Ehinakozid usporava staničnu senescenciju ljudskih fibroblastičkih stanica MRC-5

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Aktivni sastojak Cistanchea: Kako se ehinakozid protiv starenja?

Hong Xie 1, Hui Zhu1,2, Cong Cheng1, Yu Liang1, Zhao Wang1

U ovoj studiji istraženi su učinci ehinakozida, jednog od feniletanoida izoliranih iz stabljika Cistanches salse, kineske tradicionalne biljne medicine, na fibroblastične MRC-5 stanice pluća ljudskog embrija. Aktivnost proliferacije stanica procijenjena je s AlamarOm Blueom, pokazujući da liječenje ehinakozidom može usporiti senescenciju. Rezultati protočne citometrije pokazuju da bi ehinakozid mogao potaknuti stanice u G1 fazi da uđu u S fazu i G2 fazu, te bi mogao poboljšati degradaciju ROS-a. Rezultati testa kometa pokazuju da bi ehinakozid mogao zaštititi stanice od oštećenja DNA, djelomično razjašnjavajući mehanizam njegovih učinaka. Svi gore navedeni rezultati sugeriraju da ehinakozid ima potencijalnu aktivnost protiv senescencije.

Cistanche deserticola ima mnogo učinaka, kliknite ovdje da biste saznali više

1. Uvod

Normalne stanice kultivirane in vitro razmnožavaju se za ograničen broj udvostručenja populacije ("granica hayflicka") i ulaze u fazu replikativne senescencije. Senescentne stanice prolaze kroz zaustavljanje rasta stanica u fazi G1 i promjenu morfologije i metabolizma, uključujući povećanje stanica, povećanu biogenezu lizosoma i ekspresiju aktivnosti više -galaktozidaze pri pH 6 (senescencija povezana -galaktozaidaza, SA- - -Gal) (Hayflflick i Moorhead 1961; Dimri 1995). Nakupljanje senescentnih stanica prognosticira pad povezan s dobitkivo/orguljefunkcije. Kako bi se pristupilo načinu odgađanja ili preokretanja starenja, napori za otkrivanje aktivnih tvari protiv starenja nikada nisu prestali.Ehinakozidje jedan od feniletanoida izoliranih iz stabljikaCistanches salsa, kineska tradicionalna biljna medicina, koja ima potencijalne biološke aktivnosti, kako kao antiserum, tako iantifatigaagent (Deng et al. 2004; Xiong et al. 1996). Također je prijavljeno da se ponaša in vitro kao moćanslobodanradikalanSmetlar(Facino i dr. 1995.) i eksponatineuroprotektivnoaktivnostiin vitro i in vivo (Koo et al. 2005; Geng et al. 2007). Echinacoside može biti kandidat za tvar protiv starenja, a aktivnost protiv starenja može biti jedno od njegovih bioloških svojstava. Tako smo tretirali senescentnu liniju fibroblastičnih stanica ljudskog embrija MRC-5 s ehinakozidom, očekujući da bi mogla usporiti ili preokrenuti senescenciju.

2. Istrage i rezultati

Prvo, dodali smo ehinakozid u medij kulture kako bismo provjerili njegov utjecaj na rast stanica i stanične cikluse. Primijećeno je da se održivost stanica s izlaganjem od 48 h ehinakozidu očito povećala u odnosu na kontrolu, jer se koncentracija povećala (slika 1A), što ukazuje na to da je ehinakozid pomogao senescentnim stanicama da se proliferiraju. Rezultat SA-Gal bojenja pokazao je da se razina SA--Gal očito smanjila nakon tretmana ehinakozida (podaci nisu prikazani), što upućuje na to da je dio senescentnih stanica obrnut od senescencije. Kako bi se potvrdilo jesu li senescentne stanice doista pogurane da se razmnožavaju ehinakozidom, uvedena je druga citometrija kako bi se provjerila promjena faze staničnog ciklusa senescentnih MRC-5 stanica nakon liječenja ehinakozidom. U našoj studiji, primijetili smo da se s povećanjem koncentracije Ehinakozida omjer stanica u G1 razdoblju postupno smanjivao. Naprotiv, više stanica je potaknuto da uđu u S fazu i G2 fazu (slika 1B). Akumulacija žarišta heterokromatina povezanih sa senescencijom (SAHF) još je jedan specifičan biomarker senescentnih stanica (Shay i Wright 2001). Senescentne stanice prikazale su isprekidana žarišta DNA koja su vizualizirana Hoechstovim bojanjem (Sl. 1C). Nasuprot tome, činilo se da MRC-5 stanice tretirane ehinakozidom imaju manje SAHF-a.

Razina reaktivnih vrsta kisika (ROS) povećava se kako se stanice približavaju granici Hayflflicka (Hutter et al. 2002). Kontinuirano liječenje stanica s subsmrtonosnim razinama ROS-a ne samo da povećava razinu oksidativnih proizvoda oštećenja kao što je lipofuscin (Sitte i sur. 2001), već također uzrokuje trajno zaustavljanje rasta praćeno aktivacijom p53-rastu inhibitornog puta (Toussaint i sur. 2000). Stoga, na staničnoj razini, ROS igra ključnu ulogu u izazivanju senescencije. FL fluorescentna boja DCFH-DA korištena je za mjerenje sadržaja ROS-a s drugom citometrijom. Pokazano je da je u usporedbi s kontrolom sadržaj ROS-a značajno smanjen u stanicama inkubiranim ehinakozidom (slika 2A). Ovi rezultati ukazuju na to daehinakozidmože djelovati kao antioksidant, smanjujući proizvodnju ROS-a ili ubrzavajući uklanjanje ROS-a.

Akumulirane reaktivne vrste kisika (ROS) uzrokuju izvanredno oštećenje makromolekula u stanicama, uključujući proteine, DNK i telomere (Kovtun i sur. 2007). Oksidativna oštećenja DNA pokreću uhićenje rasta G1 ovisnog o p53, nakon izraza p21Waf-1/SDI-1/Cip1 (Chen i sur. 1998) i senescencije stanica kod normalnih fibroblasta ljudi. Koristili smo test kometa da izmjerimo oštećenje DNA i njegov popravak. Veličina fragmenata DNA i broj prekida određuju migraciju i uzorak viđenog kometa. Sadržaj DNA repa (proizvod duljine repa i sadržaja DNA repa) povećava se s oštećenjem. Naši rezultati pokazuju da predobrada ehinakozidom može djelomično potaknuti popravak oštećenja DNA, barem zaštititi stanice od DNA lezija uzrokovanih H2O2 (Slika 2B). Na temelju tih činjenica zaključujemo da ehinakozid ima aktivnost protiv senescencije barem u stanicama MRC-5. Rezultati naše studije pokazuju da ehinakozid može smanjiti nakupljanje ROS-a, zaštititi stanice od oštećenja DNA, promicati MRC-5 stanice iz G1 faze u S i G2 fazu i tako poboljšati proliferaciju stanica. Općenito govoreći, učinci ehinakozida na MRC-5 stanice mogli bi se podijeliti u dva aspekta: promicati proliferaciju stanica i smanjiti nakupljanje ROS-a. Iako je precizan mehanizam senescencije stanica još uvijek nepoznat, a regulacija mrežnog staničnog ciklusa ostaje kontroverzna, pokazali smo da ehinakozid može zaštititi stanice od oksidativnih oštećenja. Stoga nagađamo daehinakozidmogao bi biti dobar kandidat za reguliranje senescencije, iako je precizan temeljni mehanizam i dalje otvoreno pitanje i daljnje studije su u tijeku.

3. Eksperimentalni

3.1. Kultura stanica i liječenje

Linija fibroblastičnih stanica ljudskog embrija MRC-5 (Institut za biokemiju i staničnu biologiju, SIBS, CAS) održavana je u modificiranom minimalnom esencijalnom mediju (Gibco/BRL) i dopunjena 10% fetalnim goveđim serumom. MRC-5 stanice prolaze replikativnu senescenciju nakon više staničnih prolaza, procijenjenih usporavanjem metabolizma i prestankom podjele u roku od 7 dana. Sve kulture bile su zasijane gustoćom stanica od 104/cm2, osim ako nije drugačije navedeno i dopušteno im je da se razmnožavaju, neometano, tijekom 7 dana. Različite koncentracije ehinakozida dodane su 48 sati prije pregleda s otapalom kao kontrolom, osim ako nije drugačije navedeno. Koncentracija DMSO-a u kulturama bila je manja od 0,3% (v/v). Za liječenje H2O2 stanice su inducirane s 250M H2O2 za 12 h.

3.2. Analiza stope preživljavanja

Stanice su kultivirane i tretirane ehinakozidom na 96 ploča bušotina. Prije detekcije, 10% Alamar BlueTM dodan je u medij i inkubirano za 4 sata. Apsorbancija je mjerena spektrofotometrom.

3.3. Analiza protočne citometrije

Protočna citometrija uvedena je kako bi se izmjerio sadržaj DNA i unutarstanična razina ROS pomoću propidijevog jodida i DCFH-DA. Stanice su bile obložene gustoćom od 105 stanica / 10 ml stanične otopine u posudama promjera 100 mm i dopunjene ehinakozidom 48 h nakon zasijavanja stanica. Nakon tretmana od 48 h, stanice su ubrane i oprane u PBS-u nakon centrifugacije, zatim ponovno potrošene u PBS otopini s 0,1% RNase i 50 g/ ml propidium jodida ili medija kulture koji sadrži 10 M DCFH-DA tijekom 30 minuta. Podatke je analizirao softver MultiCycle.

3.4. Hoechst bojenje

Stanice su kultivirane i tretirane ehinakozidom 48 sati na ploči bušotine od 96. Medij je uklonjen, Stanice su oprane PBS-om, zatim fiksirane s 4% formaldehida u PBS-u 20 minuta, nakon čega je jednom slijedilo pranje PBS-om i obojeno Hoechst bojom 10 minuta. Slike su snimljene.

3.5. Elektroforeza jednostaničnog gela (test kometa)

Test kometa proveden je kako je prijavljeno (Olive i Banath 2006). Pojedinačne slike kometa analizirane su pomoću cometScore softvera. Priznanje: Ovaj rad financijski su poduprli Kineski nacionalni osnovni istraživački program (projekt 973) (br. 2007CB507406), Nacionalna zaklada za prirodne znanosti Kine (br. 30572341) i Fond za medicinske znanosti Tsinghua-Yue-Yuen (THYY20070008).