Dio 1 Učinci feniletanozida Cistanche Deserticola na ekspresiju -amiloidnog proteina u hipokampusu APP/PS1 transgenih miševa

Dio 1 Učinkoviti sastojci Cistanche: terapeutski učinak ukupnih glikozida fenetilnog alkohola i verbaskozida na Alzheimerovu bolest

Za više informacija: Ali.ma@wecistanche.com

JU Bo-wei1 ,YANG Jian-hua2 ,HU Jun-ping3*

1 Peta pridružena bolnica Medicinskog sveučilišta Xinjiang, Urumqi 830000, Kina;

2 Prva pridružena bolnica Medicinskog sveučilišta Xinjiang, Urumqi 830054, Kina;

3 Farmaceutski fakultet, Medicinsko sveučilište Xinjiang, Urumqi 830011, Kina

Sažetak:

Za proučavanje učinka feniletanoida Cistanche deserticola na ekspresiju -amiloidnog proteina u hipokampusu miševa s Alzheimerovom bolešću,60 6-mjesečni dvostruki transgeni AD miševi stari APP/PS1 nasumično su podijeljeni u modelne skupine, donepezilnu skupinu ( 0． 65 mg/kg), visoke, srednje, niske dozeukupnih glikozidaCistanche deserticola (250,125 62． 5 mg/kg) i acteoside (125 mg/kg) davani su lijekovi i destilirana voda 3 mjeseca． U dobi od 9 mjeseci Morrisov vodeni labirint i test pasivnog izbjegavanja korišteni su za utvrđivanje poremećaja učenja i pamćenja, lezije hipokampusa miševa promatrane su HE bojenjem, a ekspresije A 1-42 i A {{ 7}} proteina u hipokampusu miševa detestirano je imunohistokemijskom metodom i Western-blot metodom．Cistanche deserticola phenylethanoidmože značajno poboljšati sposobnost učenja i pamćenja te oštećenje hipokampalnih neurona kod APP/PS1 dvostrukih transgenih miševa． U usporedbi s modelnom skupinom, broj A 1-42, A 1-40 pozitivnih stanica u hipokampusu CA1Cistanche deserticolaskupini i kontrolnoj skupini značajno je smanjen, a rezultati Western-blota pokazali su da je ekspresija proteina A 1-42, A 1-40 u hipokampusu Cistanche deserticola u svakoj doznoj skupini i intervencijskoj skupini bila znatno niži od onog u modelskoj skupini. Glikozid Cistanche deserticola može zaštititi neurone i antagonizirati AD tako što smanjuje ekspresiju proteina A 1-42, A 1-40 u mozgu hipokampusa miševa． U ovoj studiji feniletanoid je identificiran kao glavna učinkovita tvar zaCistanche deserticolada ispolji svoje djelovanje protiv AD-a što daje teoretsku potporu za njegov daljnji razvoj kao novog lijeka protiv AD-a.

Ključne riječi:Cistanche deserticola; feniletanoid;Alzheimerova bolest; APP/PS1 dvostruki transgeni miševi; - amiloidni protein

Kliknite na Cistanche tubulosa prah za Alzheimerovu bolest

Alzheimerova bolestje degenerativna bolest središnjeg živčanog sustava karakterizirana progresivnim gubitkom pamćenja i kognitivnom disfunkcijom. Trenutačno, dobro poznata hipoteza kaskade -amiloidnog proteina (A ) vjeruje da normalni metaboliti A 1-42 i A 1-40 monomeri u fiziološkim uvjetima nisu neurotoksični, ali kada naiđu na APP egzogene medijatore, izazvati abnormalnosti. Nakon taloženja, akumulirani A 1-42 tvori topljive A oligomere (ADDL), koji sprječavaju monomere da proizvedu zaštitnu aktivnost i uzrokuju degeneraciju neurona, gubitak sinapsi i oštećenje aksona, te konačno uzrokuju apoptozu neurona u mozgu koja uzrokuje demenciju , stoga je istraživanje ekspresije njegovih ključnih ciljeva A 1-42 i A 1-40 proteina u mozgu od velike važnosti za istraživanje prevencije i liječenjaCistanche feniletanoidni glikozidiu AD. U isto vrijeme, proučavanje histopatološkog pregleda hipokampusa karakterističnih lezija u mozgu životinjskih modela AD može doista odražavati poboljšanje lijekova na lezijama u mozgu iz makroskopskog pogleda.

Tradicionalna kineska medicina u mojoj zemlji vjeruje u toCistanche, tradicionalni kineski lijek koji hrani bubrege i hrani esenciju, ima učinke protiv starenja, usporava starenje i poboljšava pamćenje. Velik broj preliminarnih studija potvrdio je da je ukupnafeniletanoidni glikozidi Cistanche i Acteoside, reprezentativni monomer glikozida fenetilnog alkohola, pokazuju očite antagonističke učinke na AD u in vivo ili in vitro modelima AD konstruiranim tradicionalnim metodama, te imaju određenu prevenciju i liječenje neurodegeneracije. Mogućnost spolnih bolesti. Međutim, primjena APP/PS1 dvostrukog transgenog modela Cistanche Acteoside nije korištena za provođenje istraživanja o prevenciji i liječenju AD-a iz perspektive -amiloida.

Ukratko, ova se studija temelji na klasičnoj hipotezi o patogenezi AD-hipotezi kaskadne reakcije, uz pomoć idealnog i pouzdanog AD životinjskog modela APP / PS1 dvostrukih transgenih miševa kao in vivo istraživačke platforme, koristeći Morrisov vodeni labirint i HE metoda bojenja, Western-blot, imunohistokemija i druge napredne tehničke metode, iz perspektive ponašanja životinja, histopatologije i molekularne biologije Kako bi se pronašli novi ciljevi za prevenciju i liječenje AD-a, pružit će referencu za proučavanje specifični mehanizam djelovanja Cistanche feniletanoidnih glikozida u prevenciji i liječenju AD.

1. Reagensi i instrumenti

1.1 Reagens

Cistanche tubulosa feniletanoidni glikozidi(samostalno izrađena od strane istraživačke skupine, sadržaj feniletanoidnih glikozida je 87,6 posto);Akteozid; titanijev dioksid; HE pribor za bojenje; neutralna guma; SDS-PAGE pribor za pripremu gela; Komplet za kvantifikaciju BCA proteina; A 1-40; A 1-42; -aktin; Zečji anti-kozji IgG (H plus L) obilježen alkalnom fospazom; 4 × pufer za punjenje proteina Sadrži -merkaptoetanol; 10 × TBST; PVDF membrana; SDS; Tris; glicin; obrano mlijeko u prahu; BCIP /NBT komplet; sekundarno antitijelo; Između 20.

1.2 Životinje

60 6-mjesečni APP/PS1 dvostruki transgeni miševi modela AD

I 10 negativnih legla miševa, mužjaka i ženki, tjelesne težine 20 ± 10 g, životinje slobodno jedu i piju tijekom pokusa.

1.3 Uređaji

MT-100 Morrisov vodeni labirint; gel slikovni uređaj; RM2016 bolest

Mikrotom; SIM-F124 ledomat; oprema za gel elektroforezu i prijenosnu membranu; čitač mikropločica pune valne duljine; CO2 inkubator konstantne temperature; Hladnjak od 4 stupnja i -20 stupnjeva; 67120 instrument za ultračistu vodu

; TP-114 elektronička vaga; niskotemperaturna rashlađena centrifuga velike brzine; DVKW-D-2 digitalni zaslon električno grijanje vodena kupelj konstantne temperature; ultrazvučni razarač stanica; WD-9405Aparat za dekoloraciju; podesivo napajanje konstantnim naponom i strujom; DM4000 fluorescentni invertni mikroskop.

2. Metoda

2.1 Grupiranje i administracija životinja

Prema SPSS18. 0 Nasumični brojevi generirani statističkim softverom, 1156 Natural Products Research, and Development Vol. Miševi modela 31AD nasumično su podijeljeni u skupinu modela i skupinu donepezila (dnevna infuzija)

Želučana doza je 0. 65 mg/kg), Cistanche fenetilni alkohol ukupni glikozidi (PhGs) visoke, srednje i niske doze (dnevne doze su 250, 125, 62,5 mg/kg, redom), Cistanche verbaskozid intervencijska skupina (125 mg/kg) kg ), 10 po grupi. U dobi od 6 mjeseci, miševima je dat tretman intragastričnom sondom prema skupinama, a miševima je davan intragastrično jednom dnevno tijekom 3 uzastopna mjeseca. Normalna skupina sastojala se od netransgenih miševa u istom leglu. Modelna skupina i normalna skupina dobile su jednak volumen destilirane vode sondom.

2.2 Morrisov eksperiment s vodenim labirintom

Klasični Morrisov vodeni labirint korišten je za testiranje sposobnosti prostornog učenja i pamćenja miševa. Prvog i drugog dana trenirajte miševe da budu upoznati s položajem platforme i vježbajte pronalaženje platforme. Od 3. do 5. dana provest će se formalni test kako bi se promatrala situacija miševa u svakoj skupini koji traže platformu nakon treninga. Šestog dana platforma će se ukloniti i miševi će se promatrati.

Staza za plivanje. Tijekom eksperimenta, kamera će istovremeno bilježiti vrijeme koje je miš proveo tražeći platformu (tj. escape latency) i udaljenost plivačke staze. Ako miš ne pronađe platformu unutar postavljenog vremenskog raspona (općenito postavljenog na 60 s ili 120 s, ovaj eksperiment koristi 60 s), tada se izlazna latencija miša bilježi kao postavljena vrijednost, a osoblje će ostati platformu nekoliko sekundi (u ovom eksperimentu koristi se 10 s) kako bi se produbilo pamćenje platforme. Nakon eksperimenta zabilježite vrijeme plivanja miševa od ulaska u vodu do pronalaska platforme. Posljednjeg dana eksperimenta platforma je uklonjena, a sadržaj koji je trebao biti snimljen tijekom postavljenog vremena uglavnom je uključivao broj prelaska miša preko platforme, vrijeme boravka ciljnog kvadranta itd., i strategiju pretraživanja svake pokusne životinje analizirani su.

2.3 Ekstrakcija moždanog tkiva i ugradnja parafina

Nakon primjene, miševi su izvagani i anestezirani s 10 postotnim kloralhidratom. Postavite anesteziranog miša na operacijski stol kako biste fiksirali udove. Nakon perfuzije s 4 posto paraformaldehida i fiksacije, životinje su žrtvovane, mali mozak i drugo dodatno tkivo mozga su uklonjeni, a cijeli cerebelum i mozak uklonjeni su duž kraja moždane hemisfere.

Prednja polovica središnje krune. Fiksirajte u 4 posto paraformaldehida 24 sata, isperite ultračistom vodom 10 minuta, a zatim stavite 30 posto etanola (1 h) → 40 posto etanola (1 h) → 50 posto etanola (1 h) → 75 posto etanola (1 h) ) → 90 postotni etanol (1 h) → 95 postotni etanol (1 h) → bezvodni etanol I (1 h) → bezvodni etanol II (1 h) → ksilen I (15 minuta) → ksilen II (15 minuta). Nakon što su bila uronjena u parafin tijekom 2 sata, tkiva su ugrađena u kontinuirane koronalne presjeke u području CA1 hipokampusa mišjeg mozga. Nakon sušenja u pećnici na 60 stupnjeva 48 sati, čuvati na sobnoj temperaturi.

2.4 HE bojenje

Pecite kriške odabrane u svakoj skupini u pećnici na 60 stupnjeva 40 minuta, a zatim ih stavite u ksilen I (5 min) → ksilen II (10 min) → apsolutni etanol (5 s) → 95 postotni etanol I (5 s) → 95 postotni etanol II (5 s) → 80 postotni etanol (5 s) → destilirana voda

Drugo, upotrijebite komplet za bojenje HE za bojenje i postavljanje stakalca neutralnom gumom.

2.5 Imunohistokemijsko bojenje

Pripremljeni rezovi podvrgnuti su imunohistokemijskom bojenju u skladu sa standardnim koracima deparafinacije, pronalaska antigena, blokiranja endogene katalaze, blokiranja seruma, primarne inkubacije protutijela, sekundarne inkubacije protutijela, razvoja DAB boje, dehidracije i postavljanja. Odaberite 6 odgovarajućih rezova za svaku skupinu, promatrajte finoću neurona pod elektronskim mikroskopom

Morfologija stanica, bojanje i brojanje pozitivnih stanica hipokampusa pomoću softvera Image J.

2.6 Western blot analiza ekspresije proteina

Aspirirajte supernatant tkiva kako biste odredili sadržaj proteina ekstrahiranog iz hipokampusa moždanog tkiva prema metodi kvantifikacije proteina BCA. Pomiješajte ga s 4× puferom za punjenje proteina u omjeru 4:1, zagrijavajte na 95 stupnjeva 10 minuta, ohladite prirodnim putem i pohranite u hladnjak na -20 stupnjeva. Pripremite SDS-PAGE gel, dodajte otopinu za elektroforezu i zatim redom dodajte normalnu skupinu, skupinu za intervenciju lijeka i druge histone, te dodajte proteinski marker u rupe gela s obje strane. Zaustavite elektroforezu u ledenoj kupelji do dna gela za odvajanje. Nakon što je tekućina prijenosne membrane uravnotežena, izrežite PVDF membranu i filter papir prema veličini ljepila. U stezaljci za prijenos slijedite korake crne vlaknaste podloge → 3 sloja filter papira → gel → PVDF membrana → 3 sloja filter papira → crne vlaknaste podloge za sastavljanje. Nakon uklanjanja mjehurića, prenesite membranu pri konstantnom tlaku od 80 V. Nakon završetka prijenosa filma, obrano mlijeko je zatvoreno 2 h. Razrijeđeno antitijelo se dodaje odgovarajućoj membrani i inkubira noć. Nakon inkubacije sekundarnog protutijela tijekom 2 sata, dodajte BCIP/NBT otopinu za razvijanje boje dok se boja ne razvije. BIO-RAD gel imager snima slike. Upotrijebite softver Image J za kvantitativnu analizu ciljne proteinske trake i upotrijebite IOD da označite relativnu snagu proteinske trake. Rezultat se izražava kao omjer integrirane vrijednosti optičke gustoće ciljanog proteina i kontrolnog proteina -aktina. Rezultat se izražava kao (ID ciljanog proteina/ID interne reference) × 100 posto.

2.7 Statistička analiza podataka

Koristite SPSS18. 0 Izvršite statističku analizu podataka. Podaci su predstavljeni s (x± s). Usporedba podataka između skupina koristi jednosmjernu ANOVA test i analizu, a višestruke usporedbe između podataka koriste LSD-t-test (najmanje značajna razlika, LSD). ), s P<0. 05="" or="" p=""><0. 01="" means="" that="" the="" difference="" is="" statistically="">

3 Eksperimentalni rezultati

3.1 Rezultati detekcije Morrisovog vodenog labirinta

Kako se vrijeme obuke nastavlja povećavati, vrijeme za svaku grupu miševa da dođu do platforme (kašnjenje bijega) značajno se skraćuje. Prvi i drugi dan su vrijeme treninga. Trećeg dana, latencija bijega modelne skupine bila je značajno dulja od one normalne kontrolne skupine (P<0.01); the="" fourth="" and="" fifth="" days="" were="" compared="" with="" the="" normal="" control.="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" escape="" latency="" of="" the="" mice="" in="" the="" donepezil="" group="" was="" significantly="" shorter="" than="" that="" of="" the="" model="" group="" (p=""><0.05); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" glycosides="" of="">cistanchefenetilni alkohol U svakoj doznoj skupini iAkteozidiskupini, kako se doza povećavala, latencija bijega kod miševa bila je značajno skraćena, sa značajnim razlikama (P<0.05) (see="" table="">

Šestog dana eksperimenta vodenog labirinta, platforma je uklonjena za eksperiment istraživanja svemira i zabilježen je broj puta koliko je svaka skupina miševa prešla položaj platforme unutar 60 s. Iz rezultata je vidljivo da je broj puta prelaska platforme u modelnoj skupini unutar zadanog vremena značajno smanjen u usporedbi s normalnom skupinom (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" total="" glucoside="" groups="" and="" mullein="" the="" number="" of="" times="" of="" crossing="" the="" platform="" in="" the="" glycoside="" group="" was="" significantly="" increased="" (p=""><0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 2).="" the="" above="" research="" results="" all="" suggest="" that="">Cistanche feniletanoidni glikozidimože značajno poboljšati sposobnost učenja i pamćenja APP/PS1 dvostrukih transgenih AD miševa i ima određenu ovisnost o dozi.

3.2 Rezultati promatranja patološkog bojenja tkiva

Rezultati pokazuju da su neuroni u CA1 području hipokampusa u normalnoj skupini raspoređeni uredno i tijesno, raspoređeni ravnomjernije, s jasnim slojevima, a jezgra stanica tijela kralješka je veća i oblika je približno okruglog. Međutim, CA1 područje hipokampusa miševa modelne skupine bilo je oštećeno, što je rezultiralo očitim promjenama u neuronskim stanicama i morfologiji, raspored je bio labav i kaotičan, nije bilo očite hijerarhije, veze između stanica bile su labave, a neke jezgre pojavila se piknoza i apoptoza, čineći bojenje dubljim. Hipokampalne CA1 stanice različitih dozaCistanche fenethanolosideintervencijska skupina, donepezil skupina i intervencijska skupina verbaskozid poboljšale su se u različitim stupnjevima. Piknotične i duboko obojene neuronske stanice značajno su smanjene u usporedbi s modelnom skupinom, ali veće se i dalje mogu vidjeti u međustaničnom prostoru (vidi sliku 1).

3.3 Rezultati imunohistokemijskog pokusa

Nakon tretmana s Cistanche fenetil alkoholnim glikozidima, uzet je devet mjeseci star APP/PS1 dvostruki transgenični isječak moždanog tkiva miša, a CA1 područje hipokampusa podvrgnuto je A 1-40 imunohistokemijskom bojenju. Rezultati su pokazali da su pozitivne stanice uglavnom kružne u vidnom polju. Većina staničnih membrana je smeđe-žuta. U usporedbi s normalnom skupinom, broj A 1-40 pozitivnih stanica u području CA1 hipokampusa modelne skupine značajno se povećao (P<0.01); compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" total="" phenethyl="" alcohol="" glycosides="" of="">Cistanche tubulosabio visok. Broj pozitivnih stanica u skupini sa srednjom dozom i skupini koja je primala akteozid glikozid bio je značajno smanjen (P<0.01), the="" donepezil="" group,="" and="" the="">Cistanche feniletanoidni glikozidiniska doza.

Broj A 1-40 pozitivnih stanica u doznoj skupini značajno je smanjen (P<0.05), with="" significant="" differences="" (see="" table="" 3,="" figure="">

Nakon intervencije feniletanoidnih glikozida Cistanche, uzeta su moždana tkiva 9-mjesečnih dvostrukih transgenih miševa APP/PS1, a CA1 područje hipokampusa obojeno je A 1-42 imunohistokemijskim bojanjem. Rezultati su pokazali: U usporedbi sa skupinom modela,Cistanche feniletanoidni glikozidiBroj pozitivnih stanica u svakoj doznoj skupini glikozida i skupini akteozidnog glikozida značajno je smanjen, uz značajnu razliku (P<>

3.4 Rezultati Western-blot testa

Western-blot metoda korištena je za otkrivanje ekspresije A 1-40 i A 1-42 proteina u hipokampusu miševa. Rezultati su pokazali da je ekspresija proteina A 1-40 i A 1-42 u hipokampusu modelne skupine bila značajno pojačano regulirana u usporedbi s normalnom skupinom, te je postojala značajna razlika (P < {{="" 6}}.="" 05).="" ekspresija="" proteina="" hipokampusa="" a="" 1-40="" i="" a="" 1-42="" u="" miševa="" u="" intervencijskoj="">Cistanche feniletanoidni glikozidiverbaskozidintervencijskoj skupini bili su značajno niže regulirani u usporedbi s miševima u modelnoj skupini (P<0.01), and="" there="" was="" a="" significant="" difference="" (p=""><0.01). 01),="" see="" figure="">