Učinak feniletanol glikozida na faktor rasta koji se transformira – P1/Smads signalni put u fibroblastima humanog hipertrofičnog ožiljka

Utjecaj feniletanoidnih glikozida na faktor rasta koji se transformira – p1/Smads signalni put u ljudskim hipertrofnim fibroblastima ožiljaka

Za više information:Ali.ma@wecistanche.com

[Sažetak]Cilj Na temelju faktora rasta koji se transformira - pl (TGF - pl)/Smads signalni put za istraživanje učinakafeniletanoidni glikozidiodcistanche tubulosa(CPHG) na ljudskim hipertrofnim fibroblastima ožiljaka (HSFbs) i mogućem mehanizmu. Metode Od ožujka do lipnja 2019. primljeno je 9 pacijenata s hipertrofičnim ožiljkom nakon guze. Fibroblasti su izolirani od hipertrofičnog ožiljka i kultivirani. Ljudski hipertrofični ožiljci su uklonjeni, a fibroblasti su kultivirani in vitro. Postavljena je prazna skupina, skupina modela, pozitivna kontrolna skupina (TGF - pl + 5 - fluorouracil) i eksperimentalna skupina (TGF - pl + CPhGs). Učincifeniletanoidni glikozidiodcistanche tubulosau različitim koncentracijama na proliferaciju HSFb-a otkriveni su kompletom za brojanje stanica - 8 (CCK - 8) test. Izraz Smad2, Smad3, Smad7, kolagena I (COL -1) i kolagena HI (COL -3) mRNA otkriven je u stvarnom vremenu kvantitativnom obrnutom transkripazom - lančana reakcija polimeraze (RT - qPCR) u svakoj skupini. Ekspresija Smad2, Smad3, fosforiliranih Smad2 (p - Smad2), fosforiliranih Smad3 (p - Smad3), Smad7, COL -1 i COL - 3 proteina otkrivena je zapadnjačkim nadutošću. Podaci mjerenja izraženi su kao srednja vrijednost ± standardne devijacije (srednja vrijednost ± SD). Više skupina uspoređeno je koristeći jedan - način ANOVA. Rezultati Stopa inhibicije fibroblasta nakon tretmana CPHG-ovima na 60 , 90 i 120 mg/L za 48 h bila je (36,87 ±0,06)% u odnosu na (43,52 ±0,04)% naspram (78,11 ±0,03)% , F vrijednost =45.070, P<0.01. the="" inhibitory="" effects="" of="" cphgs="" on="" fibroblasts="" increased="" with="" the="" increase="" of="" drug="" concentration="" and="" the="" prolonga­tion="" of="" action="" time.="" rt="" -="" qpcr="" results="" showed="" that="" as="" compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" expression="" of="" col="" -1,="" col="" -="" 3,="" smad2,="" smad3="" mrna="" was="" reduced,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" mrna="" was="" in­creased="" in="" the="" experimental="" and="" positive="" control="" groups="" (0.21="" ±="" 0.04="" vs.="" 0.3="" ±0.25="" vs.="" 1.56="" ±="" 0.01,="" f="" value="39.755,"><0.01), (0.55="" ±0.04="" vs.="" 0.27="" ±0.04="" vs.="" 1.66="" ±0.22,="" f="" value="61.991,">< 0.01),="" (0.55="" ±0.03="" vs.="" 0.78="" ±0.76="" vs.="" 1.06="" ±0.15,="" f="" value="17.769,"><0.01), (0.46="" ±0.08="" vs.="" 0.55="" ±="" 0.10="" vs.="" 2.05="" ±="" 0.29,="" f="" value="56.796," p="">< 0.01),="" (1.77="" ±="" 0.59="" vs.="" 0.11="" ±="" 0.02="">

0,04 ± 0,04, F vrijednost = 14,780, P< 0.05)="" ；="" western="" blotting="" results="" showed="" that="" the="" protein="" expression="" of="" p-smad2="" and="" p="" -smad3,="" col="" -="" 1,="" col="" -3,="" in="" the="" experimental="" group="" and="" positive="" control="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" in="" the="" model="" group,="" and="" the="" expression="" of="" smad7="" protein="" was="" significantly="" high­er="" than="" that="" in="" the="" model="" group="" (0.="" 16="" ±="" 0.03="" vs.="" 0.="" 11="" ±="" 0.02="" vs.="" 0.06="" ±="" 0.00),="" (0.="" 12="" ±="" 0.02="">

0.07 ± 0.01 naspram 0.04 ±0.01, F vrijednost =7.670, P< 0.05),="" (0.12="" ±0.03="" vs.="" 0.15="" ±0.06="" vs.="" 0.23="" 土="" 0.05,="" f="" value="3.936,"><0.05), (0.27="" ±0.02="" vs.="" 0.08="" ±0.01="" vs.="" 0.05="" ±0.04,="" f="" value="34.291," p="">< 0.01),="" (0.33="" ±0.02="" vs.="" 0.16="" ±0.02="" vs.="" 0.17="" ±0.01="" f="" value="16.322,"><0.01). conclusion="" cphg="" inhibited="" hypertrophic="" scar="" fibroblasts="" proliferation="" and="" activation="" via="" blocking="" the="" tgf="" -="" pl/smad="">

[Ključne riječi] Feniletanoidni glikozidiodcistanche tubulosa； Hipertrofični fibroblasti ožiljaka; Transformirajući faktor rasta - pl/Smads signalni put

Kliknite na cistanche deserticola ma i Cistanche proizvode

Hipertrofični ožiljci (HS) je fibrotička bolest kože koju karakterizira prekomjerna proliferacija fibroblasta (FBS), kao i taloženje izvanstanične matrice (ECM), koje su glavne razvojne stanice za stvaranje ožiljaka, može izlučiti velike količine kolagena, a transformirajući faktor rasta (TGF) - P / Smads signalni put usko je povezan s formiranjem HS-a.Cistanchetradicionalna je tonička tradicionalna kineska medicina, čiji je ekstrakt feniletanoidne octene kiseline (cphgs) jedan od glavnih sastojaka koji djeluje na lijekove i ima različite biološke funkcije kao što su anti-upala, antitumorski, anti-zračenje, čišćenje slobodnih radikala itd. Studije su pokazale da cphgs mogu inhibirati proliferaciju jetrenih zvjezdastih stanica, te da to može učiniti smanjenjem ekspresije Smad2, Smad3, Povećanje ekspresije Smad7 time je blokiralo tgf-p / Smads signalnu transdukciju puta, a zatim odgodilo napredovanje fibroze jetre. Cilj ovog istraživanja bio je promatrati učinke na ekspresiju gena i proteina povezanih s ljudskim hipertrofnim fibroblastima ožiljaka (hsfbs) na temelju signalnog puta TGF PL / Smad.

Materijali i metode

1. Materijali:Cistanchecphgs su kupljeni od Hechen Pharmaceutical Biotech Co., Ltd., Hetian, Kina; Fetalni goveđi serum kupljen je od Clark Bioscience, SAD; Komplet za brojanje ćelija TGF PL kupljen je od pepro techa, SAD; Fluorescencijski kvantitativni PCR komplet kupljen je od takara korporacije u Japanu; Svi kompleti za obrnutu transkripciju kupljeni su od Thermo Fisher Scientific, SAD; Smad2 / 3, p-Smad2 / 3 antitijela kupljena su od tehnologije signalizacije stanica, SAD; Protutijela na Smad7, COL-1, COL-3, gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazu (gap-dh) kupljena su od abeama (UK); Membrane od polivinilidenskog fluorida (PVDF) kupljene su od milipora u SAD-u.

2. Svi su slučajevi odabrani s Odjela za ortopediju, Prve pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta u Xinjiangu, a tri primjerka (od kojih su svi patologijom definitivno dijagnosticirani kao hipertrofični ožiljak) nasumično su odabrana za primarnu kulturu FBS-a; Ovaj eksperiment odobrilo je povjerenstvo za medicinsku etiku Prve pridružene bolnice Medicinskog sveučilišta Xinjiang (broj odobrenja 20170214-71), a od pacijenata i njihovih obitelji dobiven je informirani pristanak.

3. Grupiranje ćelija: nasumično podijeljeno u praznu skupinu; Skupina modela: 5 |ug / L TGF - & 1; Pozitivna kontrola: 5|ug / L TGF PI + 250 mg / L 5-fluorouracil (5-FU); Eksperimentalna skupina: 5|ug / L TGF PL + (60 mg / L, 90 mg / L >, 120 mg / L) cphgso.

4. Proliferacija stanica određena je kompletom za brojanje stanica (CCK-8): uzeti su hsfbs u logaritamskoj fazi rasta, stanice iz svake skupine tretirane su kao dizajnirane, a vrijednost upijanja svake bušotine svake skupine praćena je sekvencijalno na valnoj duljini od 450 nm pomoću čitača mikroploča u 24, 48 i 72 sata.

5. Otkrivanje mRNA izraza rt qPCR-om: prikupljeni su hsfbs iz svake skupine nakon 48 sati intervencije, izvađena je RNA i određena je količina mRNA izraza.

6. Ekspresija proteina određena je zapadnjačkom analizom mrlja. Ukupni stanični protein ekstrahiran je 48 sati nakon tretmana iz svake skupine kako bi se otkrila ekspresija svakog proteina.

7. Statističke metode: statistički softver SPSS 22.0 korišten je za analizu, a podaci mjerenja izraženi su kao srednja ± standardne devijacije (srednja ± SD), a jednosmjerna analiza varijance korištena je za usporedbu između više skupina, a P< 0.05="" was="" considered="" statistically="">

Rezultati

Rezultati proliferacije stanica pokazali su da je 60, 90 i 120 mg / L cphgs tijekom 48 sati na fibroblastima, stopa inhibicije bila [(36,87 ±0,06)%: (43,52 ±0,04)% :(78,11 ±0,03)% ,F = 45,073,P< 0.01="" ],90="" mg/l="" cphgs.="" 24h-28h="" was="" [(26.29="" ±0.04)%="" :(43.52="" ±0.04)%="" :(64.11="" 土="" 0.03)%,f=""><0.01]. it="" indicated="" that="" the="" inhibition="" rate="" of="" cphgs="" on="" hsfbs="" was="" gradually="" elevated="" with="" time="" extension="" and="" increasing="" concentration,="" showing="" a="" proportional="">

Usporedba coL-I, COL-3, Smad2 i Smad3 mRNA izraza u svakoj skupini: u usporedbi s grupom modela, i pozitivne kontrolne i eksperimentalne skupine mogle bi smanjiti transformirajući faktor rasta β - inducirani CoL-I, COL-3, Smad2 i Smad3 mRNA ekspresija, te promicati ekspresiju Smad7 mRNA, sa statistički značajnim razlikama. (1.56 ±0.01:0. 30 ± 0.25 : 0.21 ±0.04,F = 39. 755,P<0.01； 1.66="" ±0.="" 22="" :="" 0.="" 27="" ±0.04="" :="" 0.="" 55="" ±0.="" 04.f="61." 991="" ,p=""><0. 01；="" 1.="" 06="" ±="" 0.15="" 比="" 0.="" 78="" ±="" 0.="" 76="" 比="" 0.="" 55="" ±="" 0.="" 03,="" f="17.769" ,p=""><0.01 ；2.05="" ±="" 0.29="" :="" 0.55="" ±="" 0.10="" :="" 0.46±="" 0.08,f=""><0.01 ；0.04="" ±0.04="" :="" 0.11="" ±0.02="" :="" 1.77±0.="" 59,f="14."><0.>

Usporedba p-Smad2, p-smad3, col-l, COL-3 u svakoj skupini: u usporedbi s praznom skupinom povećala se ekspresija proteina p-Smad2, col-l u skupini modela, dok se Smad7 smanjila; U usporedbi s grupom modela, pozitivna kontrolna skupina mogla bi smanjiti ekspresiju proteina p-smad3, COL-1, COL-3, a eksperimentalna skupina pokazala je inhibitorni učinak na povišenu ekspresiju proteina p-Smad2, p-smad3, col - 3. Ekspresija COL-3 inhibirana je u različitim stupnjevima, dok je ekspresija Smad7 relativno povećana u dvije skupine, a vrijednosti ekspresije proteina p-Smad2, p-smad3, Smad7, col-l, COL-3 u praznoj skupini, pozitivnoj kontrolnoj skupini i eksperimentalnoj skupini bile su (0,09 ±0,04,04,16 ±0,03,0,11 ± 0,02,06 ± 0,00),(0,07 ±0,03,03,12 ± 0,02,07 ± 0,01,0. 04 ±0. 01,F = 7. 670, P<0. 05),="" (0.="" 22="" ±0.05、="" 0.12="" ±0.03,0.15="" ±0.06,0.23="" ±="" 0.05,="" f="3.936,">< 0.05),(0.19="" ±0.02,0.27="" ±="" 0.02,0.08="" ±0.01,0.05="" ±="" 0.04,f=""><0.01)、(0.21 ±0.04.0.="" 33="" ±0.02、="" 0.16="" ±0.02,0.17="" ±0.01,f=""><>

Diskusija

HS je neizbježan ishod popravka tkiva, a njegov mehanizam pojave uglavnom FBS hiperproliferacija, nedovoljna degradacija i tako dalje dovode do stvaranja i razvoja HS-a. Tgf-p1 je široko uključen u stanične, abnormalne proliferacije tkiva i bolesti diferencijacije i nastavlja se tijekom zacjeljivanja rana; Svoje učinke djeluje uglavnom signalnim putem tgf-p / Smads, u kojem fosforilacija proteina Smad2 / 3 dovodi do povećane ekspresije unutarstaničnih i izvanstaničnih fibro geničnih proteina, potiče proizvodnju kolagena i ubrzava napredovanje fibroze; Smad7, kao negativni regulator, može spriječiti ovaj put kroz interakciju s aktiviranim tgf-p1 receptorima, čime se smanjuje sinteza kolagenskih vlakana; Dakle, ili povećanje ekspresije Smad7 ili inhibiranje izraza Smad2 / 3 može spriječiti razvoj hipertrofičnih ožiljaka.

Ova studija primijenila je Cistanche cphgs na HS, kožnu fibrotičku bolest, i otkrila da različite doze cphgs inhibiraju proliferaciju hsfbs induciranih tgf-p1; Štoviše, 90m & / L cphgs inhibirao je signalizaciju puta promicanjem ekspresije Smad7 i smanjenjem ekspresije Smad2 / 3 na razinama ekspresije gena i proteina, te smanjenom proizvodnjom CoL-I, COL-3, što je zauzvrat inhibiralo napredovanje HS-a. Naši rezultati potvrdili su da su cphgs inhibirali proizvodnju kolagena intervenirajući u ekspresiji proteina povezanih s tgf-p / Smads signalnim putem pod tgf-p1 stimulacijom. Rezultati ove studije pokazali su da cistanche cphgs inhibiraju proliferaciju i učinkovito smanjuju izlučivanje kolagena hipertrofičnih fibroblasta ožiljaka kroz signalni put tgf-p / Smads.