivanja kompleta za otkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 5, 10, 20, 40 i 80 mlU/ml.

Metoda određivanja pribora za otkrivanje osteokalcina štakora (BGP/OCN) ELISA ista je kao metoda određivanja pribora za otkrivanje ELISA testa estradiola. Koncentracije standarda (S{{0}}S5) su 0, 0.75, 1,5, 3, 6 i 12 ng/ml. Metoda određivanja kompleta za otkrivanje štakora (Rat) -endorfina (-EP) ELISA je ista kao metoda određivanja kompleta za otkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 3, 6, 12, 24 i 48 pg/mL. Metoda određivanja kompleta za otkrivanje estrogenskog receptora (ER) štakora (ER) ELISA je ista kao metoda određivanja kompleta za otkrivanje ELISA testa estradiola. Koncentracije standarda (S{{20}}S5) su 0, 4, 8, 16, 32 i 64 pg/mL. Metoda određivanja kompleta za otkrivanje androgenog receptora (AR) štakora (Rat) ELISA je ista kao metoda određivanja kompleta za otkrivanje estradiola ELISA. Koncentracije standarda (S0-S5) su 0, 25, 50, 100, 200 i 400 pg/mL.

2.3 Metode statističke obrade

Za analizu podataka korišten je medicinski statistički paket SPSS17.0 za statističku obradu podataka. Podaci mjerenja izraženi su kao srednja vrijednost ± standardna devijacija (-x±s). Za usporedbu između skupina korištena je jednosmjerna analiza varijance. Za testiranje homogenosti varijanci korištena je LSD metoda. , Games-Howell test korišten je za nejednake varijance, a Ridit test korišten je za podatke o ocjenama.

Iz tablice 11 i slike 14 može se vidjeti da su u usporedbi sa slijepom skupinom, indeks timusa, indeks slezene i indeks maternice štakora u modelnoj skupini bili značajno smanjeni (P<0.01), indicating that the perimenopausal rat model was caused by incomplete removal of the ovaries. Atrophy of the thymus, spleen, and uterus occurs. Compared with the model group, each medication group can significantly improve the thymus and spleen index of perimenopausal model rats (P<0.01), and the Gengnianan, soy isoflavones, large and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside groups can significantly improve The uterine index of perimenopausal model rats was increased (P<0.01), and the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group significantly increased the uterine index of perimenopausal model rats (P<0.05).

3 Učinci na razine biokemijskog indeksa krvi kod štakora modela perimenopauze

Sadržaj E2, T, LH, FSH, GnRH i BGP u serumu i sadržaj -EP u plazmi štakora u svakoj skupini prikazani su u tablicama 12-13 i slikama 15-17.

Iz tablica 12~13 i slika 15~18 može se vidjeti da su u usporedbi sa slijepom skupinom, razine E2 i T u serumu štakora u modelnoj skupini bile značajno smanjene (P<0.01), and the LH and FSH levels were significantly increased (P<0.01 ), indicating that incomplete ovarian removal causes sex hormone disorders in the perimenopausal rat model, and the perimenopausal rat model was successfully replicated. Compared with the model group, each medication group could significantly increase serum E2 and T levels (P<0.01) and reduce FSH levels; the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside, soybean isoflavones, and menganianan groups could significantly reduce the elevated levels. The LH level in the high-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group can be significantly reduced (P<0.05); the elevated LH level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group has a decreasing trend.

Tablica 14 Učinak feniletanol glikozida Cistanche deserticola na razine GnRH u serumu i -EP u plazmi kod perimenopauzalnog modela štakora (-x±s)

Iz tablice 14 i slika 19-20 može se vidjeti da je u usporedbi sa slijepom skupinom, razina GnRH u serumu štakora u modelnoj skupini bila značajno povećana, a razina -EP u plazmi značajno smanjena (P<0.01), indicating that incomplete removal of the ovaries caused The perimenopausal rat model has sex hormone disorders, and related hormones secreted by the hypothalamus are also disordered due to negative feedback regulation. Compared with the model group, the GnRH levels in each medication group were significantly reduced (P<0.01), and the β-EP levels in the medium-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group, soybean isoflavones group, and menanianan group were significantly increased (P<0.01). 0.01), the plasma β-EP level in the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group could be significantly increased (P<0.05).

4 Učinci na sadržaj ER i AR u tkivima perimenopauzalnih modela štakora

Sadržaj ER i AR u relevantnim tkivima štakora u svakoj skupini prikazan je u tablicama 16-17 i slikama 22-23.

Iz tablice 17 i slike 23 može se vidjeti da je u usporedbi s slijepom skupinom razina AR u hipotalamusu modelne skupine bila značajno niža (P<0.01), indicating that the androgen receptors distributed in the hypothalamus of the perimenopausal rat model caused by incomplete ovary removal body, thereby reducing the biological effects of androgens. Compared with the model group, the AR levels in the hypothalamus of the large- and medium-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, Gengnianan group, and soybean isoflavone group were significantly increased (P<0.01). The hypothalamic AR level of the low-dose Cistanche deserticola phenylethanol glycoside group was rising trend.

5 Učinci na morfologiju tkiva organa kod štakora modela perimenopauze

Rezultati patološkog i histološkog promatranja maternice, timusa i slezene štakora u svakoj eksperimentalnoj skupini su sljedeći. Patološke fotografije prikazane su u Dodatku 1 za patološke fotografije modela štakora u perimenopauzi.

5.1 Učinak na morfologiju tkiva maternice kod perimenopauzalnih modela štakora

Prema različitim stupnjevima promjena u endometriju, žlijezdama i miometriju štakora u svakoj pokusnoj skupini, polukvantitativni standardi korišteni su za podjelu patološke morfologije tkiva u četiri razine, a maternice štakora u svakoj pokusnoj skupini su izmjereno. Rezultati promatranja prikazani su u tablici 18.

"-" Epitelne stanice endometrija, žlijezde, miometrij i seroza su normalni; "+" epitelne stanice i žlijezde endometrija su atrofirane, a miometrij i seroza su normalni; "++" epitel endometrija Stanice i žlijezde su djelomično atrofirane, mišićni sloj je blago atrofiran, a seroza je normalna; "+++" endometrijske epitelne stanice i žlijezde značajno su atrofirane, a seroza je normalna.

Nakon Ridit testa, iz tablice 18 može se vidjeti da je u usporedbi sa slijepom skupinom maternica štakora u modelnoj skupini pokazala značajne patološke lezije tkiva (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the uterine pathological tissue lesions of mice (P<0.01).

5.2 Učinak na morfologiju tkiva jajnika kod štakora u modelu perimenopauze

U skladu s različitim stupnjevima promjena u folikulima, žutom tijelu, granuloznim stanicama i krvnim žilama u jajnicima štakora u svakoj skupini pokusa, korišteni su semikvantitativni standardi da se patološka morfologija tkiva podijeli na četiri razine. Mjereni su i promatrani jajnici štakora u svakoj skupini pokusa. Rezultati su prikazani u tablici 19.

Tablica 19 Učinak feniletanol glikozida Cistanche deserticola na patološke promjene jajnika kod štakora u modelu perimenopauze Jedinica: samo

"-" može pokazati rastuće folikule, zrele folikule i žuto tijelo na svim razinama. Žuto tijelo je dobro razvijeno, s mnogo slojeva granuloznih stanica, bogatom folikularnom tekućinom i bogatim krvnim žilama; "+" može pokazati rastuće folikule, zrele folikule i žuto tijelo, ali je broj zrelih folikula i žutog tijela mali. , folikuli su manji, a granulozne stanice manje slojevite; "++" može prikazati zrele folikule i žuto tijelo, s više žutog tijela, manje granuloznih stanica i manje krvnih žila; "+++" nema folikule, više žutog tijela, a jajnik je atrofičan, avaskularan.

Nakon Ridit testa, iz tablice 19 može se vidjeti da su u usporedbi sa slijepom skupinom, jajnici štakora modelne skupine pokazali značajne patološke lezije tkiva (P<0.01). Compared with the model group, each medication group could significantly improve the ovarian pathological tissue lesions of rats (P<0.01).

5.3 Učinci na morfologiju tkiva timusa i slezene u modelu štakora u perimenopauzi

Koristeći mikrometar, izmjerite debljinu najdebljih i najužih dijelova timusnog korteksa svakog štakora u svakoj eksperimentalnoj skupini kako biste dobili prosjek; Koristite osnovnu liniju mikrometra da padnete na slezene kvržica, izmjerite debljinu slezene kvržica s obje strane sa središnjom arterijom kao središtem i izračunajte prosjek. Izmjereni rezultati prikazani su u tablici 20 i na slici 24.

Iz tablice 20 i slike 24 može se vidjeti da su u usporedbi sa slijepom skupinom debljina korteksa timusa i volumen slezenskih nodula u modelnoj skupini bili značajno smanjeni (P<0.01), indicating that the thymus and spleen volumes atrophied after the perimenopausal model was created in rats. Compared with the model group, each medication group could significantly increase the thickness of the thymus cortex (P<0.01). Except for the low-dose Cistanche deserticola phenylethanoid glycoside group, all medication groups could significantly increase the volume of splenic nodules (P<0.01).